CN105670973A - 一种甲基营养型芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用 - Google Patents

一种甲基营养型芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用,该菌为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)JQ-018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2015年12月7日，保藏登记号为CGMCCNo.11838，其经种子活化、种子培养、发酵培养后可制得菌剂；本发明进一步提供了所述甲基营养型芽孢杆菌的菌剂制备方法，以及在制备防治马铃薯早疫病药物中的应用。该菌剂具有很高的生物活性，环境相容性好，能够调节植物微生物生态区系，对人畜无毒害，使用方便。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌、菌剂、菌剂制备方法和菌剂的应用。
背景技术
马铃薯早疫病是一种对马铃薯危害比较严重的病害，凡种植马铃薯的地区都有发生，严重影响马铃薯的产量。马铃薯早疫病主要由链格孢属茄链格孢引起，主要发生在叶片上，也可侵染块茎。马铃薯叶上病斑产生的孢子，可由风、雨、昆虫等分散传播，侵染四周的健康植株。叶面湿润时，降落在叶片上的孢子萌发，由气孔和伤口侵入，几天后就形成新的病斑，病斑上又产生孢子，分散传播。在一个生长季节里，可以反复发生多次侵染，以致造成全田发病。降雨也有利于孢子形成，雨后2～3天，空中飞散的孢子数量明显增多，孢子传播高峰期后10～20天，田间发病数量急剧增多。发病严重的叶片干枯脱落，田间一片枯黄，造成严重的经济损失。
目前对于该病主要是通过在发病初期及时喷施杀菌剂进行防治。所用药剂主要有75％百菌清可湿性粉剂600倍液或64％杀毒矾可湿性粉剂500倍液、80％喷克可湿性粉剂800倍液、80％大生M-45可湿性粉剂600倍液、70％代森锰锌可湿性粉剂500倍液、80％新万生可湿性粉剂600倍液、1:1:200倍式波尔多液、77％可杀得可湿性微粒粉剂500倍液。长期使用化学杀菌剂，导致病菌抗药性增强，只有加大用药剂量以及缩短喷药时间间隔来控制病害，不仅增加了生产成本也导致农药残留量越来越多大。马铃薯块茎膨大需要疏松肥沃的土壤，大量使用化学药剂，容易造成土壤污染，土壤的酸碱失调，养分含量降低，土壤板结，严重影响作物的产量。因此采用生物防治来控制马铃薯早疫病是农业发展的必然趋势。而采用拮抗微生物防治病害是代替化学药剂的一种安全、无毒、有效的新方法。拮抗微生物不仅可以抑制病原菌的生长，还能增大土壤中微生物的数量，促进植物生长，对改善生态***，保持生物多样性，维护生态平衡有着重要的作用。
经文献检索，尚未见有利用甲基营养型芽孢杆菌制备生物菌剂并应用于大田防治马铃薯早疫病的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的甲基营养型芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供一种以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂及制备方法。
本发明还有一目的在于提供利用以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂在制备防治植物病害药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种甲基营养型芽孢杆菌，其特征在于：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)JQ-018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间：2015年12月7日，保藏登记号为CGMCCNo.11838。
本发明的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018从河北省张北县大囫囵村马铃薯根基土壤中分离、纯化以及筛选步骤获得的，采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。
以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂，由甲基营养型芽孢杆菌JQ-018为菌种，经种子活化、种子培养、发酵培养得到的菌剂；包括液体菌剂和固体菌剂。
以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，具体步骤如下：
a菌种活化：将低温保存的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株接种于固体培养基上，于35-38℃培养34-38h；挑取单菌落转接到斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；
b一级种子液制备：按照5-10％的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液；
c二级种子液制备：按照0.5-3％的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h，作为二级种子液；
所述种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1-2％、蛋白胨1-1.5％、酵母粉0.6-1％、牛肉膏0.5-0.7％、氯化钠0.5％，其余为水；
d发酵培养：按照5-10％的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为24-30h，得到发酵液；
