CN105658664A - 含有Fc的多肽的稳定化 - Google Patents
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Abstract
本公开提供包含抗体Fc区的多肽,所述抗体Fc区在铰链区中缺失一个或多个半胱氨酸残基,并且一个或多个CH3界面氨基酸被含有巯基的残基取代。此外,提供含有所述多肽的Fc融合蛋白和抗体、编码所述多肽的核酸和载体,以及用于制备所述多肽的宿主细胞和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年7月31日提交的美国临时申请号61/860,800的权益,所述美国临时申请据此以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子提交,并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。2014年7月28日创建的所述ASCII拷贝名为A-1852-WO-PCT_SL.txt,并且大小为122,988字节。
背景
在生物制药行业内,抗体已变为主要选择,因为它们具有对开发治疗性分子者具有吸引力的若干特征。连同靶向特定结构或细胞的能力一起,抗体使得它的靶标易感于Fc受体细胞介导的吞噬和杀灭(Raghavan和Bjorkman1996)。此外,抗体以pH依赖性方式与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的能力赋予它延长的血清半衰期(Ghetie和Ward2000)。抗体的这个独特特征允许通过工程改造Fc融合分子来延长治疗性蛋白质或肽在血清中的半衰期。
抗体属于免疫球蛋白类别的蛋白质,其包括IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在人血清中最充足的免疫球蛋白类别是IgG,其示意性结构显示于图1中(Deisenhofer1981;Huber1984;Roux1999)。IgG结构具有四个链,即两个轻链和两个重链;各轻链具有两个结构域,并且各重链具有四个结构域。抗原结合位点位于含有可变轻(VL)链和可变重(VH)链结构域以及恒定轻(LC)链和恒定重(CH1)链结构域的Fab区(抗原结合片段)中。重链的铰链、CH2和CH3结构域区域被称为Fc(可结晶片段)。IgG分子可被视为具有两个在铰链区处通过二硫键(-S-S-)保持在一起的重链和两个轻链的异四聚体。在免疫球蛋白子类之间,铰链二硫键的数目不同(Papadea和Check1989)。FcRn结合位点位于抗体的Fc区中(Martin,West等2001),并且因此抗体的延长的血清半衰期性质被保持在Fc片段中。单独Fc区可被认为是包含铰链、CH2和CH3结构域的重链的同二聚体。
天然存在的IgG抗体的Fc区是同二聚体,并且可以二聚体形式表达和纯化。如上所讨论,抗体的Fc区通过FcRn再循环机理赋予血清半衰期。因此,Fc用作融合伴侣以延长治疗性蛋白质、肽(肽体)和蛋白质结构域的血清半衰期。然而,对于一些治疗应用,可能必要的是缺失铰链区,此移除形成Fc的两个多肽链之间的共价连接。举例来说,当使Fc融合于含有内部二硫键或游离半胱氨酸残基的蛋白质时,铰链二硫化物可干扰折叠,并且导致聚集。然而,移除铰链区会消除两个多肽链之间的共价连接。这可导致在制造阶段或体内期间两个Fc链之间的非共价相互作用解离,并且导致Fc链与其它蛋白质/分子的缔合。
概述
如本文所公开,通过在CH3结构域界面处引入二硫键,可改进在铰链区内缺乏二硫键的含有Fc的分子的热稳定性。此外,共价连接保持在Fc结构中形成二聚体的两个多肽链完整,而不在体外或在体内解离。如图3中所示,在某些实施方案中,在WT缺失铰链Fc同二聚体和突变缺失铰链Fc异二聚体中两个Fc链之间的唯一共价连接是引入的二硫键。
在某些实施方案中,一个或多个在两个CH3结构域上组成CH3-CH3界面的残基被含有巯基的残基置换以使相互作用因在CH3结构域之间形成二硫键(-S-S-)而变得稳定。在优选实施方案中,界面中的氨基酸,诸如亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸,被半胱氨酸或甲硫氨酸,优选被半胱氨酸置换。在某些实施方案中,氨基酸被具有所需电荷特征的非天然氨基酸,诸如高半胱氨酸或谷胱甘肽置换。
在本发明的第一方面,多肽包含在铰链区的一个或多个半胱氨酸被缺失或取代,并且一个或多个CH3界面氨基酸被含有巯基的残基(优选是半胱氨酸)取代的抗体Fc区。铰链区可借助于取代或通过缺失而缺乏半胱氨酸残基。在某些实施方案中,Fc完全缺乏铰链区。在其它实施方案中,仅一部分铰链区缺失,优选是包含半胱氨酸残基的部分。
在第一方面的某些实施方案中,CH3界面氨基酸Y349、L351、S354、T394或Y407被含有巯基的残基(优选是半胱氨酸)取代。在优选实施方案中,Fc包含L351C取代。当两个具有L351C取代的含有Fc的多肽在适当条件下相互作用时,在两个链中的L351C残基之间形成二硫键。类似地,当两个具有T394C取代的含有Fc的多肽在适当条件下相互作用时,在两个链中的T394C残基之间形成二硫键。此外,当两个具有Y407C取代的含有Fc的多肽在适当条件下相互作用时,在两个链中的Y407C残基之间形成二硫键。当具有Y349C取代的含有Fc的多肽与具有S354C取代的含有Fc的多肽在适当条件下相互作用时,在一个链中的Y349C残基与另一链中的S354C残基之间形成二硫键。
第一方面的多肽的Fc区可在CH2和/或CH3区中含有一个或多个其它氨基酸取代。在优选实施方案中,Fc区在CH2区中包含一个或多个氨基酸取代,其相较于具有野生型CH2的类似蛋白质,改变含有Fc的蛋白质的效应物功能。在其它实施方案中,Fc区在CH3区中包含一个或多个氨基酸取代,其改变含有Fc的多肽同二聚的能力和/或增加与在CH3区中具有互相作用性氨基酸取代的含有Fc的多肽异二聚的能力。
在某些实施方案中或在第一方面,Fc的C末端的一个或多个氨基酸被缺失或取代。在优选实施方案中,C末端赖氨酸被缺失或取代成另一氨基酸。在其它实施方案中,两个或三个末端氨基酸被缺失或取代成另一氨基酸。
在第一方面的某些实施方案中,多肽是抗体重链。在其它实施方案中,多肽是Fc融合蛋白。Fc融合蛋白可在Fc分子的N末端和/或C末端含有接头。
在本发明的第二方面,核酸编码第一方面的多肽。
在第三方面,表达载体包含可操作地连接于调控序列,诸如异源性启动子和/或增强子的第二方面的核酸。
在第四方面,宿主细胞包含第三方面的表达载体。在优选实施方案中,宿主细胞是真核细胞,诸如酵母或哺乳动物细胞系。优选的哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
本发明的第五方面是一种制备第一方面的多肽的方法。方法包括在其中调控区在宿主细胞中具有活性的条件下培养第四方面的宿主细胞,以及从培养物分离多肽。
在第六方面,药物组合物包含第一方面的多肽。
附图简述
图1.具有指示的各结构域的IgG1抗体的示意图。IgG1抗体是具有两个重链(较长长度)和两个轻链(较短长度)的Y形四聚体。两个重链在铰链区处通过二硫键(-S-S-)连接在一起。Fab-抗原结合片段,Fc-可结晶片段,VL-可变轻链结构域,VH-可变重链结构域,CL-恒定(无序列变化)轻链结构域,CH1-恒定重链结构域1,CH2-恒定重链结构域2,CH3-恒定重链结构域3。
图2.显示缺乏铰链区(“缺失铰链”),在CH3结构域界面处具有引入的二硫键的Fc二聚体的示意图,(a)在WTFc同二聚体的情况下以及(b)在突变Fc异二聚体的情况下,其中突变(例如钮入孔(knobs-into-holes)或电荷对突变)也已在CH3结构域界面处被引入。
图3.显示主要单一条带的SDSPAGE,所述条带确认在于CH3结构域界面处引入L351C二硫键的缺失铰链Fc电荷对突变异二聚体融合构建体的正(‘+’)Fc链与负(‘-’)Fc链之间存在共价键联。
图4.缺乏铰链区的异二聚(电荷对突变)Fc融合蛋白的药代动力学的概述。A.缺乏铰链,并且在治疗性肽与Fc之间无接头的Fc融合物。B.与A相同,例外之处是在治疗性肽内具有变化。C.与B相同,例外之处是非糖基化接头使Fc连接于治疗性肽。D.与C相同,例外之处是具有不同接头。E.与A相同,例外之处是一个Fc链包含Y349C取代,而另一链包含S354C取代。F.与B相同,例外之处是一个Fc链包含Y349C取代,而另一链包含S354C取代。
详述
本文描述改进抗体Fc骨架,特别是缺乏铰链区,缺乏形成二硫键的铰链区部分,或其中铰链区含有对一个或多个半胱氨酸残基的取代的Fc骨架的稳定性的方法。所述方法涉及在CH3结构域界面处引入一个或多个工程改造的二硫键。
如图1中所示,IgG1抗体是具有两个重链(较长长度)和两个轻链(较短长度)的Y形四聚体。两个重链在铰链区处通过二硫键(-S-S-)连接在一起。IgG分子可被视为由两个在铰链区处通过二硫键(-S-S-)保持在一起的重链和两个轻链组成的异四聚体。在免疫球蛋白子类之间,铰链二硫键的数目不同。
在天然存在的抗体中,两个重链之间的共价键联由铰链区(其暴露于溶剂)中的二硫键提供。因此,在缺乏铰链区的Fc二聚体或抗体中,在两个重链之间不存在共价键联。铰链二硫化物连同轻链与重链之间(CL-CH1)的二硫键一起保持所有四个链被共价连接。完整抗体的分子量是约150KDa,并且在非还原SDSPAGE中泳动为单一条带。在WTIgG1/Fc中,在CH3结构域界面处不存在二硫键。
示例性人IgG1Fc氨基酸序列是
在以上序列中,DKTHTCPPCPAPELLGG(SEQIDNO:10)对应于铰链区。
组成CH3-CH3界面的氨基酸描述于共同拥有的临时申请6I/019,569(1/7/2008提交)和61/120,305(12/5/09提交)以及1/6/2009提交的PCT/US2009/000071(全都以引用的方式整体并入本文)中。
使用基于结构的搜索算法(Ye和Godzik2004),从蛋白质数据库(PDB)(Bernstein,Koetzle等1977)鉴定了总计48个具有对应于Fc区的坐标的抗体晶体结构。对鉴定的Fc晶体结构的考查揭示在最高分辨率下确定的结构对应于利妥昔单抗(RITUXIMAB)的结合于来自蛋白质A的最小形式的B结构域(称为Z34C)的Fc片段(PDB代码:1L6X)。使用存放的Fc单体坐标和晶体对称性产生1L6X的生物Fc同二聚体结构。两种方法用于鉴定CH3-CH3结构域相互作用中涉及的残基:(i)如通过距离限制准则确定的接触和(ii)溶剂可及表面积分析。
根据基于接触的方法,界面残基被定义为其侧链重原子与第二链中的任何残基的重原子以比指定限度更接近的方式定位的残基。尽管4.5A距离限度是优选的,但也可使用更长距离限度(例如5.5A)来鉴定界面残基(Bahar和Jernigan1997)。
第二方法涉及在存在以及不存在第二链下,计算CH3结构域残基的溶剂可及表面积(ASA)(Lee和Richards1971)。在两次计算之间在ASA方面显示差异(>1A2)的残基被鉴定为界面残基。两种方法均鉴定了一组类似界面残基。此外,它们符合公开的研究(Miller1990)。
