CN105658802A

CN105658802A - 尸胺的纯化

Info

Publication number: CN105658802A
Application number: CN201380075176.7A
Authority: CN
Inventors: 刘修才; 刘驰; 戴端芳; 秦兵兵; 李乃强
Original assignee: Shanghai Cathay Biotechnology Research and Development Center Co Ltd; Cathay Industrial Biotech Ltd
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2013-01-28
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2016-06-08
Also published as: WO2014113999A1; EP2948557B1; EP2948557A1; US20150368184A1; EP2948557A4; US9546127B2

Abstract

本发明一方面涉及降低尸胺盐水性组合物中盐含量的方法，其包括调节尸胺盐水性组合物的pH，以得到含有尸胺水性组合物和固体组合物的第一组合物，其中尸胺水性组合物的pH为至少约12；并从所述第一组合物中移除所述固体组合物，以得到所述尸胺水性组合物。本发明另一方面涉及使用本文中所述的除盐方法从尸胺盐水性组合物中纯化尸胺的方法；以及从尸胺水性组合物中获得尸胺。

Description

尸胺的纯化

技术领域

本发明涉及从尸胺盐组合物纯化尸胺的方法。更具体而言，本发明涉及从尸胺的生物基制备物纯化生物基尸胺的方法。

背景技术

生物基尸胺是在部分或全部生物基产品(例如部分或全部生物基尼龙56和尼龙510)的制备中所使用的重要平台化合物(platformchemical)。生物基尸胺可以通过赖氨酸在微生物中的赖氨酸脱羧来合成。然而，现有的纯化方法制备得到含有不期望的污染的生物基尸胺，或在纯化方法中需要有毒的有机溶剂。

因此，需要得到不使用有机溶剂而制备高品质生物基尸胺的生物基尸胺纯化方法。

发明概述

本发明的一个方面涉及降低尸胺盐水性组合物中盐含量的方法，其包括：

a)调节所述尸胺盐水性组合物的pH，以得到含有尸胺水性组合物和固体组合物的第一组合物，其中所述尸胺水性组合物的pH为至少约12；以及

b)从步骤a)中的所述第一组合物中移除所述固体组合物，以得到所述尸胺水性组合物。

本发明的另一方面涉及从尸胺盐水性组合物中纯化尸胺的方法，其包括：

a)调节所述尸胺盐水性组合物的pH，以得到含有尸胺水性组合物和固体组合物的第一组合物，其中所述尸胺水性组合物的pH为至少约12；

b)从步骤a)中的所述第一组合物中移除所述固体组合物，以得到所述尸胺水性组合物；以及

c)通过蒸发或蒸馏所述尸胺水性组合物来得到尸胺。

本发明的另一方面涉及在生物基尸胺的制备中降低盐含量的方法，其包括：

a-1)提供含有尸胺制备组合物的尸胺盐水性组合物，其中所述尸胺制备组合物由生物基尸胺制备方法得到；

本发明的另一方面涉及制备纯化的生物基尸胺的方法，其包括：

c)通过蒸发或蒸馏所述尸胺水性组合物来得到纯化的生物基尸胺。

附图说明

图1：显示根据本文中公开的方法的实施方案的流程图。

图2：在5℃(系列1)、18℃(系列2)和65℃(系列3)下尸胺组合物(水性)中硫酸钠的溶解度曲线。

图3：在24℃(系列1)下尸胺组合物(水性)中氯化钠的溶解度曲线。

发明详述

生物基尸胺制备物可以通过发酵方法或者赖氨酸的酶促转化(例如图1的模块I中所示)来制备。如本文中所使用，“生物基”化合物意指在标准ASTMD6866下，所述化合物被认为是生物基的。在发酵方法中，将制备赖氨酸并表达赖氨酸脱羧酶(LDC)的微生物进行发酵来制备尸胺。在赖氨酸的酶促转化中，通过LDC催化，赖氨酸/赖氨酸盐可被转化为尸胺(例如图1的模块I-2；以及实施例3)。在一个实施方案中，通过将表达赖氨酸脱羧酶(LDC)的微生物进行发酵来制备LDC(例如图1的模块I-1；以及实施例2)。尸胺具有相对低的沸点，相对易于蒸发/蒸馏。然而，在LDC的期望有效(working)pH下，尸胺被质子化，并形成一种或多种难以被蒸馏的尸胺盐。因此，在一个实施方案中，将一种或多种碱加入到尸胺盐水性组合物中，以将尸胺盐转化为尸胺(例如图1的模块II-1)。所获得的组合物包含尸胺水性组合物和固体组合物。所述尸胺水性组合物包含尸胺和其他水溶性组分(例如一种或多种无机盐)。水性组合物的最终pH为约12或更高，使得质子化的尸胺基本上被转化为尸胺。所述固体组合物包含一种或多种无机盐。所述无机盐是非挥发性的，并且可显著影响尸胺从尸胺水性组合物中的蒸发/蒸馏，特别是在蒸发/蒸馏期间水被移除时。如本文中所使用，蒸发/蒸馏组合物是在蒸发/蒸馏期间被加热的组合物。在本文中描述的方法中，将固体组合物从尸胺水性组合物移除(例如图1的模块II-2)可将大量无机盐从蒸发/蒸馏组合物中移除，以通过蒸发/蒸馏更好地回收尸胺(例如图1的模块II-3)。

