CN105660607A - 完全不动***的生育力保存方法 - Google Patents
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- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
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Abstract
本发明公开了一种完全不动***的生育力保存方法,由以下步骤构成:①完全不动***冷冻方法:收集完全不动***后,取小部分出来,用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存,若无存活***,则废弃;②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估:如果激光射击后,***尾部立即出现明显的卷尾现象,则判定为存活***,对激光射击无反应不发生卷尾的为死***;本发明首次证明完全不运动***是可以冷冻保存的,冷冻后这些***具有正常的体外受精能力;同时,建立了高效冷冻保存这部分特殊群体生育力的方法,用激光筛选存活但完全不动的冷冻***进行卵胞浆内单***注射后能获得与新鲜不动***相似的受精率。国内外均未见相关的报道。
Description
技术领域
本发明涉及一种***生育力保存的方法,尤其是一种完全不动***的生育力保存方法。
背景技术
目前,***冷冻保存技术已有200多年的历史。人的***冷冻保存可以追溯到20世纪40年代末。***冷冻保存在我国主要应用于人类***库以及生育能力的保存。国内外研究者通过几十年对***冷冻程序、冷冻稀释液、解冻液等的筛选,已经建立了较为成熟的***冷冻保存体系。全国各生殖中心对人***冷冻保护剂的需求量比较大,而市场上人***冷冻保存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断,国内只有部分科研院所自行配置畜禽***冷冻保护剂。国内还没有自行开发的人类***冷冻保护剂应用于临床,并且现有的商品化的人类***冷冻保存***适合于人的正常***,对少弱精的保存效果并不理想。
***冷冻是保存男性生育力最有效的方法,已成为人类辅助生殖技术(ART)中必不可少的技术。许多研究表明,来源于射出、附睾穿刺(PESA)和睾丸穿刺(TESA)的***经冷冻保存及卵胞浆内单***注射(ICSI)后能获得与新鲜***相似的临床结局。传统的观点认为,***冷冻保存的前提需要有运动的***。但是,对于完全不运动的***是否有冷冻保存价值尚不清楚。
ICSI技术是目前治疗严重男性不育的理想手段。有报道,应用不运动***行ICSI后可获得临床妊娠并生下健康后代,然而,其受精率、胚胎发育潜能明显低于活动***。进一步研究证实,不运动***并不表明其已经死亡,其存活的***仍具有正常的受精能力。这提示,ICSI的基础是需要有存活的***。那么,如何快速、准确、高效及安全地鉴别完全不动***中的存活状态以确定是否适合冷冻保存及解冻后如何选择存活***进行受精是关键。WHO第5版《人类***检查与处理操作手册》中推荐低渗肿胀试验和伊红染色用于诊断性评估***的活力。然而,这两种方法存在不足之处,前者操作较繁琐且不适用于冷冻-解冻的***,后者经染色后即使鉴定为存活***也无法再用于受精。进一步研究发现,应用激光照***子尾膜时,存活的***产生突然的应急反应,***尾部卷曲,而死***无这种现象,并且其应用在新鲜和冻融后的完全不动***均有相似的现象。进一步研究证明,激光照***子尾部对***头部DNA并无损伤,并且***尾部在受精过程中没有实质的意义。这提示,激光可能是一种安全有效地鉴别不动***存活状态的有效方法。
传统的观点认为,只有运动的***适合冷冻保存。然而,有些不育患者***的活动率极低,甚至所有的***都完全不运动,多见于***原纤毛不动症和睾丸手术取精的患者。对于前者,临床上常规的处理是丢弃射出的完全不动***,择期改行睾丸穿刺取精尝试寻找活动***。对于后者,如果穿刺出来的是完全不动***也极有可能被废弃,择期再行睾丸穿刺术。重复穿刺势必增加了患者远期并发症发生的机会和经济负担,因此,如何有效地保存这些患者生育力是值得深思的问题。
常规的***冷冻方法使用2ml的冷冻管,***与冷冻液按1∶1比例稀释后经液氮熏蒸后再投入液氮冷冻保存。由于冷冻过程中细胞内冰晶形成等因素会导致一定程度的***损伤,采用目前传统的冷冻方法冻存稀少***复苏率及回收率较低,复苏后***细胞膜损伤严重,导致无法用于后续的辅助生殖治疗。也有一些报道利用人类和小鼠的空透明带冷冻稀少***,但人卵透明带较难获得,且可能存在污染的问题,难以推广应用。冷冻环也有被应用于稀少***冷冻,但***加载难度较大。临床上,往往有些患者获取的***活力甚微,甚至完全不动。因此,需迫切寻求一种稳定、高效的冷冻完全不动***症患者生育力的方法。
理论基础:
***膜完整性与***代谢、顶体反应、***获能及精卵融合密切相关。此外,***膜功能完整性还与受精卵着床、胚胎植入密切相关。***尾部细胞膜属于半透膜,具有自动调节膜内外渗透压平衡的能力。激光具有热效应,当低能量激光射击活动***尾部时,由于局部温度升高很可能发生蛋白质变性而导致***尾部细胞膜的流动性、通透性改变。当激光照***子尾膜时,热效应使***尾膜内外的渗透压不平衡,活***的细胞膜处于完整的状态,具备调节细胞膜内外渗透压平衡的能力,水分子可由膜外进入膜内;而死***尾膜的通透性发生改变,丧失调节膜内外渗透压的能力,水分子无法进入膜内。激光的这一特性为胚胎学家从完全不动***中鉴别有活力***用于ICSI提供了新思路。
人类***在冷冻过程中需经过与冷冻保护剂混合、冷冻预降温、超低温储存以及解冻复温等过程。这期间经历的理化效应直接作用于***影响***的复苏率。影响***冷冻和复苏的主要原因:一是细胞内冰晶的形成,二是溶质性损伤。-5℃~-80℃是细胞内冰晶形成的危险温区,冰晶的形成损伤***细胞膜和细胞器,甚至导致细胞死亡。细胞外结冰可导致细胞内外呈高渗状态而导致细胞损伤,即溶质性损伤。在冷冻过程中,液体可以形成晶体和玻璃体两种状态。液体在冷冻过程中究竟以何种状态固化,主要由其本身的性质以及冷冻过程中的降温速率决定。玻璃化冷冻中,由于冷冻液体积较小,所以降温十分迅速。在急速冷却过程中,液体的粘度增加,当粘度达到临界值时即发生凝固化,形成不规则的玻璃样固体,呈透明状态,有效避免细胞内外冰晶的形成。要实现玻璃化降温必须要迅速,这就要求冷冻液的体积要尽可能的小,并且冷冻载体的导热性能要好。因此,只需微量冷冻液的玻璃化冷冻方法可以最大限度地减少***冷冻-解冻过程中的冷冻损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种完全不动***的生育力保存方法。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