表1列出使用距离限度4.5A,基于接触准则方法鉴定的24个界面残基。进一步考查这些残基的结构保守性。出于这个目的,将48个从PDB鉴定的Fc晶体结构叠加,并且通过计算侧链重原子的均方根差来分析。残基标号基于Kabat的EU编号流程,其也对应于蛋白质数据库(PDB)中的编号。
表1
获得WTFc的晶体结构,并且分析用于引入半胱氨酸残基以达成工程改造的二硫键的潜在位置。特定来说,选择位置T394和L351。WTFc链的T394位置并置在CH3结构域界面处。在两个Fc链上均使T394突变成半胱氨酸将允许形成二硫键。类似地,WTFc链的L351位置并置在CH3结构域界面处。在两个Fc链上均使L351突变成半胱氨酸也将允许形成二硫键。在两个Fc链中均使T394与L351两者均突变成半胱氨酸将允许形成两个二硫键。
因为二硫键涉及两个链中的相同残基,所以T394位点与L351位点两者均可适用于WTFc同二聚体以及工程改造的Fc异二聚体,诸如具有钮入孔或电荷对突变的Fc链。
位置Y349和S354并置在WTFcCH3界面中。在Fc异二聚体中,一个CH3区可含有Y349C取代,而另一CH3区可含有S354C取代。发现包含(Y349C/S354C)半胱氨酸钳夹突变的电荷对异二聚体的稳定性优于不包含半胱氨酸钳夹的异二聚体。特定来说,在SDS-PAGE上,在单独条带中观察到无半胱氨酸钳夹的电荷对异二聚体的单体,而在单一条带中观察到具有半胱氨酸钳夹突变的电荷对异二聚体。包含(L351C/L351C)半胱氨酸钳夹突变的电荷对异二聚体的情况也是一样的。
包含第一包含Y349C取代的含有CH3的分子和第二包含S354C取代的含有CH3的分子的异二聚体比在那些位置处含有野生型氨基酸残基的那些显示更大稳定性和更高异二聚体百分比。此外,包含各自包含L351C取代的第一和第二含有CH3的分子的异二聚体比含有L351的那些显示更大稳定性和更高产生水平。
在各种抗体子类、类别之间,并且甚至在不同物种之间,CH3区内的界面残基倾向于高度保守。因此,尽管其中提供的是在人IgG1内的实施方案,但半胱氨酸工程改造可适用于其它含有Fc的分子。以下提供示例性Fc序列。在以下序列内对应于人IgG1的Y349、L351、S354、T394或Y407的残基可被含有巯基的残基(优选是半胱氨酸)取代。其它人IgG子类中的相应残基以粗体指示。
>IGHG1_人(SEQIDNO:11)
>IGHG2_人(SEQIDNO:12)
>IGHG3_人(SEQIDNO:13)
>IGHG4_人(SEQIDNO:14)
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>IGHG1_母牛(SEQIDNO:22)
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>IGHG4_猪(SEQIDNO:43)
>IGHG5_猪(SEQIDNO:44)
在某些实施方案中,含有CH3区的多肽是IgG分子,并且进一步含有CH1和CH2结构域。示例性人IgG序列包含IgG1(例如SEQIDNO:1)、IgG2(例如SEQIDNO:2)、IgG3(例如SEQIDNO:3)和IgG4(例如SEQIDNO:4)的恒定区。
Fc区也可包含在IgA(例如SEQIDNO:5)、IgD(例如SEQIDNO:6)、IgE(例如SEQIDNO:7)和IgM(例如SEQIDNO:8)重链的恒定区内或源于所述恒定区。
本发明的优选实施方案包括但不限于抗体、双特异性抗体、单特异性单价抗体、双特异性大抗体(大抗体是指scFv-Fc)、单域抗体、肽体、双特异性肽体、单价肽体(融合于异二聚Fc分子的一个臂的肽)和受体-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中,这个策略可与用于改变抗体结构域的相互作用,例如改变CH3结构域以降低或促成所述结构域与它自身相互作用的能力的其它策略一起使用。
当置换被适当协调时,电荷有利于在界面中的残基之间形成二硫键,此使异二聚化形成稳定。
在某些方面,本发明提供一种制备异二聚蛋白质的方法。异二聚体可包含第一含有CH3的多肽和第二含有CH3的多肽,其会合在一起以形成被工程改造来促进和稳定异二聚体形成的界面。第一含有CH3的多肽和第二含有CH3的多肽被工程改造来在界面内包含一个或多个含有巯基的氨基酸,其被定位以允许在第一含有CH3的异二聚体上的氨基酸的巯基与第二含有CH3的异二聚体上的氨基酸的巯基之间形成二硫键。
在某些实施方案中,含有CH3的多肽包括优选源于野生型人IgGFc区的IgGFc区。“野生型”人IgGFc意指天然存在于人组群内的氨基酸序列。当然,恰如Fc序列可在个体之间略微不同,可对野生型序列作出一个或多个改变,并且仍然保持在本发明的范围内。举例来说,Fc区可含有与本发明不相关的其它改变,诸如糖基化位点中的突变,包括非天然氨基酸或“钮入孔”或“电荷对”突变。
可对IgG1Fc作出的其它突变包括有助于在含有Fc的多肽之间形成异二聚体的突变。在一些实施方案中,工程改造Fc区以产生有助于两个不同含有Fc的多肽链在细胞中共同表达时形成异二聚体的“钮”和“孔”。U.S.7,695,963。在其它实施方案中,改变Fc区以使用静电操纵来促使两个不同含有Fc的多肽在细胞中共同表达时形成异二聚体,同时阻碍同二聚体形成。WO09/089,004,其以引用的方式整体并入本文。优选异二聚Fc包括其中Fc的一个链包含D399K和E356K取代,而Fc的另一链包含K409D和K392D取代的那些。在其它实施方案中,Fc的一个链包含D399K、E356K和E357K取代,而Fc的另一链包含K409D、K392D和K370D取代。
重链可进一步包含一个或多个影响含有重链的抗体结合一种或多种Fc受体的突变。抗体的Fc部分的一个功能在于当抗体结合它的靶标时与免疫***通讯。这被视为“效应物功能”。通讯导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc与免疫***的细胞的表面上的Fc受体结合来介导。CDC通过Fc与补体***的蛋白质(例如C1q)结合来介导。
IgG子类在它们介导效应物功能的能力方面不同。举例来说,IgG1在介导ADCC和CDC方面比IgG2和IgG4优越得多。可通过将一个或多个突变引入Fc中来增加或降低抗体的效应物功能。本发明的实施方案包括具有被工程改造来增加效应物功能的Fc的含有Fc的蛋白质,例如抗体或Fc融合蛋白(U.S.7,317,091以及Strohl,Curr.Opin.Biotech.,20:685-691,2009;两者均以引用的方式整体并入本文)。具有增加的效应物功能的示例性IgG1Fc分子包括具有以下取代的那些(全都基于Eu编号流程):
S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S298A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L
G236A/S239D/I332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
K334V
L235S+S239D+K334V
Q311M+K334V
S239D+K334V
F243V+K334V
E294L+K334V
S298T+K334V
E233L+Q311M+K334V
L234I+Q311M+K334V
S298T+K334V
A330M+K334V
A330F+K334V
Q311M+A330M+K334V
Q311M+A330F+K334V
S298T+A330M+K334V
S298T+A330F+K334V
S239D+A330M+K334V
S239D+S298T+K334V
L234Y+K290Y+Y296W
L234Y+F243V+Y296W
L234Y+E294L+Y296W
L234Y+Y296W
K290Y+Y296W
本发明的其它实施方案包括具有被工程改造来降低效应物功能的Fc的含有Fc的蛋白质,例如抗体或Fc融合蛋白。具有降低的效应物功能的示例性Fc分子包括具有以下取代的那些(基于Eu编号流程):
N297A或N297Q(IgG1)
L234A/L235A(IgG1)
V234A/G237A(IgG2)
L235A/G237A/E318A(IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1)
L234F/L235E/P331S(IgG1)
S267E/L328F(IgG1)
增加含有IgGFc的蛋白质的效应物功能的另一方法是通过降低Fc的海藻糖基化。从连接于Fc的双触角复合型寡糖移除核心海藻糖使ADCC效应物功能极大增加而不改变抗原结合或CDC效应物功能。已知用于降低或消除含有Fc的分子(例如抗体)的海藻糖基化的若干方式。这些方式包括在某些哺乳动物细胞系中进行重组表达,所述细胞系包括FUT8基因敲除细胞系、变异CHIO株系Lec13、大鼠杂交瘤细胞系YB2/0、包含特异性针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、以及共同表达β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III和高尔基体(Golgi)α-甘露糖苷酶II的细胞系。或者,含有Fc的分子可在非哺乳动物细胞,诸如植物细胞、酵母或原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))中表达。因此,在本发明的某些实施方案中,组合物包含具有降低的海藻糖基化或完全缺乏海藻糖基化的Fc。
已知人IgG1在N297(EU编号***)处具有糖基化位点,并且糖基化促进IgG1抗体的效应物功能。各研究小组已使N297突变来试图制备无糖基化抗体。突变已集中在用在生理化学性质方面类似于天冬酰胺的氨基酸(诸如谷氨酰胺(N297Q))或用模拟无极性基团的天冬酰胺的丙氨酸(N297A)取代N297。
如本文所用,“无糖基化抗体”或“无糖基化fc”是指在Fc的位置297处的残基的糖基化状态。抗体或其它分子可在一个或多个其它位置处含有糖基化,而可仍然被视为无糖基化抗体或无糖基化Fc融合蛋白。
2013年3月14日提交的共同拥有的美国临时申请序列号61/784,669描述一种无效应物功能IgG1Fc,所述申请以引用的方式整体并入本文。使人IgG1的氨基酸N297突变成甘氨酸(即N297G)提供远优于在那个残基处的其它氨基酸取代的纯化效率和生物物理性质。因此,在优选实施方案中,抗体或Fc融合蛋白包含具有N297G取代的人IgG1Fc。
含有无糖基化IgG1Fc的分子显示稳定性小于含有糖基化IgG1Fc的分子。Fc区可被进一步工程改造来增加无糖基化分子的稳定性。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸被取代成半胱氨酸以便在二聚状态下形成二硫键。CH2区的残基V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332可被半胱氨酸取代。在优选实施方案中,特定配对的残基被取代以使它们优先彼此形成二硫键,由此限制或防止二硫键混杂。优选配对包括但不限于A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、以及V323C和I332C。
