CN105660607A - 完全不动***的生育力保存方法 - Google Patents

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CN105660607A CN201610157472.7A CN201610157472A CN105660607A CN 105660607 A CN105660607 A CN 105660607A CN 201610157472 A CN201610157472 A CN 201610157472A CN 105660607 A CN105660607 A CN 105660607A
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冯贵雪
陈焕华
张波
周红
汪彩珠
舒金辉
林若芸
甘贤优
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

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Abstract

本发明公开了一种完全不动***的生育力保存方法，由以下步骤构成：①完全不动***冷冻方法：收集完全不动***后，取小部分出来，用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存，若无存活***，则废弃；②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估：如果激光射击后，***尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活***，对激光射击无反应不发生卷尾的为死***；本发明首次证明完全不运动***是可以冷冻保存的，冷冻后这些***具有正常的体外受精能力；同时，建立了高效冷冻保存这部分特殊群体生育力的方法，用激光筛选存活但完全不动的冷冻***进行卵胞浆内单***注射后能获得与新鲜不动***相似的受精率。国内外均未见相关的报道。

Description

完全不动***的生育力保存方法
技术领域
本发明涉及一种***生育力保存的方法，尤其是一种完全不动***的生育力保存方法。
背景技术
目前，***冷冻保存技术已有200多年的历史。人的***冷冻保存可以追溯到20世纪40年代末。***冷冻保存在我国主要应用于人类***库以及生育能力的保存。国内外研究者通过几十年对***冷冻程序、冷冻稀释液、解冻液等的筛选，已经建立了较为成熟的***冷冻保存体系。全国各生殖中心对人***冷冻保护剂的需求量比较大，而市场上人***冷冻保存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断，国内只有部分科研院所自行配置畜禽***冷冻保护剂。国内还没有自行开发的人类***冷冻保护剂应用于临床，并且现有的商品化的人类***冷冻保存***适合于人的正常***，对少弱精的保存效果并不理想。
***冷冻是保存男性生育力最有效的方法，已成为人类辅助生殖技术(ART)中必不可少的技术。许多研究表明，来源于射出、附睾穿刺(PESA)和睾丸穿刺(TESA)的***经冷冻保存及卵胞浆内单***注射(ICSI)后能获得与新鲜***相似的临床结局。传统的观点认为，***冷冻保存的前提需要有运动的***。但是，对于完全不运动的***是否有冷冻保存价值尚不清楚。
ICSI技术是目前治疗严重男性不育的理想手段。有报道，应用不运动***行ICSI后可获得临床妊娠并生下健康后代，然而，其受精率、胚胎发育潜能明显低于活动***。进一步研究证实，不运动***并不表明其已经死亡，其存活的***仍具有正常的受精能力。这提示，ICSI的基础是需要有存活的***。那么，如何快速、准确、高效及安全地鉴别完全不动***中的存活状态以确定是否适合冷冻保存及解冻后如何选择存活***进行受精是关键。WHO第5版《人类***检查与处理操作手册》中推荐低渗肿胀试验和伊红染色用于诊断性评估***的活力。然而，这两种方法存在不足之处，前者操作较繁琐且不适用于冷冻-解冻的***，后者经染色后即使鉴定为存活***也无法再用于受精。进一步研究发现，应用激光照***子尾膜时，存活的***产生突然的应急反应，***尾部卷曲，而死***无这种现象，并且其应用在新鲜和冻融后的完全不动***均有相似的现象。进一步研究证明，激光照***子尾部对***头部DNA并无损伤，并且***尾部在受精过程中没有实质的意义。这提示，激光可能是一种安全有效地鉴别不动***存活状态的有效方法。
传统的观点认为，只有运动的***适合冷冻保存。然而，有些不育患者***的活动率极低，甚至所有的***都完全不运动，多见于***原纤毛不动症和睾丸手术取精的患者。对于前者，临床上常规的处理是丢弃射出的完全不动***，择期改行睾丸穿刺取精尝试寻找活动***。对于后者，如果穿刺出来的是完全不动***也极有可能被废弃，择期再行睾丸穿刺术。重复穿刺势必增加了患者远期并发症发生的机会和经济负担，因此，如何有效地保存这些患者生育力是值得深思的问题。
常规的***冷冻方法使用2ml的冷冻管，***与冷冻液按1∶1比例稀释后经液氮熏蒸后再投入液氮冷冻保存。由于冷冻过程中细胞内冰晶形成等因素会导致一定程度的***损伤，采用目前传统的冷冻方法冻存稀少***复苏率及回收率较低，复苏后***细胞膜损伤严重，导致无法用于后续的辅助生殖治疗。也有一些报道利用人类和小鼠的空透明带冷冻稀少***，但人卵透明带较难获得，且可能存在污染的问题，难以推广应用。冷冻环也有被应用于稀少***冷冻，但***加载难度较大。临床上，往往有些患者获取的***活力甚微，甚至完全不动。因此，需迫切寻求一种稳定、高效的冷冻完全不动***症患者生育力的方法。
理论基础：
***膜完整性与***代谢、顶体反应、***获能及精卵融合密切相关。此外，***膜功能完整性还与受精卵着床、胚胎植入密切相关。***尾部细胞膜属于半透膜，具有自动调节膜内外渗透压平衡的能力。激光具有热效应，当低能量激光射击活动***尾部时，由于局部温度升高很可能发生蛋白质变性而导致***尾部细胞膜的流动性、通透性改变。当激光照***子尾膜时，热效应使***尾膜内外的渗透压不平衡，活***的细胞膜处于完整的状态，具备调节细胞膜内外渗透压平衡的能力，水分子可由膜外进入膜内；而死***尾膜的通透性发生改变，丧失调节膜内外渗透压的能力，水分子无法进入膜内。激光的这一特性为胚胎学家从完全不动***中鉴别有活力***用于ICSI提供了新思路。
人类***在冷冻过程中需经过与冷冻保护剂混合、冷冻预降温、超低温储存以及解冻复温等过程。这期间经历的理化效应直接作用于***影响***的复苏率。影响***冷冻和复苏的主要原因：一是细胞内冰晶的形成，二是溶质性损伤。-5℃～-80℃是细胞内冰晶形成的危险温区，冰晶的形成损伤***细胞膜和细胞器，甚至导致细胞死亡。细胞外结冰可导致细胞内外呈高渗状态而导致细胞损伤，即溶质性损伤。在冷冻过程中，液体可以形成晶体和玻璃体两种状态。液体在冷冻过程中究竟以何种状态固化，主要由其本身的性质以及冷冻过程中的降温速率决定。玻璃化冷冻中，由于冷冻液体积较小，所以降温十分迅速。在急速冷却过程中，液体的粘度增加，当粘度达到临界值时即发生凝固化，形成不规则的玻璃样固体，呈透明状态，有效避免细胞内外冰晶的形成。要实现玻璃化降温必须要迅速，这就要求冷冻液的体积要尽可能的小，并且冷冻载体的导热性能要好。因此，只需微量冷冻液的玻璃化冷冻方法可以最大限度地减少***冷冻-解冻过程中的冷冻损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种完全不动***的生育力保存方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
这种完全不动***的生育力保存方法，由以下步骤构成：
①完全不动***冷冻方法：