这种完全不动***的生育力保存方法,由以下步骤构成:
①完全不动***冷冻方法:
收集完全不动***后,取小部分出来,用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存,若无存活***,则废弃;将剩余***吸至100~200μL(微升),放入专用微量***冷冻管内,直接用低转速的离心机离心;离心后去除上清液,然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液,混匀,使最终悬液的总体积为10μL;将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面2-3cm处,熏蒸3~5min,然后直接投入液氮中冷冻保存;解冻时,直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中,放置10min;最后将***悬液吸出,放置于培养皿中,加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射;
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估:
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中,在视野下选择形态较好的***,在***尾部靠近尾巴尖端处,用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段,照射时间为2ms(毫秒),如果激光射击后,***尾部立即出现明显的卷尾现象,则判定为存活***,对激光射击无反应不发生卷尾的为死***;冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率,以冷冻后的存活指数,来评价完全不活动***的冷冻效果;
对完全不动***的微量冷冻,其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL;
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
有益效果:
本发明首次证明完全不运动***是可以冷冻保存的,冷冻后这些***具有正常的体外受精能力;同时,建立了高效冷冻保存这部分特殊群体生育力的方法,这为完全不动***症患者生育力保存提供新视野。
应用本发明所述的方法,收集射出和睾丸穿刺获取的完全不动***经冷冻复苏后仍获得较高的存活率,总体的***存活指数为0.83。用激光筛选存活但完全不动的冷冻***进行卵胞浆内单***注射后能获得与新鲜不动***相似的受精率。国内外均未见相关的报道。
具体实施方式
实施例1:
这种完全不动***的生育力保存方法,由以下步骤构成:
①完全不动***冷冻方法:
收集完全不动***后,取小部分出来,用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存,若无存活***,则废弃;将剩余***吸至100μL(微升),放入专用微量***冷冻管内,直接用低转速的离心机离心;离心后去除上清液,然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液,混匀,使最终悬液的总体积为10μL;将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面2cm处,熏蒸3min,然后直接投入液氮中冷冻保存;解冻时,直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中,放置10min;最后将***悬液吸出,放置于培养皿中,加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射;
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估:
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中,在视野下选择形态较好的***,在***尾部靠近尾巴尖端处,用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段,照射时间为2ms(毫秒),如果激光射击后,***尾部立即出现明显的卷尾现象,则判定为存活***,对激光射击无反应不发生卷尾的为死***;冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率,以冷冻后的存活指数,来评价完全不活动***的冷冻效果;
对完全不动***的微量冷冻,其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL;
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
实施例2:
这种完全不动***的生育力保存方法,由以下步骤构成:
①完全不动***冷冻方法:
收集完全不动***后,取小部分出来,用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存,若无存活***,则废弃;将剩余***吸至200μL(微升),放入专用微量***冷冻管内,直接用低转速的离心机离心;离心后去除上清液,然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液,混匀,使最终悬液的总体积为10μL;将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面3cm处,熏蒸5min,然后直接投入液氮中冷冻保存;解冻时,直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中,放置10min;最后将***悬液吸出,放置于培养皿中,加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射;
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估:
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中,在视野下选择形态较好的***,在***尾部靠近尾巴尖端处,用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段,照射时间为2ms(毫秒),如果激光射击后,***尾部立即出现明显的卷尾现象,则判定为存活***,对激光射击无反应不发生卷尾的为死***;冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率,以冷冻后的存活指数,来评价完全不活动***的冷冻效果;