c)通过蒸发或蒸馏所述尸胺水性组合物来得到尸胺。

a-1)提供含有尸胺制备组合物的尸胺盐水性组合物，其中所述尸胺制备组合物通过生物基尸胺制备方法得到；

I)尸胺盐水性组合物

尸胺盐水性组合物包含尸胺盐和/或完全或部分质子化的尸胺。在一个实施方案中，所述尸胺盐水性组合物的pH不高于约12、不高于约11、不高于约10或更低、不高于约9，或为约7至约8。在另一实施方案中，所述尸胺盐由尸胺和一种或多种选自有机酸、无机酸及其任意组合的酸形成。无机酸的实例包括但不限于盐酸、硫酸、碳酸和磷酸。有机酸的实例包括但不限于己二酸和乙酸。在另一实施方案中，所述尸胺盐水性组合物包含酸阴离子。酸阴离子的实例包括但不限于Cl^-、SO₄ ^2-、^-OOC(CH₂)₃COO^-、CH₃COO^-、CO₃ ^2-、PO₄ ^3-及其任意组合。如本文中所使用，尸胺盐酸盐为尸胺单盐酸盐、尸胺双盐酸盐及其混合物。

在另一实施方案中，所述尸胺盐水性组合物包含由生物基尸胺制备方法获得的尸胺制备组合物。

生物基尸胺制备方法的实例包括但不限于发酵制备和体外酶促制备。在某些实施方案中，所述由生物基尸胺制备获得的尸胺制备组合物的pH不高于约12、不高于约11、不高于约10或更低、不高于约9，或为约7至约8，其中所述尸胺制备组合物中的大部分尸胺以盐的形式存在。

a)生物基尸胺的酶促制备

在一个实施方案中，所述尸胺盐水性组合物包含由酶促生物基尸胺制备方法获得的尸胺制备组合物。酶促生物基尸胺制备方法包括在赖氨酸脱羧酶(LDC)的存在下将赖氨酸和/或赖氨酸盐(赖氨酸/赖氨酸盐)转化成尸胺。在一个实例中，所述制备在水介质中进行。

i)赖氨酸/赖氨酸盐

赖氨酸盐是由赖氨酸和一种或多种选自无机酸、有机酸及其任意组合的酸形成的盐。在某些实施方案中，所述赖氨酸盐是一种或多种赖氨酸/无机酸盐。赖氨酸/无机酸盐的实例包括但不限于赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐及其任意组合。

赖氨酸/赖氨酸盐可以由任意合适的发酵制备法来制备，并且由此获得的赖氨酸发酵液可以用于生物基尸胺的酶促制备。在一个实施方案中，所述赖氨酸发酵液包含赖氨酸硫酸盐水溶液。在另一实施方案中，所述赖氨酸发酵液在用于酶促生物基尸胺制备之前，被进行进一步处理。例如，可进一步处理(例如通过过滤、离心或膜过滤)赖氨酸发酵液以移除杂质(如微生物)，并得到赖氨酸盐水溶液。在一实施例中，由赖氨酸发酵方法获得赖氨酸硫酸盐水溶液。将所述赖氨酸硫酸盐水溶液使用离子交换树脂进一步处理，其中将洗脱液用盐酸中和，以得到赖氨酸盐酸盐水溶液。在另一实施例中，将赖氨酸发酵液用活性炭脱色，并过滤以得到赖氨酸硫酸盐水溶液。

市售的赖氨酸/赖氨酸盐产品(例如赖氨酸盐酸盐)也可用于酶促生物基尸胺制备。在一个实施方案中，由发酵方法得到的赖氨酸发酵液用于酶促生物基尸胺制备。

在本文中可使用任何适于赖氨酸发酵的微生物。微生物的实例包括但不限于野生型菌株、诱变菌株和/或重组菌株。菌株的实例包括但不限于棒杆菌(Corynebacterium)菌株(如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)以及钝齿棒杆菌(C.crenatum))以及短杆菌(Brebvibacterium)菌株(如乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)和黄色短杆菌(B.flavum))。

赖氨酸发酵过程在培养基中进行。这样的培养基可以是适于发酵的任何培养基。例如，所述培养基可包含碳源和非碳营养源。碳源的实例包括但不限于糖(例如诸如葡萄糖和果糖的碳水化合物)、油和/或脂肪、脂肪酸和/或其衍生物。所述油和脂肪可含有饱和的和/或不饱和的具有10个或更多个碳原子的脂肪酸，如椰子油、棕榈油、棕榈仁油等。脂肪酸可以是饱和和/或不饱和脂肪酸，如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸等。脂肪酸的衍生物的实例包括但不限于酯及其盐。非碳源的实例包括但不限于氮源(如牛肉膏、酵母提取物和玉米浆)、无机盐以及其他有机营养源。

所述氮源的实例可以包括氨、铵盐(如氯化铵、硫酸铵和磷酸铵)、胰蛋白胨、肉膏、酵母提取物等。所述无机盐的实例包括但不限于磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。所述其他有机营养源的实例包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸)、维生素(如维生素B1、维生素B12和维生素C)等。培养基组成可根据菌株的种类和发酵的产物进行调整和优化。

发酵可在细胞可生长的任何温度下进行，并且优选在约20℃至约40℃或约35℃下进行。培养期可以是约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。

ii)LDC

LDC是可将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的酶。LDC可通过任何适合的发酵制备法来制备，并且由此获得的LDC发酵液可以直接用于生物基尸胺的酶促制备。在某些实施方案中，可将所述LDC发酵液在用于尸胺的酶促制备之前进一步处理。例如，可将LDC发酵液离心、过滤或者进行其他处理，或者进一步纯化以得到处理后或纯化后的LDC组合物。处理后/纯化后的LDC组合物的实例包括但不限于LDC发酵细胞和/或其碎片；由离心或过滤LDC发酵液获得的LDC上清液；由通过离心或过滤LDC发酵液来移除细胞获得的LDC上清液；纯化的LDC及其组合物；以及多于一种类型的LDC的任意组合。