本文提供含有Fc的分子,其中残基V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332中的一个或多个被半胱氨酸取代。优选的含有Fc的分子包括包含A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、或V323C和I332C取代的分子。
可使目标多肽融合于IgGFc区的N末端或C末端以产生Fc融合蛋白。在某些实施方案中,Fc融合蛋白在Fc与目标多肽之间包含接头。许多不同接头多肽在本领域中是已知的,并且可在Fc融合蛋白的情形下使用。在优选实施方案中,Fc融合蛋白在Fc与目标肽或多肽之间包含由GGGGS(SEQIDNO:45)、GGNGT(SEQIDNO:46)或YGNGT(SEQIDNO:47)组成的肽的一个或多个拷贝。在一些实施方案中,Fc区与目标肽或多肽区之间的多肽区包含GGGGS(SEQIDNO:45)、GGNGT(SEQIDNO:46)或YGNGT(SEQIDNO:47)的单一拷贝。当在适当细胞中表达时,接头GGNGT(SEQIDNO:46)或YGNGT(SEQIDNO:47)被糖基化,并且所述糖基化可帮助使蛋白质在溶液中和/或在体内施用时稳定。因此,在某些实施方案中,Fc融合蛋白在Fc区与目标蛋白质区之间包含糖基化接头。
1/26/12提交的共同拥有的美国临时专利申请61/591,161和1/28/13提交的PCT申请号PCT/US2013/023456(两者均以引用的方式整体并入本文)描述GDF15Fc融合蛋白。在本发明的某些实施方案中,多肽包含在铰链区的一个或多个半胱氨酸被缺失或取代,并且一个或多个CH3界面氨基酸被含有巯基的残基(优选是半胱氨酸)取代的抗体Fc区,其中所述多肽不是GDF15Fc融合物。更具体来说,多肽包含铰链区的一个或多个半胱氨酸被缺失或取代,并且一个或多个CH3界面氨基酸被含有巯基的残基(优选是半胱氨酸)取代的抗体Fc区,其中所述多肽不是如PCT申请号PCT/US2013/023456中阐述的GDF15Fc融合蛋白,诸如包含以下的GDF15融合蛋白:
编码抗体和Fc融合蛋白的多核苷酸
本发明内涵盖编码抗体重链和Fc融合蛋白的核酸。本发明的方面包括编码本文所述的氨基酸序列的多核苷酸变体(例如归因于简并性)。
对应于本文所述的氨基酸序列,待用作用于分离核酸的探针或引物或用于数据库搜索的查询序列的核苷酸序列可通过从氨基酸序列“回译”来获得。熟知聚合酶链反应(PCR)程序可用于分离和扩增编码抗体重链和Fc融合蛋白的DNA序列。界定DNA片段的组合的所需末端的寡核苷酸用作5′和3′引物。寡核苷酸可另外含有限制核酸内切酶的识别位点以有助于将扩增的DNA片段组合***表达载体中。PCR技术描述于Saiki等,Science239:487(1988);RecombinantDNAMethodology,Wu等编,AcademicPress,Inc.,SanDiego(1989),第189-196页;以及PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等编,AcademicPress,Inc.(1990)中。
本发明的核酸分子包括呈单链形式与双链形式两者的DNA和RNA以及相应互补序列。在从天然存在的来源分离核酸的情况下,“分离的核酸”是已与存在于从其分离核酸的生物体的基因组中的邻近遗传序列分离的核酸。在从模板酶促合成或化学合成核酸(诸如PCR产物、cDNA分子或例如寡核苷酸)的情况下,应了解由所述方法产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指呈单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选实施方案中,核酸大致上不含污染性内源物质。核酸分子已优选源于以大致上纯净形式,并且以使得能够通过标准生物化学方法(诸如Sambrook等,MolecularClonmg:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中概述的那些)来鉴定、操作和回收它的组成核苷酸序列的量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。优选以不被通常存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的开放阅读框形式提供和/或构建所述序列。非翻译DNA的序列可存在于开放阅读框的5′或3′,在5′或3′处,所述序列不干扰编码区的操作或表达。
本发明的变体通常通过以下方式来制备:使用盒式或PCR诱变或本领域中熟知的其它技术,使编码重链或Fc融合蛋白的DNA中的核苷酸经受位点特异性诱变以产生编码变体的DNA,以及此后在如本文概述的细胞培养物中表达重组DNA。然而,重链和Fc融合蛋白可通过使用确立的技术进行体外合成来制备。变体与天然存在的类似物通常展现相同定性生物活性,但也可选择具有改进的特征的变体,如以下将更充分概述。
如将由本领域中的人士所了解,归因于遗传密码的简并性,可制备极其大量全都编码本发明的重链和Fc融合蛋白的核酸。因此,在已鉴定特定氨基酸序列的情况下,本领域技术人员可通过以不改变编码的蛋白质的氨基酸序列的方式,仅修改一个或多个密码子的序列来制备许多不同核酸。
本发明也提供呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的包含至少一种如上多核苷酸的表达***和构建体。此外,本发明提供包含所述表达***或构建体的宿主细胞。
通常,用于任何宿主细胞中的表达载体都将含有用于质粒维持以及用于克隆和表达外源性核苷酸序列的序列。在某些实施方案中,总称为“侧接序列”的所述序列将通常包括以下核苷酸序列中的一个或多个:启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和接受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于***编码多肽的待表达核酸的多接头区域、和可选择标志物元件。以下讨论这些序列中的每一个。
任选地,载体可含有“标签”编码序列,即位于重链或Fc融合蛋白编码序列的5′或3′末端的寡核苷酸分子;寡核苷酸序列编码多聚His(诸如六His(SEQIDNO:58)),或其可商购获得的抗体存在的另一“标签”,诸如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒(hemaglutinininfluenzavirus、))或myc。这个标签通常在多肽表达后融合于多肽,并且可充当一种用于从宿主细胞亲和纯化或检测蛋白质的手段。亲和纯化可例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质进行柱色谱来实现。任选地,可随后通过各种手段,诸如使用用于裂解的某些肽酶从纯化的重链或Fc融合蛋白移除标签。
侧接序列可为同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即来自除宿主细胞物种或品系以外的物种)、杂交的(即来自一种以上来源的侧接序列的组合)、合成的或天然的。因此,侧接序列的来源可为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体、或任何植物,前提是侧接序列在宿主细胞机构中具有功能性,并且可由宿主细胞机构活化。
适用于本发明的载体中的侧接序列可通过本领域中熟知的若干方法中的任一个来获得。通常,适用于本文中的侧接序列将已先前通过图谱分析和/或通过限制核酸内切酶消化来鉴定,并且因此可使用适当限制核酸内切酶从适当组织来源分离。在一些情况下,侧接序列的完整核苷酸序列可为已知的。此处,可使用本文对于核酸合成或克隆所述的方法合成侧接序列。
无论已知全部或仅一部分侧接序列,它都可使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用适合探针,诸如来自相同或另一物种的寡核苷酸和/或侧接序列片段筛选基因组文库来获得。当侧接序列未知时,含有侧接序列的DNA片段可从一段可含有例如编码序列或甚至另外一种或多种基因的较大DNA分离。分离可通过以下方式实现:限制核酸内切酶消化以产生适当DNA片段,随后使用琼脂糖凝胶纯化柱色谱(Chatsworth,CA)或熟练技术人员已知的其它方法进行分离。对适于实现这个目的的酶的选择将为本领域普通技术人员显而易见。
复制起点通常是那些商购原核表达载体的一部分,并且起点有助于在宿主细胞中扩增载体。如果所选载体不含有复制起点位点,那么可基于已知序列化学合成复制起点位点,并且连接至载体中。举例来说,来自质粒pBR322(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌,并且各种病毒起点(例如SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或诸如HPV或BPV的***状瘤病毒)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常,复制起点组分不为哺乳动物表达载体所需(例如SV40起点常被使用仅因为它也含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3′末端,并且用于终止转录。通常,原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段,继之以聚T序列。尽管序列易于从文库克隆或甚至作为载体的一部分商购,但它也可易于使用用于核酸合成的方法(诸如本文所述的那些)来合成。
可选择标志物基因编码为在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。典型选择标记物基因编码(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素,例如氨苄青霉素(ampicillin)、四环素(tetracycline)或卡那霉素(kanamycin)的抗性;(b)弥补细胞的营养缺陷不足;或(c)供给不可从复合培养基或成分确定的培养基获得的关键营养物的蛋白质。特定可选择标记物是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是新霉素(neomycin)抗性基因也可用于在原核宿主细胞与真核宿主细胞两者中进行选择。
其它可选择基因可用于扩增将被表达的基因。扩增是其中为产生对生长或细胞存活关键的蛋白质所需的基因在连续多代重组细胞的染色体内串联重复的过程。适于哺乳动物细胞的可选择标记物的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下,其中仅转化体借助于载体中存在的可选择基因而唯一适应于存活。选择压力通过以下方式来施加:在其中连续增加培养基中的选择剂的浓度的条件下培养转化的细胞,由此导致扩增可选择基因与编码另一基因(诸如抗体重链或Fc融合蛋白)的DNA两者。因此,从扩增的DNA合成增加量的多肽,诸如重链或Fc融合蛋白。
