CN105651868A - 体外用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种在体外利用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致急性肾损伤标志物的方法。采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色法确定致肾细胞明显损伤的有效剂量。采用超高效液相色谱-质谱联用技术对肾细胞代谢物进行分析得到其代谢轮廓；然后采用多变量统计方法分析正常组和药物损伤组的代谢轮廓数据，结合代谢物随药物作用时间的变化规律，筛选潜在肾毒性标志物。筛选的标志物预测性能好。外部验证的平均正确率达90％以上。本方法全面、综合的体现了正常肾细胞在药物损伤下的代谢产物的变异情况，可用于药物致肾毒性的早期诊断或为药物的安全性评价提供技术支持。

Description

体外用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法

技术领域

本发明涉及分析化学和医药化学领域，还涉及代谢组学，特别是基于液相色谱质谱联用技术的代谢组学；具体的说是一种在体外利用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法。

背景技术

马兜铃酸(AA)是存在于马兜铃属植物中的一种重要化学成分，含有马兜铃酸的中药主要用于治疗关节炎、痛风、风湿病以及溃脓创伤。然而，近10年来，由于服用广防己(马兜铃属)引起严重肾毒性的案例达100多例。研究表明，马兜铃酸是引发肾毒性的主要因素，其机理主要是马兜铃酸与体内的DNA形成加合物，诱导A:T基因的突变。基因突变势必会引起下游相关代谢物的变化。目前临床上还没有统一的诊断标准，组织切片，AA-DNA加合物的检测是通常使用的诊断方法。开发新的诊断和预测肾损伤程度的标志物势在必行。

代谢组学作为***生物学的最下游，能够更准确的反应生物体系的状态。在代谢组学分析的各种手段中，液相色谱质谱联用技术以其高分离度、高通量以及普适性的优势，在众多分析方法中脱颖而出，尤其对于非靶向代谢组学分析，其强大的定性分析能力被认为是最好的复杂生物样品的分析技术之一。代谢组学在药物安全性评价，毒性标志物识别方面具有广阔的应用前景.研究模型主要是动物模型，例如，AimingLiu等应用小鼠模型分析了降脂药二甲苯庚酸诱发肝毒性的潜在标志物。JingMa应用小型猪模型发现了半乳糖胺诱导急性肝损伤的生物标志物。然而，应用代谢组学方法研究体外细胞损伤模型中代谢物差异的报道却相对较少。

细胞模型与动物模型相比，具有成本低、种属差异小临床转化相对简单等优点。申请者应用人源化肾细胞研究了马兜铃酸致肾损伤进展过程中的差异代谢物。由于生物样品的复杂性，仪器本身存在的不稳定性及分析序列过长导致质谱响应产生一定的偏差，都会为后续的数据建模带来困难。针对以上情况，我们采用总蛋白校正，样本概率商归一化(PQN)及质量控制样本(QC)校正实验偏差，以保证实验数据的可靠性。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于超高效液相色谱质谱联用技术利用体外细胞模型筛选马兜铃酸致肾毒性潜在标志物的方法，该方法具有高灵敏度、高通量的优点。所筛选的潜在标志物预测性好，可以为中药致肾毒性的临床诊断提供参考。

一种从胞内代谢轮廓筛选肾毒性发生发展过程中潜在标志物的方法，应用代谢组学方法研究体外细胞损伤模型中代谢物差异，

具体步骤如下：

(1)确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量；

(2)对正常肾细胞、马兜铃酸药物损伤肾细胞的胞内代谢物进行分析得到胞内代谢轮廓；

(3)应用多变量统计方法分析正常细胞和马兜铃酸药物损伤细胞的代谢轮廓数据，结合代谢物随药物作用时间的变化规律，筛选标志物。

步骤(1)使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色法确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量，细胞明显损伤指同等培养条件下马兜铃酸诱导损伤实验组细胞数目与正常组细胞数目相比，具有显著性差异，P<0.5，能够导致这种明显损伤的马兜铃酸剂量即为马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量，采用人源化正常肾细胞HL7702作为体外研究马兜铃酸致肾毒标志物的模型，建立了马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量的确定方法：

将悬浮于K-SFM细胞培养基中HK-2细胞等量接种于96孔板中(104-105个/孔)。过夜贴壁后，去掉原有培养基，实验组分别加入150ul-250ul0.3125,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80μg/ml浓度的马兜铃酸，马兜铃酸水溶液采用K-SFM细胞培养基进行稀释。每个剂量设计3-6个平行孔，平行设置不加药，只加等体积培养基的细胞控制组(对照组)和不接种细胞，只加等体积培养基的空白组。培养24h-48h后，加入15-20ul含5mg/mlMTT的磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，避光培养3-5h,弃去培养液，加150ul-200ulDMSO，震荡300-500s,静止10-30s,酶标仪检测496-570nm波长下的吸光度(OD)。细胞抑制率按照以下公式计算得出：

抑制率＝(控制组吸光度-给药组吸光度)/(控制组吸光度-空白组吸光度)×100％

对各组数据进行双尾T检验，P值小于0.05认为是马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量，实验中得到的有效剂量为大于20μg/ml。

步骤(2)所述正常肾细胞为人源化正常肾细胞HL7702；所述马兜铃酸药物损伤肾细胞为采用兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量诱导损伤的人源化正常肾细胞HL7702，损伤作用时间为6-24h；步骤(2)使用超高效液相色谱-质谱联用技术对胞内代谢物进行分析。