本文中可使用任何适于进行LDC发酵的微生物。微生物的实例包括但不限于野生型菌株、诱变菌株和/或重组菌株。菌株的实例包括但不限于诱变大肠杆菌(Escherichiacoli)、诱变蜂房哈夫尼亚菌(Hafniaalvei)以及重组大肠杆菌和重组蜂房哈夫尼亚菌(如第201210177392.X号中国申请中公开的重组蜂房哈夫尼亚菌)。

LDC的发酵过程在培养基中进行。这样的培养基可以是适于发酵的任何培养基。例如，所述培养基可与赖氨酸发酵方法中所使用的培养基相同或相似，其包含前述的碳源和非碳营养源，并且对于LDC发酵进行优化。

iii)赖氨酸脱羧(LDCN)反应

本文中可使用任何适于由赖氨酸/赖氨酸盐得到生物基尸胺的酶促制备。在LDCN反应中，底物是如上所述的赖氨酸/赖氨酸盐，并且酶是如上所述的LDC。反应温度可为约20℃至约60℃。期望的反应pH是适于酶促转化的pH，并取决于在LDCN反应中所用的LDC。在某些实施方案中，适合的反应pH可为约5至约8。

在一个实施方案中，向LDCN反应中加入酸，以将反应的pH维持在合适的范围。在一个实施例中，在添加LDC之前在赖氨酸/赖氨酸盐溶液中加入酸，以将pH调节至适合的pH，然后添加LDC，以促进赖氨酸转化为尸胺。在另一实施例中，在将LDC与赖氨酸/赖氨酸盐溶液混合后加入酸。适合的酸的实例包括但不限于无机酸(如HCl、硫酸及其任意组合)和酸性气体(如CO₂)。

在另一实施方案中，在LDCN反应中使用缓冲液以将pH维持在合适的范围，以优化转化率。缓冲液的实例包括但不限于在LDC有效范围内使用的常见缓冲液，如7份0.2mol/L乙酸和3份0.2mol/L乙酸钠溶液。

在另一实施方案中，LDCN反应的起始pH和结束pH在适于酶促转化的pH范围内，并且向反应中可以添加或可以不添加另外的酸或其他物质用于pH控制。

在某些实施方案中，可分别将底物和酶以多次添加到反应中。可调节酶和/或底物的添加方式，以优化酶促转化的转化。

在某些实施方案中，将细胞固定化技术应用于LDC以改善反应收率。可使用任意适合的细胞固定化方法，例如包埋法(如海藻酸钙包埋法)。

在某些实施方案中，在LDCN反应混合物中可存在其他促进酶促转化的添加剂。这样的添加剂的实例包括但不限于无机盐和维生素。

II)调节尸胺盐水性组合物的pH以得到pH为至少约12的包含尸胺水溶液的第一组合物

尸胺盐水性组合物如上所述。在一个实施方案中，所述尸胺盐水性组合物的pH不高于约12、不高于约11、不高于约10或更低、不高于约9、或者为约7至约8。

在另一实施方案中，所述尸胺盐水性组合物包括由如上所述的LDCN反应获得的尸胺制备组合物。

尸胺水性组合物的pH取决于尸胺的浓度和温度(例如实施例5的表1)。

尸胺盐水性组合物的pH可通过向其中加入一种或多种无机碱来调节。尸胺盐与一种或多种无机碱反应以得到尸胺和相应的一种或多种无机盐。在某些实施方案中，所述一种或多种无机盐不能完全溶解在水溶液中，并从水溶液中以固体组合物的形式沉淀。因此，步骤a)得到的第一组合物中包含固体组合物和水溶液，其中所述固体组合物包含一种或多种无机盐，并且水溶液包含尸胺和一种或多种无机盐。

所述一种或多种无机碱的实例包括但不限于氢氧化物，如碱金属氢氧化物(如NaOH、KOH及其混合物)、碱土金属氢氧化物(如Mg(OH)₂、Ca(OH)₂及其混合物)及其碱性盐(如磷酸钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾及其混合物)。可将一种或多种碱基本同时或在不同的时间加入尸胺盐水性组合物中。当加入多种碱时，可将不同的碱作为一种或多种混合物加入，或者单独地加入。在某些实施方案中，碱混合物可以是一种或多种强碱和一种或多种弱碱的混合物。碱混合物的实例包括但不限于磷酸钠和氢氧化钠的混合物以及碳酸钠、氢氧化钠和氢氧化钾的混合物。在某些实施方案中，碱混合物可以是一种或多种强碱的混合物。碱混合物的实例包括但不限于氢氧化钠和氢氧化钾的混合物。

路线1阐述了反应的实例，其中尸胺盐为盐酸盐，并且碱为NaOH：[NH₃(CH₂)₅NH₃]Cl₂+2NaOH→NH₂(CH₂)₅NH₂+2NaCl+2H₂O

路线1

本领域普通技术人员会易于理解和领会其中由一种或多种特定的尸胺盐与一种或多种特定的碱的反应来制备尸胺与一种或多种无机盐的其他反应。一种或多种无机盐的实例包括但不限于硫酸钠、碳酸钠、NaCl、硫酸钾和KCl。