所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖3-5％、蛋白胨0.5-1.5％、酵母粉0.03-0.08％、蛋白胨0.1-0.3％、豆粕粉0.5-1.5％、硫酸镁0.01-0.05％、硫酸锰0.01-0.05％，其余为水；
e将上述发酵液进行80-160目过滤，得到甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂。
f将上述发酵液喷雾干燥：进口温度150-200℃，出口温度50-90℃，加入喷雾载体可溶性淀粉。得到甲基营养型芽孢杆菌粉剂。
g将以下原料按重量百分比混合均匀：甲基营养型芽孢杆菌粉剂10-30％,白炭黑10-30％,硅藻土：10-30％,十二烷基磺酸钠1-10％,萘磺酸盐D-1002：2-10％,膨润土10-30％，润湿剂W-2001：2-10％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。
进一步的，本发明还提供以上三种甲基营养型芽孢杆菌菌剂在制备防治马铃薯早疫病药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明甲基营养型芽孢杆菌安全、无毒,由其制得的液体菌剂具有发酵生产周期短、成本低的特点，利于工业化生产，适用于作物灌根处理，因其生产及使用时一直处于液体状态，所以菌的活性保持在较高状态；制成粉剂，特别是制备成可湿性粉剂后可以延长保藏周期，喷洒后菌剂能够定植在作物表面，占领病原菌生态位，抑制病原菌生长，对病原菌抑制率达到85％以上，方便使用，并能促进作物生长，增加作物产量，维护生态平衡。
菌种保藏
保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；保藏时间：2015年12月7日；保藏登记号为CGMCCNo.11838。
附图说明
图1是本发明的甲基营养型芽孢杆菌的16SrDNA同源序列比对分析树状图。
具体实施方式
以下结合具体实施列进一步说明：
实施例一：甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株的分离与筛选：
1、分离
(1)土壤采集：从河北省张北县大囫囵村马铃薯田里土壤表层到10cm处采集土样100g，一个地点平行采集5个样本，混合过40目分级筛。取100g筛下土壤用做分离。
(2)培养基配制：分别配制
NA培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3.0g/L、氯化钠5g/L、琼脂18g/LpH＝7.0-7.2；
和PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL；
制作培养基平板。
(3)准确称取1g土壤置于250ml三角瓶中，加入99ml无菌水，摇床200rpm、37℃震荡30min。制成土壤悬浮液，按10倍梯度稀释至10-8。分别在NA培养基和PDA培养基中分离单菌落，分离到的单菌落分别在NA培养基和PDA培养基中活化4个周期。
2、筛选
将分离活化的单菌落及其它菌种单菌落与马铃薯早疫病病原菌进行平板对峙实验，以下是筛选过程对峙实验及其结果：
在PDA培养基平板中央接入预先培养的病原菌(马铃薯早疫病)，待生长大小合适时用直径9mm的打孔器打出菌斑，移至新的PDA培养基平板中央，在距离病原菌菌斑2cm处接种菌种，每个处理重复3次，置于25℃生化培养箱培养，观察各菌落直径，测定抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％
表1JQ-018及其它菌株菌落直径(cm)
菌株名称 平行处理1 平行处理2 平行处理3 平均
JQ-011 0.5 0.5 0.6 0.53
JQ-012 0.0 0.0 0.0 0.0
JQ-013 0.4 0.3 0.2 0.3
JQ-014 0.6 0.6 0.6 0.6
JQ-015 0.7 0.8 0.6 0.7
JQ-016 0.0 0.0 0.0 0.0
JQ-017 0.3 0.3 0.3 0.3
JQ-018 0.9 0.9 1.0 0.933 -->
JQ-019 0.7 0.7 0.6 0.6
JQ-020 0.1 0.2 0.1 0.13
从表1可看出JQ-018菌株对马铃薯早疫病的抑菌活性最高。继续做JQ-018菌株的拮抗实验得到如下结果，见表2。
表2JQ-018菌株对马铃薯早疫病室内抑菌活性测定
实施例二：甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株的鉴定：
1、微生物学特性：JQ-018菌体呈短杆状，周生鞭毛，可产孢，革兰氏染色阳性。菌株在PDA培养基上34℃培养12h后，菌落圆形，半透明呈白色，表面光滑，中间凸起，不产生色素，有粘性。在NA培养基上菌落较小或者不生长。液体培养形成菌膜，24h后产孢，棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现好氧生长。
2、生理生化实验：
表3甲基营养型芽孢杆菌JQ-018的生理生化特征
检测项目 特性 检测项目 特性 检测项目 特性
D-果糖 + 水杨苷 - 甘露醇 +
麦芽糖 + 吐温40 - L-苹果酸 +
D-半乳糖 + 果糖-6-磷酸 - 丙酮酸 +
D-葡萄糖 + 鼠李糖 - 天冬酰胺 +
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应
3、分子生物学鉴定：
JQ-018菌株测序后得到1414bp长的碱基序列，将该序列在NCBI数据库中比对，与Bacillusmethylotrophicus同源性达到99.38％，结合JQ-018菌株的形态特征、生理生化特性，确定所检测的JQ-018菌株属于甲基营养型芽孢杆菌，以16SrDNA序列为基础的JQ-018菌株的***发育树如图1所示(图中菌株3即为JQ-018菌株)。