核糖体结合位点通常为mRNA的翻译起始所必需,并且特征在于具有Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。所述元件通常位于启动子的3′和待表达的多肽的编码序列的5′。在某些实施方案中,一个或多个编码区可被可操作地连接于内部核糖体结合位点(IRES),从而允许从单一RNA转录物翻译两个开放阅读框。
在一些情况下,诸如当在真核宿主细胞表达***中需要糖基化时,可操作各种前序列或原序列以改进糖基化或产率。举例来说,可改变特定信号肽的肽酶裂解位点,或添加原序列,这也可影响糖基化。最终蛋白质产物可在-1位置(相对于成熟蛋白质的首个氨基酸)具有一个或多个与表达相伴的可尚未被完全移除的额外氨基酸。举例来说,最终蛋白质产物可具有一个或两个见于肽酶裂解位点中的连接于氨基末端的氨基酸残基。或者,如果酶在成熟多肽内的所述区域处切割,那么使用一些酶裂解位点可产生所需多肽的略微截短形式。
本发明的表达和克隆载体将通常含有由宿主生物体识别,并且可操作地连接于编码重链或Fc融合蛋白的分子的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即5′)的未转录序列(通常在约100至1000bp内),其控制所述结构基因的转录。启动子惯常被分组至以下两个类别中的一个:诱导性启动子和组成型启动子。诱导性启动子响应于培养条件的某一变化(诸如存在或不存在某一营养物或温度变化)来引发在它们的控制下从DNA转录的水平增加。另一方面,组成型启动子均一转录它们所可操作地连接的基因,也就是说少许控制或不控制基因表达。许多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。
适合与酵母宿主一起使用的启动子在本领域中也是熟知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。适合与哺乳动物宿主细胞一起使用的启动子是熟知的,并且包括但不限于从病毒的基因组获得的那些,所述病毒诸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛***状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒,并且最优选是猿猴病毒40(SV40)。其它适合哺乳动物启动子包括异源性哺乳动物启动子,例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可关注的其它启动子包括但不限于:SV40早期启动子(Benoist和Chambon,1981,Nature290:304-310);CMV启动子(Thornsen等,1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81:659-663);劳斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus)的3′长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等,1980,Cell22:787-797);疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-1445);来自金属硫蛋白(metallothionine)基因的启动子和调控序列(Prinster等,1982,Nature296:39-42);以及原核启动子,诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731);或tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2l-25)。也关注的是展现组织特异性,并且已用于转基因动物中的以下动物转录控制区:在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶(elastase)I基因控制区(Swift等,1984,Cell38:639-646;Ornitz等,1986,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald,1987,Hepatology7:425-515);在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature315:115-122);在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等,1984,Cell38:647-658;Adames等,1985,Nature318:533-538;Alexander等,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444);在睾丸细胞、***细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等,1986,Cell45:485-495);在肝中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等,1987,GenesandDevel.1:268-276);在肝中具有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等,1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648;Hammer等,1987,Science253:53-58);在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等,1987,GenesandDevel.1:161-171);在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等,1985,Nature315:338-340;Kollias等,1986,Cell46:89-94);在脑中的少突神经胶质细胞中具有活性的髓磷脂(myelin)碱性蛋白基因控制区(Readhead等,1987,Cell48:703-712);在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature314:283-286);和在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等,1986,Science234:1372-1378)。
增强子序列可被***载体中以增加通过高等真核生物进行的转录。增强子是DNA的顺式作用元件,长度通常约10-300bp,其作用于启动子以增加转录。增强子具有相对定向和位置非依赖性,其已见于转录单元的5′位置与3′位置两者处。可从哺乳动物基因获得的若干增强子序列是已知的(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而,通常使用来自病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。尽管增强子可在载体中位于编码序列的5′或3′,但它通常位于启动子的5′位点处。编码适当天然或异源性信号序列(前导序列或信号肽)的序列可被并入表达载体中以促进抗体或Fc融合蛋白的细胞外分泌。对信号肽或前导物的选择取决于待在其中产生蛋白质的宿主细胞的类型,并且异源性信号序列可替换天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能性的信号肽的实例包括以下:美国专利号4,965,195中所述的白介素(interleukin)-7(IL-7)的信号序列;Cosman等,1984,Nature312:768中所述的白介素-2受体的信号序列;EP专利号0367566中所述的白介素-4受体信号肽;美国专利号4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽;EP专利号0460846中所述的II型白介素-1受体信号肽。
载体可含有一种或多种当使载体整合至宿主细胞基因组中时有助于表达的元件。实例包括EASE元件(Aldrich等2003BiotechnolProg.19:1433-38)和基质附着区(MAR)。MAR介导染色质的结构组构,并且可使整合的载体与“位置”效应隔离。因此,当载体用于产生稳定转染子时,MAR特别适用。许多天然和合成含MAR核酸在本领域中是已知的,例如美国专利号6,239,328;7,326,567;6,177,612;6,388,066;6,245,974;7,259,010;6,037,525;7,422,874;7,129,062。
本发明的表达载体可由诸如可商购获得的载体的起始载体构建。所述载体可以或可以不含有全部所需侧接序列。当本文所述的一种或多种侧接序列未已存在于载体中时,它们可个别地加以获得,并且连接至载体中。用于获得各侧接序列的方法为本领域技术人员所熟知。
在已构建载体并且编码重链或Fc融合蛋白的核酸分子已***载体的适当位点中之后,所完成的载体可***适合宿主细胞中以达成扩增和/或多肽表达。将表达载体转化至所选宿主细胞中可通过熟知方法来实现,所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术。所选方法将部分地随待使用的宿主细胞的类型而变。这些方法和其它适合方法为熟练技术人员所熟知,并且例如阐述于Sambrook等,2001(上文)中。
当在适当条件下培养时,宿主细胞合成重链或Fc融合蛋白,其可随后从培养基收集(如果宿主细胞将它分泌至培养基中)或直接从产生它的宿主细胞收集(如果它未被分泌)。对适当宿主细胞的选择将取决于各种因素,诸如所需表达水平、合乎活性需要或为活性所必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的容易性。宿主细胞可为真核或原核细胞。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是熟知的,并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)获得的永生化细胞系,并且用于本领域中已知的表达***中的任何细胞系都可用于制备本发明的重组多肽。一般来说,用包含编码所需重链或Fc融合物的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。在可采用的宿主细胞之中的是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞以及哺乳动物来源的确定细胞系。适合哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7株系(ATCCCRL1651)(Gluzman等,1981,Cell23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物(诸如VeggieCHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(Rasmussen等,1998,Cytotechnology28:31))、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系、以及如由McMahan等,1991,EMBOJ.10:2821所述的源于非洲绿猴肾细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系(ATCCCCL70)、人胚肾细胞(诸如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源于体外培养原生组织、原生外植体的细胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地,当合乎需要地在各种信号转导或报道体测定中使用多肽时,诸如HepG2/3B、KB、NIH3T3或S49的哺乳动物细胞系例如可用于表达多肽。