可将一种或多种碱以固体和/或溶液(如水溶液)的形式加入。

一种或多种碱加入的量取决于尸胺盐水性组合物中尸胺的量。当实质量的尸胺盐转化为尸胺时，一种或多种碱的量是适合的。在某些实施方案中，所得水溶液的pH不低于约12、不低于约13、不低于约13.3或不低于约13.5。

可在允许由尸胺盐生成尸胺的任意温度下将一种或多种碱加入尸胺盐水性组合物中和/或使一种或多种碱与尸胺盐水性组合物反应。一般而言，反应温度越高，反应进行越快。

在一个实施方案中，所述碱为氢氧化钠水溶液，所述尸胺盐水性组合物是尸胺硫酸盐水溶液，将碱在约60℃下加入，并且反应在碱(氢氧化钠)加入后几乎瞬间完成。

在另一实施方案中，本文中公开的方法还包括在第一温度下加入一种或多种碱，并任选地在第二温度下使反应物反应，持续约第一反应时间。所述第一温度和第二温度可以相同或者不同。所述第一温度和/或第二温度可为约10℃至约80℃、约40℃至约80℃、约10℃、约40℃、约60℃、约70℃或约80℃。所述第一反应时间为将尸胺盐的量基本上转化为尸胺所需的时间(即剩余的尸胺盐的浓度不高于约5％)。本领域普通技术人员会理解和领会如何确定第一反应时间。在某些实施方案中，所述第一反应时间为约0.01至约2小时。

如本文中所使用，除非另外说明，所有浓度为重量浓度(w/w)。

一般而言，水溶液中尸胺浓度越高，无机盐在其中的溶解度越低。(参见图1和图2，分别为NaCl和Na₂SO₄在不同尸胺浓度的尸胺水性组合物中的溶解度曲线)。

尽管任何浓度的尸胺盐水性组合物都可适用于本方法，在某些实施方案中，将固体组合物从尸胺水性组合物中移除，其中尸胺水性组合物的尸胺浓度为约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高或约30％或更高。在某些实施方案中，本文中公开的方法任选地还包括：

a-11)在加入一种或多种碱之前浓缩所述尸胺盐水性组合物；和/或任选地

a-12)在加入一种或多种碱之后浓缩所述尸胺盐水性组合物/碱反应液；和/或任选地

a-13)在加入一种或多种碱期间浓缩所述尸胺盐水性组合物/碱反应液；

使得步骤a)中的尸胺水性组合物的尸胺浓度为约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高或约30％或更高。

在一个实施方案中，所述尸胺盐水性组合物是由LDCN反应获得的尸胺硫酸盐溶液；所述碱为NaOH。由尸胺硫酸盐和NaOH的反应得到尸胺/Na₂SO₄混合物。当尸胺/Na₂SO₄混合物的水溶液的尸胺浓度为约17％或更高时，约80％或以上的Na₂SO₄从水溶液中沉淀。

III)从步骤a)中的所述第一组合物中移除所述固体组合物，以得到所述尸胺水性组合物

可将所述固体组合物通过任何适合固液分离的方法(例如离心和过滤)从步骤a)中的所述第一组合物中分离。

在某些实施方案中，与尸胺盐组合物的酸阴离子含量相比，由步骤b)获得的尸胺水性组合物的酸阴离子含量不高于约70％、不高于约50％或不高于约30％。

一般而言，溶液温度越低，无机盐在其中的溶解度越低。如图2所示，在约相同的尸胺浓度(如约20％)下，在较高温度(18℃)下硫酸钠的溶解度高于其在较低温度(5℃)下的溶解度。图2还显示当尸胺浓度相对高(如约30％或更高或者约40％或更高)时，即使在相对高的温度(如65℃)下，硫酸钠的溶解度也较低。

在某些实施方案中，本文中公开的方法任选地还包括：

a-21)在实施步骤b)之前，将所述第一组合物在第三温度下保持第二时间。

所述第三温度可为约2℃至约80℃、约2℃、约4℃、约5℃、约10℃、约15℃、约35℃、约38℃、约40℃、约50℃或约65℃。在某些实施方案中，所述第三温度不高于上述的第一温度和/或第二温度。在某些实施方案中，所述第三温度低于所述第二温度，以便于一种或多种无机盐从步骤a)中的水溶液沉淀。

在某些实施方案中，本文中公开的步骤b)包括：

b-1)过滤/离心所述第一组合物以得到固体和滤液/上清液；

b-2)用盐水溶液洗涤所述固体，并过滤/离心所得的混合物，以得到另外的固体和另外的滤液/上清液；

b-3)任选地重复步骤b-2)，直到获得的固体基本上不含有尸胺；以及

b-4)合并由步骤b-1)、b-2)和b-3)中获得的所述滤液/上清液，以得到所述尸胺水性组合物，以用于在步骤c)中进一步处理。

在某些实施方案中，在每次步骤b-2)的洗涤中所使用的盐水溶液可以相同或不同。这样的盐水溶液的实例包括但不限于饱和盐水溶液(例如NaCl饱和水溶液和硫酸钠饱和水溶液)。

在某些实施方案中，实施步骤b-1)和b-2)时的温度可以相同或不同，并且可以是上述的第三温度。

在一个实施方案中，所述尸胺盐水性组合物是尸胺硫酸盐，所述碱为NaOH，并且所述第一温度和第二温度是60℃。当第三温度是35℃时，在所得的水溶液中，尸胺浓度为约20％，并且SO₄ ^2-的浓度为约3％或更低。