实施例三：甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂的制备
(1)菌种活化：将低温保存的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株接种于LB固体培养基上，于36℃培养36h；挑取单菌落转接到LB斜面培养基上，于36℃培养20h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。
(2)一级种子液制备：按照10％(体积百分比)的接种量向LB种子培养基中接入步骤(1)制备的接种液，转速250rpm，温度36℃，摇床培养20h，作为一级种子液。
(3)二级种子液制备：按照3％(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤(2)制备的一级种子液，通气量为1.0vvm，搅拌速度为220rpm，培养时间为20h。作为二级种子液。
所述种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.5％、牛肉膏0.6％、氯化钠0.5％，其余为水。
(4)发酵培养：按照10％(体积百分比)的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的二级种子液，通气量为1.0vvm，搅拌速度为220rpm，培养时间为28h，得到发酵液。
所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖5％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.05％、蛋白胨0.2％、豆粕粉1.0％、硫酸镁0.03％、硫酸锰0.03％，其余为水。
(5)将上述发酵液进行100目过滤，得到活菌数为1000亿/毫升以上的甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂。
实施例四：甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂的制备
将实施例三所得到的发酵液进行喷雾干燥：进口温度180℃，出口温度80℃，加入喷雾载体可溶性淀粉。所得菌剂有效活菌数为1000亿/克以上。
实施例五：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂的制备一
将以下原料按重量百分比混合均匀：实施例四所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂30％、白炭黑30％、硅藻土10％、十二烷基磺酸钠10％、萘磺酸盐D-1002：2％、膨润土10％、润湿剂W-2001：8％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到400亿/克的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。
实施例六：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂的制备二
将以下原料按重量百分比混合均匀：实施例四所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂20％、白炭黑29％、硅藻土10％、十二烷基磺酸钠1％、萘磺酸盐D-1002：10％、膨润土20％、润湿剂W-2001：10％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到300亿/克的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。
实施例七：甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂的制备三
将以下原料按重量百分比混合均匀：实施例四所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂10％、白炭黑10％、硅藻土：30％、十二烷基磺酸钠10％、萘磺酸盐D-1002：8％、膨润土30％、润湿剂W-2001：2％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到200亿/克的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。
实施例八：甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂的应用
8.1供试药剂
本发明制备的甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂
8.2供试作物与防治对象
供试作物为马铃薯，防治对象：马铃薯早疫病8.3试验地情况
试验地设在河北省张北县大囫囵村，海拔1600-1800米，土壤为沙质土壤，有机质1.15％-1.35％。
8.4试验设计及安排
本试验以10亿/毫升甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂为原液，在此基础上稀释100倍、500倍、1000倍液进行灌根处理，以清水处理作为对照，共设4个处理，重复4次，共16个小区，每小区面积5m2，各小区随机排列。于马铃薯早疫病发病前灌根，每隔7天处理1次，连续处理3次。
8.5试验调查及计算方法
末次处理后7天调查病情指数并计算防效。每个小区随机选取5点取样，每点调查3株，每株调查全部叶片，以每片叶上的病斑面积占整个叶面积的百分率来分级。病害分级标准如下：0级：无病斑；1级：单叶片有病斑3个；3级：单叶片有病斑4-6个；5级：单叶片有病斑7-10个；7级：单叶片有病斑10个以上，部分密集成片；9级：单叶片病斑密集，叶片发黄枯萎。