对完全不动***的微量冷冻,其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL;
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
临床验证:
前期,我们对9例睾丸穿刺取精且无运动***的患者,用激光鉴别不动但存活***用于ICSI,有6例患者获得了临床妊娠(妊娠率66.67%),其中有1例已经出生了健康的小孩。证实了激光选择存活但不动***的有效性。随后,我们对4例完全不动***的患者(1例射出***,3例睾丸穿刺取精)经知情同意后,留取少量的***悬液进行微量冷冻保存。
***悬液分成两份:一份用于计数冷冻前***的存活率,另一份用于微量冷冻。
这4例患者***冷冻前平均存活率为50.98%,解冻后平均存活率为42.36%,总的***存活指数为0.83(该值为解冻后平均***存活率/冷冻前平均***存活率)。为了验证冷冻解冻***的受精能力,我们采用激光法选择卷尾的***(即存活的***)对受精失败的MII卵子进行ICSI验证。经患者知情同意并自愿捐赠,共获得61枚未受精的MII卵,其中,34枚用于新鲜不动***,27枚用于冷冻不动***。新鲜组正常受精胚胎24枚,受精率为70.59%;冷冻组19枚正常受精,受精率为70.37%;两组的受精率相比差异无统计学意义。
综上所述,应用本发明所述的方法,收集射出和睾丸穿刺获取的完全不动***经冷冻复苏后仍获得较高的存活率,总体的***存活指数为0.83。用激光筛选存活但完全不动的冷冻***进行卵胞浆内单***注射后能获得与新鲜不动***相似的受精率。我们首次证明完全不运动***是可以冷冻保存,并具有正常的体外受精能力,这为完全不动***症患者生育力保存提供新视野。国内外均未见相关的报道。
Claims (2)
1.一种完全不动***的生育力保存方法,其特征是:由以下步骤构成:
①完全不动***冷冻方法:
收集完全不动***后,取小部分出来,用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存,若无存活***,则废弃;将剩余***吸至100~200μL(微升),放入专用微量***冷冻管内,直接用低转速的离心机离心;离心后去除上清液,然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液,混匀,使最终悬液的总体积为10μL;将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面2-3cm处,熏蒸3~5min,然后直接投入液氮中冷冻保存;解冻时,直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中,放置10min;最后将***悬液吸出,放置于培养皿中,加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射;
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估:
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中,在视野下选择形态较好的***,在***尾部靠近尾巴尖端处,用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段,照射时间为2ms(毫秒),如果激光射击后,***尾部立即出现明显的卷尾现象,则判定为存活***,对激光射击无反应不发生卷尾的为死***;冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率,以冷冻后的存活指数,来评价完全不活动***的冷冻效果;
对完全不动***的微量冷冻,其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL;
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种完全不动***的生育力保存方法,其特征在于:所述的存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
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CN201610157472.7A CN105660607A (zh) | 2016-03-18 | 2016-03-18 | 完全不动***的生育力保存方法 |
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Cited By (1)
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CN108935445A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-07 | 贵州医科大学附属医院 | 一种基于icsi显微操作的冻精方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN203290151U (zh) * | 2013-01-21 | 2013-11-20 | 郜鸿生物科技(上海)有限公司 | 一种稀少***新型封闭式冷冻超细管载体 |
CN104823966A (zh) * | 2015-05-19 | 2015-08-12 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种微量***冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法 |
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- 2016-03-18 CN CN201610157472.7A patent/CN105660607A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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陈焕华等: "应用激光从完全不动***中筛选存活***行ICSI后获临床妊娠:附2例报告", 《中华男科学杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108935445A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-07 | 贵州医科大学附属医院 | 一种基于icsi显微操作的冻精方法 |
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