在另一实施方案中，所述尸胺盐水性组合物是尸胺硫酸盐，所述碱为NaOH，所述第一温度和第二温度是10℃。在所得的水溶液中，所得反应物的水溶液的尸胺浓度为约10％。当第三温度是约2℃时，并且第二时间为约1小时时，SO₄ ^2-的浓度为约3.5％或更低。

在另一实施方案中，所述尸胺盐水性组合物是尸胺硫酸盐，所述碱为NaOH，所述第一温度和第二温度是80℃。第三温度是40℃，并且第二时间为约1小时。在所得的水溶液中，所得反应物的水溶液的尸胺浓度为约30％，并且SO₄ ^2-的浓度为约2％或更低。

IV)由尸胺水性组合物的蒸发/蒸馏得到尸胺

由步骤b)获得的尸胺水性组合物包含水、尸胺和杂质(例如一种或多种无机盐和其他有机材料)。

可将尸胺从尸胺水性组合物中通过任何适合的蒸发/蒸馏方法/设备来蒸发/蒸馏。实例包括但不限于多效蒸发器和分馏/精馏设备。

在某些实施方案中，将尸胺水性组合物蒸发/蒸馏两次或更多次以得到高纯度(例如至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.8％)的尸胺。各蒸发/蒸馏可在减压或者围压下进行，但优选减压。由第一次蒸发/蒸馏获得的第一馏出液包含尸胺和水。然后将第一馏出液(尸胺/水混合物)进一步蒸馏以得到更高纯度的尸胺。各蒸发/蒸馏处理可使用任何适合的方法/设备(如蒸发、多效蒸发和精馏)来完成。

在一个实施方案中，加热温度为约50℃至约250℃、约50℃至约80℃、约70℃至约185℃、约70℃至约120℃、约80℃至约120℃、约80℃至约180℃。蒸馏压力为约5kg或更低(表压)，为低于围压的压力(表压)，为约0.02MPa或更低(绝对压力)、约0.085MPa或更低(绝对压力)、约0.095MPa或更低(绝对压力)或约0.096MPa或更低(绝对压力)。

加热温度取决于蒸馏压力。在一个实施方案中，由将尸胺水性组合物在真空(-0.085MPa)下油浴(180℃)、真空(-0.096MPa)下油浴(135℃)、真空(-0.095MPa)下油浴(120℃)下加热来获得纯化的尸胺。

V)有益效果

本文中公开的方法在无有机溶剂萃取下，从尸胺盐水性组合物中移除大量无机盐。在尸胺蒸发/蒸馏组合物中降低盐含量得到更易于加热的蒸发/蒸馏组合物，这便于更加有效和高效的尸胺蒸发/蒸馏。

在某些实施方案中，本文中公开的方法显著提高尸胺回收率。在一个实施例(实施例10)中，使用本文中公开的方法(第一种方法)和第二种方法纯化尸胺盐水性组合物，所述第二种方法与第一种方法基本上相同，除了第二种方法不包括步骤b)的移除固体处理。两种方法使用基本上相似的蒸馏条件和蒸馏时间。第一种方法的尸胺回收率为约93.26％，显著高于第二种方法(约77.5％)。在另一实施例(如实施例4)中，将尸胺盐水性组合物转化为尸胺水性组合物，然后在尸胺蒸馏前用有机溶剂萃取尸胺水性组合物。在蒸发/蒸馏组合物中仍然残留大量杂质，这影响尸胺的蒸馏，并降低尸胺回收率(62.35％)。

在某些实施方案中，本文中公开的方法显著降低尸胺蒸发/蒸馏所需的蒸馏时间和/或蒸馏温度。

VI)实施例

下面的描述为全面理解所公开的实施方案提供了具体细节，并能够用于描述所公开的实施方案。然而，本领域技术人员会理解，在无这些细节下可实施所公开的内容。另一方面，没有对公知的结构和功能进行详细的展示和描述，以避免不必要地掩盖对所公开的实施方案的描述。

根据测定食品添加剂L-赖氨酸盐酸盐的标准方法(GB10794-2009)来检测赖氨酸。根据测定工业无水硫酸钠的标准方法(GB6009-92)来检测硫酸根离子。通过离子色谱法来检测其他离子。根据在NMR波谱中，尸胺在2.5ppm附近处的特征吸收来检测尸胺。将DMSO用作内标。尸胺盐组合物也可以通过尸胺的浓度来表征，其通过在取NMR波谱前将测试样品的pH调节至至少约14来进行。

生物基尸胺盐水性组合物根据实施例1、2和3中所公开的方法制备。也可使用将赖氨酸通过微生物转化成尸胺的其它方法(参见例如“微生物转化L-赖氨酸为尸胺的研究”，朱婧，硕士论文，天津科技大学，2009年3月)。实施例4描述了从尸胺盐组合物得到尸胺的常规萃取纯化。实施例5显示当尸胺浓度变化时，尸胺水溶液的pH的变化。实施例6和7显示由一些根据本文中公开的方法的实施方案的有效除盐(saltreduction)。实施例8为NaCl和Na₂SO₄在不同尸胺浓度的尸胺水溶液中的溶解度的测得量。实施例9显示由纯化的尸胺(纯度95.00％)制备的尸胺硫酸盐水性组合物的有效尸胺纯化。实施例10-11包括根据本文中公开的尸胺纯化方法从生物基尸胺盐组合物(如尸胺盐酸盐或尸胺硫酸盐)的尸胺纯化，以及在本文中公开的方法中所记载的除盐步骤(即步骤b)下，从类似的生物基尸胺盐组合物的尸胺纯化。