8.6结果
表410亿/毫升甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂防治马铃薯早疫病田间试验结果
处理组 平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
清水对照 40.17 -
液体菌剂稀释100倍 13.12 67.3
液体菌剂稀释500倍 11.83 70.6
液体菌剂稀释1000倍 15.34 61.8
表4结果显示，10亿/毫升甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂稀释不同倍液后灌根处理对马铃薯早疫病有较好的防治效果，其中10亿/毫升甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂稀释500倍液防治效果最好，防治效果达到了70.6％。
8.7小结
从马铃薯病害指数和防治效果来看，10亿/毫升甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂稀释不同倍液后灌根处理对马铃薯早疫病有较好的防治效果，稀释500倍液处理效果最佳，防治效果可以达到70.6％，病害指数明显小于对照处理。
实施例九：甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂的应用
9.1供试药剂
本发明制备的甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂
9.2供试作物与防治对象
供试作物为马铃薯，防治对象：马铃薯早疫病9.3试验地情况
试验地设在河北省张北县大囫囵村，海拔1600-1800米，土壤为沙质土壤，有机质1.15％-1.35％。
9.4试验设计及安排
本试验设计了300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种马铃薯种块0.5kg、1kg、2kg及空白对照共4个处理，重复4次，共16个小区，每小区面积5m2，各小区随机排列。马铃薯生长期常规管理。
9.5试验调查及计算方法
播种后统计各处理发芽率。发病期调查病情指数并计算防效，每个小区随机选取5点取样，每点调查3株，每株调查全部叶片，以每片叶上的病斑面积占整个叶面积的百分率来分级。病害分级标准如下：0级：无病斑；1级：单叶片有病斑3个；3级：单叶片有病斑4-6个；5级：单叶片有病斑7-10个；7级：单叶片有病斑10个以上，部分密集成片；9级：单叶片病斑密集，叶片发黄枯萎。
9.6结果
表5300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂拌种防治马铃薯早疫病田间试验结果
处理组 发芽率(％) 平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
空白对照 93 43.75 -
粉剂菌剂50g拌种0.5kg 95 20.68 52.7
菌粉剂菌剂50g拌种1kg 98 21.15 51.7
菌粉剂菌剂50g拌种2kg 96 24.73 43.5
表5结果显示，300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂拌种处理发芽率均要高于空白对照处理，其中300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种1kg马铃薯种块发芽率最高，达到98％；且300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂拌种处理对马铃薯早疫病有较好的防治效果，其中300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种0.5kg马铃薯种块防治效果最好，达到了52.7％。综上，结合发芽率和防治效果两个指标，用300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种1kg马铃薯种块效果较好。
9.7小结
从马铃薯发芽率来看，300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂拌种处理发芽率均要高于空白对照处理，其中300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种1kg马铃薯种块发芽率最高，达到98％。
从马铃薯病害指数和防治效果来看，300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂拌种处理对马铃薯早疫病有较好的防治效果，其中300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种0.5kg马铃薯种块效果最好，防治效果可以达到52.7％，病害指数明显小于对照处理。
综上，结合发芽率和防治效果两个指标，用300亿/克甲基营养型芽孢杆菌粉剂菌剂50g拌种1kg马铃薯种块效果较好。
实施例十：甲基营养型芽孢杆菌JQ-018可湿性菌剂的应用
10.1供试药剂
本发明制备的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株可湿性粉剂
10.2供试作物与防治对象
供试作物为马铃薯，防治对象：马铃薯早疫病
10.3试验地情况
试验地设在河北省张北县大囫囵村，海拔1600-1800米，土壤为沙质土壤，有机质1.15％-1.35％。
10.4试验设计及安排
本试验设计了200亿/克甲基营养型芽孢杆菌(JQ-018菌株)可湿性粉剂50克/亩、100克/亩、150克/亩及空白对照(清水处理)共4个处理，重复4次，共16个小区，每小区面积10m2，各小区随机排列。于马铃薯早疫病发病前喷施，每隔7天施药1次，连续施药3次。