收集完全不动***后，取小部分出来，用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存，若无存活***，则废弃；将剩余***吸至100～200μL(微升)，放入专用微量***冷冻管内，直接用低转速的离心机离心；离心后去除上清液，然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液，混匀，使最终悬液的总体积为10μL；将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面2-3cm处，熏蒸3～5min，然后直接投入液氮中冷冻保存；解冻时，直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中，放置10min；最后将***悬液吸出，放置于培养皿中，加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射；
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估：
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中，在视野下选择形态较好的***，在***尾部靠近尾巴尖端处，用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段，照射时间为2ms(毫秒)，如果激光射击后，***尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活***，对激光射击无反应不发生卷尾的为死***；冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率，以冷冻后的存活指数，来评价完全不活动***的冷冻效果；
对完全不动***的微量冷冻，其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL；
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
有益效果：
本发明首次证明完全不运动***是可以冷冻保存的，冷冻后这些***具有正常的体外受精能力；同时，建立了高效冷冻保存这部分特殊群体生育力的方法，这为完全不动***症患者生育力保存提供新视野。
应用本发明所述的方法，收集射出和睾丸穿刺获取的完全不动***经冷冻复苏后仍获得较高的存活率，总体的***存活指数为0.83。用激光筛选存活但完全不动的冷冻***进行卵胞浆内单***注射后能获得与新鲜不动***相似的受精率。国内外均未见相关的报道。
具体实施方式
实施例1：
这种完全不动***的生育力保存方法，由以下步骤构成：
①完全不动***冷冻方法：
收集完全不动***后，取小部分出来，用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存，若无存活***，则废弃；将剩余***吸至100μL(微升)，放入专用微量***冷冻管内，直接用低转速的离心机离心；离心后去除上清液，然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液，混匀，使最终悬液的总体积为10μL；将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面2cm处，熏蒸3min，然后直接投入液氮中冷冻保存；解冻时，直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中，放置10min；最后将***悬液吸出，放置于培养皿中，加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射；
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估：
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中，在视野下选择形态较好的***，在***尾部靠近尾巴尖端处，用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段，照射时间为2ms(毫秒)，如果激光射击后，***尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活***，对激光射击无反应不发生卷尾的为死***；冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率，以冷冻后的存活指数，来评价完全不活动***的冷冻效果；
对完全不动***的微量冷冻，其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL；
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
实施例2：
这种完全不动***的生育力保存方法，由以下步骤构成：
①完全不动***冷冻方法：
收集完全不动***后，取小部分出来，用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存，若无存活***，则废弃；将剩余***吸至200μL(微升)，放入专用微量***冷冻管内，直接用低转速的离心机离心；离心后去除上清液，然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液，混匀，使最终悬液的总体积为10μL；将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面3cm处，熏蒸5min，然后直接投入液氮中冷冻保存；解冻时，直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中，放置10min；最后将***悬液吸出，放置于培养皿中，加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射；
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估：
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中，在视野下选择形态较好的***，在***尾部靠近尾巴尖端处，用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段，照射时间为2ms(毫秒)，如果激光射击后，***尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活***，对激光射击无反应不发生卷尾的为死***；冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率，以冷冻后的存活指数，来评价完全不活动***的冷冻效果；
对完全不动***的微量冷冻，其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL；
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
临床验证：
前期，我们对9例睾丸穿刺取精且无运动***的患者，用激光鉴别不动但存活***用于ICSI，有6例患者获得了临床妊娠(妊娠率66.67％)，其中有1例已经出生了健康的小孩。证实了激光选择存活但不动***的有效性。随后，我们对4例完全不动***的患者(1例射出***，3例睾丸穿刺取精)经知情同意后，留取少量的***悬液进行微量冷冻保存。
***悬液分成两份：一份用于计数冷冻前***的存活率，另一份用于微量冷冻。
这4例患者***冷冻前平均存活率为50.98％，解冻后平均存活率为42.36％，总的***存活指数为0.83(该值为解冻后平均***存活率/冷冻前平均***存活率)。为了验证冷冻解冻***的受精能力，我们采用激光法选择卷尾的***(即存活的***)对受精失败的MII卵子进行ICSI验证。经患者知情同意并自愿捐赠，共获得61枚未受精的MII卵，其中，34枚用于新鲜不动***，27枚用于冷冻不动***。新鲜组正常受精胚胎24枚，受精率为70.59％；冷冻组19枚正常受精，受精率为70.37％；两组的受精率相比差异无统计学意义。
综上所述，应用本发明所述的方法，收集射出和睾丸穿刺获取的完全不动***经冷冻复苏后仍获得较高的存活率，总体的***存活指数为0.83。用激光筛选存活但完全不动的冷冻***进行卵胞浆内单***注射后能获得与新鲜不动***相似的受精率。我们首次证明完全不运动***是可以冷冻保存，并具有正常的体外受精能力，这为完全不动***症患者生育力保存提供新视野。国内外均未见相关的报道。