实施例1.赖氨酸发酵液的制备：

(1)LB培养基斜面：

使用包含胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl1％(pH7.2)的LB培养基制备LB培养基斜面。

(2)初始种子培养基(摇瓶种子培养基)

使表达赖氨酸的棒杆菌培养物在LB培养基斜面上生长，并将其转移至包含200mL液体培养基(包含牛肉膏1％、胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl0.5％(pH7.0)的液体肉汤培养基)的500mL种子瓶内，然后在33℃下，于200rmp的摇床上培养10-15小时。

(3)赖氨酸发酵

向10L发酵罐内加入发酵培养基(5L)。然后将上述制备的种子液体转移入发酵罐进行发酵。所述发酵培养基包含：葡萄糖1.5％、糖蜜0.2％、玉米浆0.06％、豆粕水解物0.05％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.01％和硫酸镁0.005％。在121℃下灭菌20分钟，然后使发酵罐在31-33℃下，以400-500rpm旋转以进行发酵，通入发酵罐的空气量控制在0.5-1.2vvm，DO>20％。在所述过程中，连续加入糖以控制糖浓度为约0.5％；连续加入硫酸铵以控制氨浓度为约0.1％；并且连续加入氨以控制pH为约6.5-6.8。同时，在发酵过程中加入泡敌(bubbleenemy)(甘油聚氧丙烯聚氧乙烯醚)以控制起泡。整个发酵过程持续约41小时。流出的罐液中赖氨酸浓度为约12％。

(4)赖氨酸发酵液的后处理

将赖氨酸发酵液任选地进一步处理(例如过滤、离心和/或膜过滤)以移除细胞得到澄清液体。

实施例2.赖氨酸脱羧酶(LDC)的制备

(1)种子和发酵培养基：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10、牛肉膏5、NaCl5、玉米浆5(pH7.2)。使表达LDC的野生蜂房哈夫尼亚菌种(Hafniaalvei1.1009，购自CGMCC，http://www.cgmcc.net/index.php/Contents/show/id/460)在斜面上生长，将其转移入包含30mL种子培养基的三角烧瓶中，并在35℃，于170R/min的摇动下培养15小时。

(2)培养条件

发酵培养基(g/L)：葡萄糖18、酵母提取物20、玉米浆36.6、MgSO₄0.3、KH₂PO₄0.1、NaCl3、L-赖氨酸5、维生素B₆1，并且pH6.5-7.0。

将10％种子转移入含有100mL发酵培养基的250mL烧瓶中。在细胞的生长期，将温度控制在35℃，并将细胞在以200r/min振荡的旋转式摇床上培养13小时；然后静态培养5小时。将获得的LDC发酵液直接用于赖氨酸的LDC催化转化，或离心得到湿细胞。

实施例3.赖氨酸的LDC催化转化

(1)赖氨酸盐酸盐的酶促转化

将100LLDC发酵液(实施例2)加入到250L的反应器中，向反应中加入乙酸和乙酸钠至最终摩尔浓度分别为0.2mol/L。向反应中加入市售赖氨酸盐酸盐，控制赖氨酸浓度为3g/L，并向反应中加入吐温-80(共0.15kg)。在35℃下搅拌反应。反应在约5小时内完成，赖氨酸摩尔转化率为约98％。浓缩酶促转化溶液，以得到尸胺盐溶液(约5％)，可将其任选地进一步处理。

(2)赖氨酸硫酸盐的酶促转化

将100LLDC发酵液(实施例2)加入到250L的反应器中，向反应中加入乙酸和乙酸钠至最终摩尔浓度分别为0.2mol/L。向反应中加入市售赖氨酸硫酸盐(65％)，控制赖氨酸浓度为3g/L，并向反应中加入吐温-80(共0.15kg)。在35℃下搅拌反应。反应在约5小时内完成，赖氨酸摩尔转化率为约86％。浓缩酶促转化溶液，以得到尸胺盐溶液(约5％)，可将其任选地进一步处理。

(3)赖氨酸发酵液的酶促转化

将1670g上述制备的赖氨酸发酵液(实施例1)投入上述制备的LDC发酵液(实施例2)中，得到100L混合物溶液(赖氨酸浓度为2g/L)。向反应中加入乙酸和乙酸钠至最终摩尔浓度分别为0.2mol/L，并向反应中加入吐温-80(共0.15kg)。在35℃下搅拌反应。反应在约8小时内完成，赖氨酸摩尔转化率为约83％。浓缩酶促转化溶液，以得到尸胺盐溶液(约5％)，可将其任选地进一步处理。

实施例4.使用有机溶剂萃取的尸胺纯化

在减压下于蒸发器上浓缩尸胺盐酸盐酶促转化溶液(6％尸胺)，以得到尸胺盐酸盐水溶液(1,075L，1,118kg，以及9.83％尸胺)。加入氢氧化钠(水溶液，30％，332L)，以得到pH14的尸胺水性组合物。向上述反应物中加入饱和丁醇水溶液进行萃取(400L)。将萃取混合物在50-60℃下搅拌/萃取40分钟，并静置1小时以使水相和有机相分离。将水层进一步如上所述用饱和丁醇水溶液(水溶液，400L)萃取两次。合并有机相，并且尸胺浓度为9％。将合并的有机相在50-60℃，-0.085MPa下浓缩，并进一步在80-120℃，-0.085MPa下蒸馏6小时，以得到尸胺回收率为62.35％。