或者,有可能在诸如酵母的低等真核生物中或在诸如细菌的原核生物中产生多肽。适合酵母包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克鲁维酵母菌株(Kluyveromycesstrain)、假丝酵母属(Candida)或能够表达异源性多肽的任何酵母菌株。适合细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或能够表达异源性多肽的任何细菌菌株。如果在酵母或细菌中制备多肽,那么可合乎需要地例如通过使适当位点磷酸化或糖基化来修饰其中产生的多肽以获得功能性多肽。所述共价连接可使用已知化学或酶促方法来实现。
也可通过使本发明的分离的核酸可操作地连接于适于一种或多种昆虫表达载体中的控制序列,以及采用昆虫表达***来产生多肽。用于杆状病毒/昆虫细胞表达***的材料和方法可以试剂盒形式从例如Invitrogen,SanDiego,Calif.,U.S.A.(试剂盒)商购获得,并且所述方法在本领域中是熟知的,如Summers和Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987);以及Luckow和Summers,Bio/Technology6:47(1988)中所述。无细胞翻译***也可用于使用源于本文公开的核酸构建体的RNA产生多肽。适于与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的克隆和表达载体由Pouwels等(CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,1985)描述。包含本发明的分离核酸,优选可操作地连接于至少一种表达控制序列的宿主细胞是“重组宿主细胞”。
药物组合物
本发明的多肽的改进的稳定性和降低的聚集特征致使它们特别适用于配制成药物组合物。所述组合物包含一种或多种其它组分,诸如生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。任选地,组合物另外包含一种或多种例如如下所述的生理活性剂。在各种特定实施方案中,除一种或多种本发明的抗体和/或Fc融合蛋白之外,组合物也包含一种、两种、三种、四种、五种或六种生理活性剂。
在一个实施方案中,药物组合物包含本发明的抗体和/或Fc融合蛋白以及一种或多种选自由以下组成的组的物质:缓冲剂、抗氧化剂(诸如抗坏血酸)、低分子量多肽(诸如具有少于10个氨基酸的多肽)、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(诸如EDTA、谷胱甘肽)、稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与同种血清白蛋白混合的盐水是适当稀释剂的实例。根据适当行业标准,也可添加诸如苯甲醇的防腐剂。可使用适当赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂来将组合物配制成冻干物。适合组分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。可用于药物制剂中的组分的其它实例呈递于Remington′sPharmaceuticalSciences,第16版(1980)和第20版(2000),MackPublishingCompany,Easton,PA中。
提供供医学从业者使用的试剂盒,其包括一种或多种本发明的抗体和/或Fc融合蛋白和治疗本文讨论的任何病状的标签或其它使用说明书。在一个实施方案中,试剂盒包括一种或多种抗体和/或Fc融合蛋白的无菌制剂,其可呈如上公开的组合物形式,并且可在一个或多个小瓶中。
施用剂量和频率可根据诸如以下的因素而变化:施用途径、所用特定抗体和/或Fc融合蛋白、待治疗的疾病的性质和严重性、病状是急性的抑或是慢性的、以及受试者的身材和一般状况。适当剂量可通过相关领域中已知的程序,例如在可涉及剂量逐步升高研究的临床试验中来确定。
本发明的抗体和/或Fc融合蛋白可例如被施用一次,或例如在定期间隔下历经一段时期施用一次以上。在特定实施方案中,历经一段时期,至少一个月一次或大于一个月一次,例如持续一个月、两个月或三个月或甚至无限期施用抗体和/或Fc融合蛋白。对于治疗慢性病状,长期治疗通常是最有效的。然而,对于治疗急性病状,持续例如1至6周的较短时期进行施用可为足够的。一般来说,施用抗体和/或Fc融合蛋白直至患者针对一个或多个所选指标表现出相比于基线在医学上有相关程度的改善。
如相关领域中所了解,包含本发明的抗体和/或Fc融合蛋白的药物组合物以适合于适应症的方式向受试者施用。药物组合物可通过任何适合技术,包括但不限于胃肠外、经表面或通过吸入来施用。如果注射,那么药物组合物可例如通过关节内、静脉内、肌肉内、病灶内、腹膜内或皮下途径,通过快速推注注射或连续输注来施用。涵盖例如在疾病或损伤的部位处进行的局部化施用,也涵盖经皮递送和从植入物持续释放。通过吸入来递送包括例如经鼻或经口吸入、使用雾化器、以气雾剂形式吸入抗体和/或Fc融合蛋白等。其它可选方案包括口服制剂,包括丸剂、糖浆或糖锭。
定义
除非本文另外定义,否则与本发明关联使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外,除非另外为上下文所需,否则单数术语将包括复数,并且复数术语将包括单数。通常,与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、以及蛋白质和核酸化学和杂交关联使用的命名法以及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域中熟知并通常使用的那些。除非另外指示,否则本发明的方法和技术通常根据本领域中熟知以及如本说明书整篇引用和讨论的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来执行。参见例如Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);和Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992);以及Harlow和LaneAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y(1990),其以引用的方式并入本文。根据制造商说明书,如本领域中通常所实现或如本文所述来执行酶促反应和纯化技术。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知并通常使用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和传递以及治疗患者。
除非另外指示,否则以下术语应被理解为具有以下含义:术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽、多核苷酸或抗体)是由于它的起源或获得来源而(1)不伴有在它的天然状态下伴随它的天然相伴组分,(2)大致上不含来自相同物种的其它分子,(3)由来自不同物种的细胞表达,或(4)不存在于自然界中的分子。因此,化学合成或在不同于它天然起源的细胞的细胞***中表达的分子将与它的天然相伴组分“分离”。也可通过使用本领域中熟知的纯化技术进行分离来致使分子大致上不含天然相伴组分。可通过本领域中熟知的许多手段来测定分子纯度或均质性。举例来说,可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及使用本领域中熟知的技术将凝胶染色以观察多肽来测定多肽样品的纯度。出于某些目的,可通过使用HPLC或本领域中熟知的其它纯化手段来提供较高分辨率。
使用标准一字母或三字母缩写来指示多核苷酸和多肽序列。除非另外指示,否则多肽序列的氨基末端在左侧,而羧基末端在右侧,并且单链核酸序列以及双链核酸序列的顶链的5′末端在左侧,而3′末端在右侧。特定多肽或多核苷酸序列也可通过说明它不同于参照序列的程度来描述。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”各自是指包含两个或更多个通过肽键彼此接合的氨基酸残基的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(诸如突变蛋白、变体和融合蛋白)以及翻译后或另外共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可为单体或聚合物。
如本文所用的术语“多肽片段”是指相较于相应全长蛋白质,具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段的长度可为例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸。片段的长度也可为例如至多1,000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段可在它的任一末端或两个末端进一步包含一个或多个其它氨基酸,例如来自不同天然存在的蛋白质的氨基酸序列或人工氨基酸序列。
本发明的多肽包括已以任何方式以及由于任何原因修饰,例如以(1)降低对蛋白水解的易感性,(2)降低对氧化的易感性,(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力,(4)改变结合亲和力,以及(4)赋予或改进其它物理化学或功能性质的多肽。类似物包括多肽的突变蛋白。举例来说,可在天然存在的序列中(例如在多肽的处于形成分子间接触的结构域的外部的部分中)进行单一或多个氨基酸取代(例如保守性氨基酸取代)。“保守性氨基酸取代”是不实质上改变亲本序列的结构特征的取代(例如置换氨基酸不应倾向于破坏存在于亲本序列中的螺旋或破坏表征亲本序列或为它的功能性所必需的其它类型的二级结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton编,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.Branden和J.Tooze编,GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));以及Thornton等Nature354:105(1991)中,所述参考书目和文献各自以引用的方式并入本文。