Claims (2)

1.一种完全不动***的生育力保存方法，其特征是：由以下步骤构成：
①完全不动***冷冻方法：
收集完全不动***后，取小部分出来，用激光鉴定如有存活的***即判为可冷冻保存，若无存活***，则废弃；将剩余***吸至100～200μL(微升)，放入专用微量***冷冻管内，直接用低转速的离心机离心；离心后去除上清液，然后再加入与***沉淀1∶1体积的***冷冻液，混匀，使最终悬液的总体积为10μL；将装有***悬液的冷冻管置于距液氮面2-3cm处，熏蒸3～5min，然后直接投入液氮中冷冻保存；解冻时，直接将冷冻管投入到预热好的37℃的水浴中，放置10min；最后将***悬液吸出，放置于培养皿中，加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单***注射；
②完全不动***冷冻前、后***存活状态的评估：
将获取的不动***加入到Quinn’s-1020即受***操作皿中，在视野下选择形态较好的***，在***尾部靠近尾巴尖端处，用1.48μm(微米)的二极管激光束照***子尾部中下段，照射时间为2ms(毫秒)，如果激光射击后，***尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活***，对激光射击无反应不发生卷尾的为死***；冷冻前和复苏后分别计算不动***的存活率，以冷冻后的存活指数，来评价完全不活动***的冷冻效果；
对完全不动***的微量冷冻，其最终***冷冻悬液的总体积仅为10μL；
上述的对完全不动***冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种完全不动***的生育力保存方法，其特征在于：所述的存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的***存活率。
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