虽然将尸胺水性组合物在蒸馏前进行了萃取，但大量的杂质仍然留在蒸发/蒸馏的组合物中，这影响尸胺的蒸馏，并得到低的尸胺回收率。

实施例5.室温下一些尸胺水性组合物的pH

使用pH计检测室温下一些尸胺水性组合物的pH(表1)。

表1.室温下一些尸胺水性组合物的pH

尸胺浓度(％)	pH
		1	12.29
4.91	12.59
		9.9	12.74
19.8	12.89
		30	13.4
50	14

实施例6.除盐处理(I)

将尸胺硫酸盐酶促转化溶液(1000g)在50-70℃，-0.09MPa下的旋转蒸发仪(rotavap)上浓缩，得到第一尸胺硫酸盐组合物(139.63g)。将另一尸胺硫酸盐酶促转化溶液(1000g)在基本相同的条件下浓缩为第二尸胺硫酸盐组合物(161.00g)。将氢氧化钠(化学级，约28.3g)加入第一尸胺硫酸盐组合物中，并搅拌直到pH大于13.3。将混合物在约65℃下过滤，并灼烧过滤得的固体，以得到干燥固体(44.38g)，其含有43.87g硫酸钠(98.85％)。对第二尸胺硫酸盐组合物进行相同的处理，并得到干燥固体(42.70g)，其含有42.16g硫酸钠(98.94％)。因此，该实施例表明根据本文中公开的方法，在浓度越高的尸胺盐组合物中除盐效率越高。

实施例7.除盐处理(II)

将第一尸胺硫酸盐酶促转化溶液(300.74g，4.6％尸胺，2.83％SO₄ ^2-)在50-70℃，-0.09MPa下的旋转蒸发仪上浓缩，得到第一尸胺硫酸盐组合物(120.13g，11.51％尸胺，7.08％SO₄ ^2-)。将第二尸胺硫酸盐酶促转化溶液(300.79g，4.6％尸胺，2.83％SO₄ ^2-)在基本相同的条件下浓缩为第二尸胺硫酸盐组合物(76.69g，17.36％尸胺，10.68％SO₄ ^2-)。将氢氧化钠(水溶液，18.05g，60％，约1当量)加入第一尸胺硫酸盐组合物中，并在约65℃下过滤，以得到第一尸胺水性组合物(溶液中9.8％尸胺，6.03％SO₄ ^2-)。对第二尸胺硫酸盐组合物进行相同的处理，并得到第二尸胺水性组合物(溶液中14.90％尸胺，5.17％SO₄ ^2-)。因此，该实施例表明根据本文中公开的方法，在浓度越高的尸胺盐组合物中除盐效率约高，并且获得的尸胺水性组合物中盐浓度更低，尸胺浓度更高。

实施例8.NaCl和硫酸钠在尸胺水溶液中的溶解度

在特定的温度(例如5℃、18℃、24℃或65℃)下，将硫酸钠加入含有特定浓度尸胺的尸胺水溶液中，直到少量硫酸钠不溶解。将混合物搅拌半小时，并静置半小时。取上清液检测尸胺浓度和硫酸根浓度。在不同尸胺浓度和/或不同温度下重复所述方案(表2和图2)。

在特定的温度(例如5℃、18℃、24℃或65℃)下，在搅拌下将NaCl加入由50％尸胺水溶液组成的密封***中，直到少量NaCl不溶解。记录加入的NaCl的量。添加少量的水直至不溶的NaCl完全溶解。也记录添加的水的量。重复上述添加NaCl和水的步骤，以得到在不同尸胺浓度下NaCl的溶解度(表3和图3)。

表2.在5℃、18℃和65℃下硫酸钠在尸胺组合物(水性)中的溶解度

表3.在24℃下氯化钠在尸胺组合物(水性)中的溶解度

实施例9.尸胺硫酸盐组合物的尸胺纯化(I)

将尸胺(52.39g，95.00％尸胺，30℃下pH>14.0)在水中溶解，以得到尸胺水溶液(250.19g，30℃下pH约12.73)。向尸胺水溶液中加入硫酸(水溶液，163.46g，30％)，直至pH为约7，以得到尸胺硫酸盐水溶液(413.65g)。将尸胺硫酸盐水溶液在50-70℃，-0.09MPa下的旋转蒸发仪上浓缩为含有约30.99％尸胺的浓缩尸胺硫酸盐组合物。向浓缩尸胺硫酸盐组合物中加入氢氧化钠(化学级，41.50g)，并搅拌直至pH大于14.0。将获得的混合物冷却到约10℃，并在相同的温度下过滤，以得到118.52g滤液(37.30％尸胺)。滤液中尸胺的回收为约88.82％。相对低的回收是由于残留在过滤的湿固体上的尸胺。

实施例10.尸胺硫酸盐组合物的尸胺纯化(II)：有/无除盐步骤b)

将尸胺硫酸盐酶促转化溶液在50-70℃，-0.09MPa下的旋转蒸发仪上浓缩为尸胺硫酸盐组合物(28.52％尸胺)。

将氢氧化钾(水溶液，47.46g，60％)在60℃下加入到第一尸胺硫酸盐组合物(150g，28.52％尸胺)中，并在相同温度下搅拌，以得到第一尸胺水性组合物(pH13.99)。将第一尸胺水性组合物在-0.095MPa下于油浴中蒸发，直到观察不到更多的蒸发。将油浴的温度在130分钟内从80℃升高到180℃。收集的馏出液含有143.48g尸胺(水溶液，23.12％尸胺)。尸胺回收率为77.52％。