多肽的“变体”包含其中相对于另一多肽序列,一个或多个氨基酸残基被***氨基酸序列中,从氨基酸序列缺失和/或取代至氨基酸序列中的氨基酸序列。本发明的变体包括包含变异CH2或CH3结构域的变体。在某些实施方案中,变体包含一个或多个当存在于Fc分子中时使多肽对一种或多种FcγR的亲和力增加的突变。所述变体显示增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。提供所述性质的变体的实例描述于美国专利号7,317,091中。
其它变体包括使含有CH3结构域的多肽同二聚的能力降低,同时使异二聚的能力增加的变体。所述Fc变体的实例描述于美国专利号5,731,168和7,183,076中。其它实例描述于共同拥有的美国临时申请61/019,569(1/7/08提交)和61/120,305(12/5/08提交)(两者均以引用的方式整体并入本文)中。
多肽的“衍生物”是已例如通过缀合于另一化学部分(例如像聚乙二醇、细胞毒性剂、白蛋白(例如人血清白蛋白))、磷酸化和糖基化而被化学修饰的多肽(例如抗体)。除非另外指示,否则除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体之外,术语“抗体”也包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白,其实例在本文中加以描述。
含有CH3结构域的多肽可例如具有天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是一种四聚分子。在天然存在的免疫球蛋白中,各四聚体由两对相同多肽链组成,各对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括具有约100至110或更多个氨基酸,主要负责抗原识别的可变区。各链的羧基末端部分界定主要负责效应物功能的恒定区。人轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε,并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区由具有约12或更多个氨基酸的“J”区接合,其中重链也包括具有外加约10个氨基酸的“D”区。大体上参见FundamentalImmunology第7章(Paul,W.编,第2版RavenPress,N.Y.(1989))(出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。各对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点以致完整免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然存在的免疫球蛋白链展现由也称为互补决定区或CDR的三个高变区接合的相对保守框架区(FR)的相同一般性结构。从N末端至C末端,轻链与重链两者均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对各结构域的氨基酸指定根据Kabat等在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,USDept.ofHealthandHumanServices,PHS,NIH,NIH出版号91-3242,1991中的定义。完整抗体包括具有全长重链和轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化或完全人抗体。
抗体可具有一个或多个结合位点。如果存在超过一个结合位点,那么结合位点可彼此相同,或可不同。举例来说,天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同结合位点,而“双特异性”或“双功能性”抗体具有两个不同结合位点。
术语“人抗体”包括具有一个或多个源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中,所有可变结构域和恒定结构域都源于人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以多种方式制备,以下描述所述方式的实例,包括通过用目标抗原使被遗传修饰来表达由人重链和/或轻链编码基因产生的抗体的小鼠免疫。一种或多种编码人重链的基因可被改变来含有Ser362突变。当所述小鼠用抗原免疫时,小鼠将产生具有Ser364突变的人抗体。
人源化抗体具有因一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而与源于非人物种的抗体的序列不同的序列,以使相较于非人物种抗体,人源化抗体在它向人受试者施用时,诱导免疫应答的可能性较小,和/或诱导严重度较小的免疫应答。在一个实施方案中,非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸被突变以产生人源化抗体。在另一实施方案中,使来自人抗体的恒定结构域融合于非人物种的可变结构域。如何制备人源化抗体的实例可见于美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293中。
术语“嵌合抗体”是指含有一个或多个来自一种抗体的区域以及一个或多个来自一种或多种其它抗体的区域的抗体。在嵌合抗体的一个实例中,重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体相同、同源或源于所述抗体,而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体相同、同源或源于所述抗体。也包括所述抗体的展现所需生物活性的片段。
抗体的片段或类似物可易于由本领域普通技术人员遵循本说明书的教导以及使用本领域中熟知的技术制备。片段或类似物的优选氨基和羧基末端存在于功能性结构域的边界附近。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构性和功能性结构域。
计算机化比较方法可用于鉴定存在于结构和/或功能已知的其它蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。
用以鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见例如Bowie等,1991,Science253:164。
“CDR移植抗体”是包含一个或多个源于特定物种或同种型的抗体的CDR以及相同或不同物种或同种型的另一抗体的框架的抗体。
“多特异性抗体”是识别一种或多种抗原上的超过一个表位的抗体。这个类型的抗体的一个子类是“双特异性抗体”。
通过使用GAP计算机程序(10.3版GCGWisconsin程序包(Accelrys,SanDiego,CA)的一部分),利用它的缺省参数比较序列来确定两个多核苷酸或两个多肽序列的“同一性百分比”。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可整篇互换使用,并且包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)及其杂交物。核酸分子可为单链或双链。在一个实施方案中,本发明的核酸分子包含编码抗体或Fc融合物及其衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。
如果两个单链多核苷酸的序列可在不引入空位以及在任一序列的5′或3′末端无未配对核苷酸的情况下以反平行取向对齐,以使一个多核苷酸中的每个核苷酸与另一多核苷酸中它的互补核苷酸相对,那么它们是彼此的“互补序列”。如果两个多核苷酸可在中等严格条件下杂交于彼此,那么一个多核苷酸“互补”于另一多核苷酸。因此,多核苷酸可互补于另一多核苷酸,而并非是它的互补序列。
“载体”是可用于将与它连接的另一核酸引入细胞中的核酸。一种类型的载体是“质粒”,其是指可将其它核酸区段连接至其中的线性或环状双链DNA分子。另一类型的载体是病毒载体(例如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),其中其它DNA区段可被引入病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如包含细菌复制起点的细菌载体和游离性哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离性哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后被整合至宿主细胞的基因组中,并且由此连同宿主基因组一起复制。“表达载体”是一种类型的载体,其可引导所选多核苷酸的表达。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如表达水平、时序或位置),那么核苷酸序列“可操作地连接”于调控序列。“调控序列”是影响它所可操作地连接的核酸的表达(例如表达水平、时序或位置)的核酸。调控序列可例如直接或通过一种或多种其它分子(例如结合调控序列和/或核酸的多肽)的作用来对受调控核酸施加它的作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。调控序列的其它实例例如描述于Goeddel,1990,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA以及Baron等,1995,NucleicAcidsRes.23:3605-06中。
“宿主细胞”是可用于表达核酸,例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物,例如大肠杆菌,或它可为真核生物,例如单细胞真核生物(例如酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。示例性宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或它们的衍生物,包括缺乏DHFR的CHO品系DXB-11(参见Urlaub等,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-20)、在无血清培养基中生长的CHO细胞系(参见Rasmussen等,1998,Cytotechnology28:31)、CS-9细胞(DXB-11CHO细胞的衍生物)、以及AM-l/D细胞(描述于美国专利号6,210,924中)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)和UV20(ATCC#CRL-1862)。其它宿主细胞的实例包括猴肾细胞的COS-7株系(ATCCCRL1651)(参见Gluzman等,1981,Cell23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL70)(参见McMahan等,1991,EMBOJ.10:2821)、人胚肾细胞(诸如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源于体外培养原生组织、原生外植体的细胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。通常,宿主细胞是可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞,所述核酸可接着在所述宿主细胞中表达。