10.5试验调查及计算方法
末次施药后7天调查病情指数并计算防效。每个小区随机选取5点取样，每点调查3株，每株调查全部叶片，以每片叶上的病斑面积占整个叶面积的百分率来分级。病害分级标准如下：0级：无病斑；1级：单叶片有病斑3个；3级：单叶片有病斑4-6个；5级：单叶片有病斑7-10个；7级：单叶片有病斑10个以上，部分密集成片；9级：单叶片病斑密集，叶片发黄枯萎。
10.6结果
表6200亿/克甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治马铃薯早疫病田间试验结果
处理组 平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
清水对照 39.43 -
可湿性粉剂50克/亩 12.17 69.1
可湿性粉剂100克/亩 8.62 78.1
可湿性粉剂150克/亩 5.19 86.8
表6结果显示，200亿/克甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯早疫病有较好的防治效果，其中200亿/克甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂150克/亩防治效果最好，防治效果达到了86.8％。
10.7小结
从马铃薯病害指数和防治效果来看，200亿/克甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯早疫病有较好的防治效果，每亩施用150克效果最佳，防治效果可以达到86.8％，病害指数明显小于对照处理。

Claims (9)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌，其特征在于：甲基营养型芽孢杆菌JQ-018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间：2015年12月7日，保藏登记号为CGMCCNo.11838。
2.一种以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂，其特征在于：以权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018为菌种，经种子活化、种子培养、发酵培养得到的菌剂。
3.如权利要求2所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂，其特征在于：所述菌剂包括液体菌剂和固体菌剂。
4.一种权利要求2所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，具体包括：
a.菌种活化：将低温保存的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株接种于固体培养基上，于35-38℃培养34-38h；挑取单菌落转接到斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；
b.一级种子液制备：按照5-10％的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液；
c.二级种子液制备：按照0.5-3％的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h，作为二级种子液；
d.发酵培养：按照5-10％的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为24-30h，得到甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株发酵液；
e.将上述发酵液进行过滤，得到所述甲基营养型芽孢杆菌液体菌剂。
5.如权利要求4所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤b和步骤c中的种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1-2％、蛋白胨1-1.5％、酵母粉0.6-1％、牛肉膏0.5-0.7％、氯化钠0.5％，其余为水。
6.如权利要求4所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤d中的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖3-5％、蛋白胨0.5-1.5％、酵母粉0.03-0.08％、蛋白胨0.1-0.3％、豆粕粉0.5-1.5％、硫酸镁0.01-0.05％、硫酸锰0.01-0.05％，其余为水。
7.如权利要求4所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于：将步骤d所述发酵液进行喷雾干燥，进口温度150-200℃，出口温度50-90℃，加入喷雾载体可溶性淀粉，得到甲基营养型芽孢杆菌粉剂。
8.如权利要求7所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于：按照重量百分比，将原料：甲基营养型芽孢杆菌粉剂10-30％、白炭黑10-30％、硅藻土10-30％、十二烷基磺酸钠1-10％、萘磺酸盐D-10022-10％、膨润土10-30％和润湿剂W-20012-10％混合均匀，然后粉碎至400目以上，得到甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
9.如权利要求2所述的以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂在制备防治马铃薯早疫病药物中的应用。
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