将氢氧化钾(水溶液，47.46g，60％)在60℃下加入到第二尸胺硫酸盐组合物(150g，28.52％尸胺)中，并在相同温度下搅拌，以得到第二尸胺水性组合物(pH13.98)。将第二尸胺水性组合物在60℃下过滤，以得到143.36g滤液(28.14％尸胺)。将由过滤得到的固体在其为湿润时称重(51.66g)，用饱和硫酸钠(水溶液，26.00g)冲洗，并过滤以得到26.55g的另一滤液(18.65％尸胺)。合并两次过滤中得到的滤液(169.91g，含有45.29g尸胺)，并在-0.095MPa下于油浴中蒸发，直至观察不到更多的蒸发。将油浴的温度在130分钟内从80℃升高到180℃。收集的馏出液含有197.38g尸胺(水溶液，20.22％尸胺)。尸胺回收率为93.26％。

实施例11.尸胺盐酸盐组合物和尸胺硫酸盐组合物的尸胺纯化

(1)尸胺盐酸盐组合物的尸胺纯化

将尸胺盐酸盐酶促转化溶液(502.23g，8.96％尸胺)在50-70℃，-0.09MPa下的旋转蒸发仪上浓缩为尸胺盐酸盐组合物(150.00g)。

将氢氧化钠(38.29g)加入到尸胺盐酸盐组合物中，并搅拌以得到第一尸胺水性组合物(pH约14.0)。将第一尸胺水性组合物在20℃下过滤以得到138.35g滤液(30.18％尸胺)。将由过滤得到的固体在其为湿润时称重(49.65g)，用饱和氯化钠(水溶液，33.00g)冲洗，并过滤以得到43.55g的另一滤液(11.98％尸胺)。合并两次过滤中得到的滤液(181.90g)，并在-0.095MPa下于油浴中蒸发，直至观察不到更多的蒸发。将油浴的温度在130分钟内从80℃升高到180℃。收集的馏出液含有124.63g尸胺，尸胺回收率为85.05％。

(2)尸胺硫酸盐组合物的尸胺纯化

将尸胺硫酸盐酶促转化溶液(229.00g，20.70％尸胺)在50-70℃，-0.09MPa下的旋转蒸发仪上浓缩为尸胺硫酸盐组合物(150.00g)。

将氢氧化钾(49.52g)在60℃下加入到第二尸胺硫酸盐组合物(150g，28.52％尸胺)中，并在相同温度下搅拌，以得到第二尸胺水性组合物(pH约14.0)。将第二尸胺水性组合物在40℃下过滤，以得到122.99g滤液(37.18％尸胺)。将由过滤得到的固体在其为湿润时称重(72.19g)，用饱和硫酸钠(水溶液，39.00g)冲洗，并过滤以得到26.72g的另一滤液(5.71％尸胺)。合并两次过滤中得到的滤液(149.71g，含有31.44％尸胺)，并在-0.095MPa下于油浴中蒸发，直至观察不到更多的蒸发。将油浴的温度在130分钟内从80℃升高到180℃。收集的馏出液含有121.13g尸胺，尸胺回收率为95.78％。

Claims

1.降低尸胺盐水性组合物中盐含量的方法，其包括：

2.从尸胺盐水性组合物中纯化尸胺的方法，其包括：

c)通过蒸发或蒸馏所述尸胺水性组合物来得到尸胺。

3.在生物基尸胺的制备中降低盐含量的方法，其包括：

4.制备纯化的生物基尸胺的方法，其包括：

5.权利要求1-4中任一项的方法，其还包括：

a-11)在加入一种或多种碱之前浓缩所述尸胺盐水性组合物；和/或

a-12)在加入一种或多种碱之后浓缩所述尸胺盐水性组合物/碱反应液；和/或

a-13)在加入一种或多种碱期间浓缩所述尸胺盐水性组合物/碱反应液。

6.权利要求5的方法，其中步骤a)中的所述尸胺水性组合物中的尸胺浓度为约5％或更高。

7.权利要求5的方法，其中步骤a)中的所述尸胺水性组合物中的尸胺浓度为约20％或更高。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中步骤b)包括：

b-1)过滤/离心所述第一组合物以得到固体和滤液/上清液；

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述尸胺水性组合物中的酸阴离子含量不超过所述尸胺盐水性组合物中的酸阴离子含量的约50％。

10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述尸胺水性组合物中的酸阴离子含量不超过所述尸胺盐水性组合物中的酸阴离子含量的约70％。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述尸胺盐水性组合物包含一种或多种选自尸胺硫酸盐、尸胺盐酸盐、尸胺碳酸盐、尸胺磷酸盐及其任意组合的尸胺盐。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述尸胺盐水性组合物的pH为约11或更低。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述步骤a)中的第一组合物的pH为约13.3或更高。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中步骤a)包括将无机碱组合物加入所述尸胺盐水性组合物中，其中所述无机碱组合物包含一种或多种选自碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物及其碱性盐的无机碱。

15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种无机碱选自NaOH、KOH、Na₃PO₄、Na₂CO₃及其任意组合。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中将由步骤b)获得的所述尸胺水性组合物在减压或者围压下蒸馏。