短语“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含核酸,但除非将调控序列引入宿主细胞中以使它变得与所述核酸可操作地连接,否则不在所需水平下表达所述核酸的细胞。应了解术语宿主细胞不仅是指特定主题细胞,而且是指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于例如突变或环境影响而发生在继代中,所以所述子代可能实际上不与亲本细胞相同,但仍然被包括在如本文所用的所述术语的范围内。
实施例
以下实施例(包括进行的实验和获得的结果)仅出于说明目的而提供,并且不应解释为限制本发明。
实施例1
制备半胱氨酸钳夹构建体
使具有电荷对(缺失铰链)半胱氨酸钳夹Fc序列的肽融合物在无血清悬浮适应的CHO-K1细胞系中稳定表达。将Fc融合分子克隆至含有嘌呤霉素抗性的稳定表达载体中,而将Fc链克隆至含有潮霉素的表达载体(Selexis,Inc.)中。使用转脂胺LTX在1∶1比率下转染质粒,并且在转染后2天在含有10ug/mL嘌呤霉素和600ug/mL潮霉素的生长培养基中选择细胞。在选择期间,每周更换培养基2次。当细胞达到约90%活力时,将它们按比例扩大以进行分批补料生产操作。将细胞在1e6/mL下接种于生产培养基中,并且在第3、6和8天补料。在第10天收集通过细胞产生的条件培养基(CM),并且使其澄清。终点活力通常高于90%。
使用两步色谱法程序纯化Fc融合物澄清条件培养基。将约5LCM直接施加至先前已用杜贝卡氏(Dulbecco's)磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的GEMabSelectSuRe柱。结合的蛋白质经受三步洗涤:首先,3个柱体积(CV)的PBS;其次,1CV的20mMTris、100mM氯化钠,pH7.4;以及最后,3CV的500mML-精氨酸,pH7.5。这些洗涤步骤移除未结合或轻微结合的培养基组分和宿主细胞杂质。接着用5CV的20mMTris、100mM氯化钠在pH7.4下使柱再平衡,此使UV吸光度回到基线。所需蛋白质用100mM乙酸在pH3.6下洗脱,并且大批收集。蛋白质汇集物用1MTris-HCl(pH9.2)快速滴定至5.0至5.5的pH范围内。
接着将pH调整的蛋白质汇集物装载于先前已用20mMMES在pH6.0下平衡的GESP琼脂糖HP柱上。结合的蛋白质接着用5CV的平衡缓冲液洗涤,并且最后历经20CV、0至50%线性梯度(含0至400mM氯化钠的20mMMES)在pH6.0下洗脱。在洗脱期间收集级分,并且通过分析型尺寸排阻色谱法(Superdex200)来分析以确定适于汇集以获得均质产物的级分。SPHP色谱法移除产物相关杂质,诸如游离Fc、剪切的物质和Fc-GDF15多聚体。
SPHP汇集物接着通过透析来进行缓冲液交换以进入配制缓冲液中。使用SartoriusVivaspin2010千道尔顿分子量截断离心装置将它浓缩成约15mg/ml。最后,将它无菌过滤,并且含有纯化Fc融合分子的所得溶液被储存在5℃下。使用质谱分析、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳和尺寸排阻高效液相色谱法评估最终产物的身份和纯度。
实施例2
分析半胱氨酸钳夹构建体
二硫键形成
如上所述表达和纯化缺乏铰链区并且具有L351C突变的Fc融合蛋白。
通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析样品。具有不同分子量的构建体在SDS-PAGE上具有不同移动性。这有助于鉴定相关链。在图3中,最后一个泳道对应于其中二硫键被破坏的还原条件,而其它泳道对应于来自纯化过程的各种级分的非还原条件。在非还原条件下,二硫化物保持完整。在非还原条件下观察到条带较高说明的确形成在CH3结构域处通过二硫键在两个Fc链之间引入的共价连接。并且图3中的末个泳道说明在还原条件下,工程改造的二硫化物如所预期破裂,从而导致双重条带。
药代动力学分析
比较六个缺乏铰链区的Fc融合蛋白构建体(A-F)。
A.缺乏铰链,并且在治疗性肽与Fc之间无接头的Fc融合物。
B.与A相同,例外之处是在治疗性肽内具有变化。
C.与B相同,例外之处是非糖基化接头使Fc连接于治疗性肽。
D.与C相同,例外之处是具有不同接头。
E.与A相同,例外之处是一个Fc链包含Y349C取代,而另一链包含S354C取代。
F.与B相同,例外之处是一个Fc链包含Y349C取代,而另一链包含S354C取代。
通过尾部静脉在1mg/kg的剂量下向雄性饮食诱导的肥胖CD-1小鼠(n=每个测试品3只)静脉内施用测试品。在以下时间点从各动物收集连续血液样品(每个时间点50uL):给药后1、4、8、24、72、168、240和336小时。使用利用抗测试品抗体来捕集和检测的夹心式ELISA定量血清样品中的测试品浓度。测定的定量下限是313ug/L。绘制浓度-时间曲线,并且使用Watson进行非区室分析以计算PK参数。
如图4中所见,在六个测试变体之中,半胱氨酸钳夹变体E和F具有最低总体全身性清除率,并且相应地,具有最高暴露量(表示为浓度-时间曲线下面积,AUC)。E显示的AUC比非半胱氨酸钳夹形式A高>3倍,而F显示在AUC方面相比于B改进1.6倍。因此,通过将二硫键引入CH3界面中,显著改进了缺乏铰链区的Fc融合蛋白的药代动力学性质。
Claims (22)
1.一种包含抗体Fc区的多肽,所述Fc区包含铰链区的一个或多个半胱氨酸的缺失或取代,以及一个或多个CH3界面氨基酸被含有巯基的残基取代。
2.如权利要求1所述的多肽,其中所述Fc缺乏所述铰链区的含有半胱氨酸的部分。
3.如权利要求2所述的多肽,其中所述Fc缺乏所述铰链区。
4.如权利要求1所述的多肽,其中所述铰链区内的所有半胱氨酸都被取代成另一氨基酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的多肽,其中被含有巯基的残基取代的CH3界面氨基酸是Y349、L351、S354、T394或Y407。
6.如权利要求5所述的多肽,其中Y349被半胱氨酸取代(Y349C)。
7.如权利要求5所述的多肽,其中L351被半胱氨酸取代(L351C)。
8.如权利要求5所述的多肽,其中S354被半胱氨酸取代(S354C)。
9.如权利要求5所述的多肽,其中T394被半胱氨酸取代(T394C)。
10.如权利要求5所述的多肽,其中Y407被半胱氨酸取代(Y407C)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的多肽,其中所述Fc包含含有一个或多个氨基酸取代的CH2区。
12.如权利要求1至11中任一项所述的多肽,其中所述CH3区进一步包含一个或多个其它氨基酸取代。
13.如权利要求1至12中任一项所述的多肽,其中所述Fc的C末端的一个或多个氨基酸缺失。
14.如权利要求13所述的多肽,其中所述Fc的C末端的三个、两个或一个氨基酸缺失。
15.如权利要求14所述的多肽,其中所述Fc的C末端的末端氨基酸缺失。
16.如权利要求1至15中任一项所述的多肽,其中所述多肽包括抗体重链。
17.如权利要求1至15中任一项所述的多肽,其中所述多肽包括Fc融合蛋白。
18.一种核酸,其编码如权利要求1至17中任一项所述的多肽。
19.一种表达载体,其包含可操作地连接于启动子的如权利要求18所述的核酸。
20.一种宿主细胞,其包含如权利要求19所述的表达载体。
21.一种制备多肽的方法,所述方法包括:
a)在其中所述启动子在所述宿主细胞中具有活性的条件下培养如权利要求20所述的宿主细胞;以及
b)从培养物分离所述多肽。
22.一种药物组合物,其包含如权利要求1至17中任一项所述的多肽。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109021109A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-12-18 | 上海交通大学 | 一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法 |
CN110234355A (zh) * | 2017-02-01 | 2019-09-13 | 时迈药业 | 单体人IgG1 Fc和双特异性抗体 |
WO2022032660A1 (zh) * | 2020-08-14 | 2022-02-17 | 武汉友微生物技术有限公司 | 新型冠状病毒rbd融合蛋白 |
CN114426974A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白及由其制备的试剂盒和抗体 |
WO2023025120A1 (en) * | 2021-08-24 | 2023-03-02 | Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. | Gdf15 fusion proteins and uses thereof |
CN116970059A (zh) * | 2016-12-22 | 2023-10-31 | 库尔生物制药有限公司 | T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2862516C (en) | 2012-03-27 | 2023-02-14 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
US9161966B2 (en) | 2013-01-30 | 2015-10-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | GDF15 mutein polypeptides |
WO2014120619A2 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use in treating metabolic disorders |
CN106573966B (zh) | 2014-07-30 | 2022-03-01 | Ngm生物制药有限公司 | 用于治疗代谢异常的组合物和方法 |
CA2961587A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
CA2966776C (en) | 2014-12-19 | 2021-05-04 | Alkermes, Inc. | Single chain fc fusion proteins |
MY185014A (en) | 2015-08-07 | 2021-04-30 | Alx Oncology Inc | Contructs having a sirp-alpha domain or variant thereof |
EP3463451A1 (en) | 2016-05-26 | 2019-04-10 | Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation | Mixtures of antibodies |
US10335459B2 (en) | 2016-06-22 | 2019-07-02 | Alkermes, Inc. | Compositions for modulating IL-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties |
US20200157172A1 (en) * | 2017-07-07 | 2020-05-21 | HANMl PHARM. CO., LTD. | Novel therapeutic enzyme fusion protein and use thereof |
WO2019035010A1 (en) * | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Kindred Biosciences, Inc. | IGG VARIANTS FOR VETERINARY USE |
CN107540748B (zh) * | 2017-09-15 | 2020-07-14 | 北京伟杰信生物科技有限公司 | 长效重组猪fsh融合蛋白及其制备方法与应用 |
JP7403455B2 (ja) * | 2017-12-22 | 2023-12-22 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 新規な構造を有する治療学的酵素融合タンパク質及びその用途 |
TWI724392B (zh) | 2018-04-06 | 2021-04-11 | 美商美國禮來大藥廠 | 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法 |
MA53330A (fr) | 2018-08-03 | 2021-06-09 | Amgen Inc | Constructions d'anticorps pour cldn18.2 et cd3 |
KR102148405B1 (ko) * | 2018-09-19 | 2020-08-27 | 주식회사 바이오앱 | 돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 |
US10947278B2 (en) * | 2018-09-19 | 2021-03-16 | Bioapplications Inc. | Recombinant vector comprising porcine FC fragment and preparation method of recombinant protein using thereof |
KR102200773B1 (ko) * | 2018-09-19 | 2021-01-12 | 주식회사 바이오앱 | 돼지의 Fc 단편과 융합된 항원 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
US20220144916A1 (en) * | 2019-02-12 | 2022-05-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | High affinity engineered t-cell receptors targeting cmv infected cells |
CA3141130A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | ALX Oncology Inc. | Methods of treating cancer with sirp alpha fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor |
AU2020289474A1 (en) | 2019-06-07 | 2021-12-23 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
EP4093771A1 (en) | 2020-01-22 | 2022-11-30 | Amgen Research (Munich) GmbH | Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof |
JP7481856B2 (ja) * | 2020-02-25 | 2024-05-13 | シスメックス株式会社 | 改変抗体及びその製造方法、並びに抗体の熱安定性を向上させる方法 |
CN111285936A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-06-16 | 北京双赢科创生物科技有限公司 | 靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用 |
TW202200615A (zh) | 2020-03-12 | 2022-01-01 | 美商安進公司 | 用於治療和預防患者的crs之方法 |
US20220017636A1 (en) | 2020-05-19 | 2022-01-20 | Amgen Inc. | Mageb2 binding constructs |
AU2021368272A1 (en) * | 2020-11-02 | 2023-06-08 | Attralus, Inc. | Sap fc fusion proteins and methods of use |
IL302586A (en) | 2020-11-06 | 2023-07-01 | Amgen Res Munich Gmbh | Polypeptide selectively binds to CLDN6 and CD3 |
JP2023552375A (ja) * | 2020-12-06 | 2023-12-15 | エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド | 血清学的アッセイにおいてcd47に結合する薬物の干渉を低減するための多量体 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070098712A1 (en) * | 1997-05-02 | 2007-05-03 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
WO2011063348A1 (en) * | 2009-11-23 | 2011-05-26 | Amgen Inc. | Monomeric antibody fc |
CN102643344A (zh) * | 2003-07-26 | 2012-08-22 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | 结合构建体及其使用方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4213224B2 (ja) * | 1997-05-02 | 2009-01-21 | ジェネンテック,インコーポレーテッド | ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法 |
US20030207346A1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-11-06 | William R. Arathoon | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US7754209B2 (en) * | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
AU2005282700A1 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Genentech, Inc. | Heteromultimeric molecules |
JP5525729B2 (ja) * | 2005-11-28 | 2014-06-18 | ゲンマブ エー/エス | 組換え一価抗体およびその作製方法 |
SI3156420T1 (sl) * | 2010-12-06 | 2019-05-31 | Seattle Genetics, Inc. | Humanizirana protitelesa za LIV-1 in njihova uporaba pri zdravljenju raka |
-
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-
2020
- 2020-01-17 AU AU2020200329A patent/AU2020200329A1/en not_active Abandoned
- 2020-09-25 JP JP2020160475A patent/JP7344858B2/ja active Active
-
2022
- 2022-02-22 AU AU2022201204A patent/AU2022201204A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070098712A1 (en) * | 1997-05-02 | 2007-05-03 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
CN102643344A (zh) * | 2003-07-26 | 2012-08-22 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | 结合构建体及其使用方法 |
WO2011063348A1 (en) * | 2009-11-23 | 2011-05-26 | Amgen Inc. | Monomeric antibody fc |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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