建立了一套细胞样本采集和处理的规范化流程。所有细胞样本的采集步骤是相同的，最大程度减少在样品采集阶段引入的人为误差。该流程的具体步骤为：细胞刮刮取正常组细胞,药物作用24h以及中间两个时间点的(n×4)个细胞样品(约10-100mg)分别置于1.5ml离心管中，1000-1200rpm离心5分钟得细胞饼即为所需细胞样品；细胞样品重悬于1-1.5ml甲醇/水(体积比4:1)溶液，用超声细胞破碎仪冰上裂解细胞，裂解功率：15％-25％，超声时间：5-8s，间隔时间8-10s，总超声时间：3-5min。得到的细胞裂解液0-4℃、12000-15000rpm离心10-15分钟，上清液冻干复溶于100-300ul体积的水/甲醇v/v为1/4-1/2的溶液中。得n×4个样本。其中n为每组平行试验的数量，为大于或等于6的正整数；对n×4个样本一次进行超高效液相色谱-质谱联用技术分析，条件如下：

液相条件为：色谱柱为AgilentEclipseplusC18柱，柱温40-60℃，进样量1-10μL，流动相A为体积浓度0.1％-0.2％的甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件：0-3min，5％B相线性变化到50％，3-15min，线性变化到100％B相并保持5min，再切换到5％B相并保持5min；流速0.3ml/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱***检测；

质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；喷雾器流量为8-10L/min，喷雾气温度为300-350℃，毛细管电压为3500-4000V，进样锥电压为30-40V；采集数据的频率为每秒一张谱图；质量采集范围m/z100-1000，获得被分析样本的总离子流图；最终得到n×4个样本的总离子流图，即为肾细胞内代谢轮廓谱。

同时，为了确保数据的可靠性，于n×4个样本中随机抽取一个样品或两个以上样品的混合物为质量控制样本(QC)，作为质谱检测过程中的质量控制标准，在对n×4样品依次进行质谱分析过程中，先将QC样进样3-5次稳定***，然后每分析6-10个样本，再将QC样进样一次，通过分析QC样总离子流图，监控实验过程中的***偏差；另外，取细胞裂解液10-20μL，采用蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量，给药组与对照组样品的蛋白总量相除得出总蛋白差异系数，给药组各色谱峰面积除以此系数将给药组细胞数目校正到对照组的细胞数目，即可校正由于细胞数目的微小差异所造成的代谢谱强度的差异。

步骤(3)所述多变量统计方法为偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)方法；具体步骤为：采用R语言对n×4个样本的胞内代谢轮廓谱进行峰提取，峰匹配，生成一个数据矩阵，具体程序代码如下：

setwd("F:/experiment/software/R")

source("d2mzXML.r")

d2mzXML("v1/","v2/")

path<-system.file("v2/",package＝"R/")

list.files(path,recursive＝TRUE)

library(xcms)

xset<-xcmsSet("v2/",method＝"centWave",ppm＝20,peakwidth＝c(5,20))

xset<-group(xset,bw＝15,minfrac＝0.5,minsamp＝1,mzwid＝0.25,max＝50,sleep＝0)

xset2<-retcor(xset,family＝"symmetric",plottype＝"mdevden")

xset2<-group(xset2,bw＝10,minfrac＝0.5,minsamp＝1,mzwid＝0.25,max＝50,sleep＝0)

xset3<-fillPeaks(xset2)

reporttab<-diffreport(xset3,"1","2","example",metlin＝0.15)

write.table(reporttab,"v5.csv",sep＝',')。

数据矩阵采用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)方法进行多元统计分析，对肾细胞不同损伤程度的代谢谱数据进行建模，根据模型中变量重要性因子筛选大于等于1.5的检测离子。结合这些离子在肾损伤进展过程中变化规律，进一步筛选呈单一性变化(升高或者下降)的离子，可被认为是在马兜铃酸致肾损伤过程中的潜在标志物。

最后要对筛选出的潜在标志物进行外部样本验证，采用感受曲线(ROC)下面积(AUC)对其预测准确度进行评估，AUC通常在0.5到1之间，AUC＞0.5的情况下，AUC越接近1，说明预测准确度越好，AUC<0.5不符合真实情况；然后对筛选出的标志物进行结构鉴定。

代谢组学已经成为标志物检测的研究热点。越来愈多的研究表明分子量小于1000的内源性小分子代谢物更加具有早期诊断价值。本发明具有以下优点：

1)在临床样本获取困难的情况下，较动物实验具有成本低、种属差异小临床转化难度小等优点；

2)肾细胞损伤模型的诱导，细胞样品的采集、储存和预处理采用统一的自主建立的标准化程序，避免引入认为误差。采用超高效液相色谱质谱技术的代谢组学研究平台，具有高分离度，高灵敏度和高通量的优点。

3)除PLS-DA模型之外，结合时间依赖分析方法，筛选与毒性进展相关性强的标志物，更具有实际应用价值。

附图说明

图1马兜铃酸对肾细胞的抑制率曲线。*：p<0.05。

图2PLS-DA模型(a)得分图。三角形为正常组，圆点为药物诱导6h组，正方形为诱导12h组，菱形为诱导24h组。(b)模型验证结果，右上角两个点代表真实Q2和R2值，左边的每个点代表每次预测模型的值。采用交叉验证100次，得出的预测值均小于真实值，并且Q2直线截距小于零，表明模型的有效性。

图3重要性因子大于1.5的代谢物变化趋势类型(a)随时间单一性升高。(b)随时间单一性下降。(c)非单一性变化。图a和图b的变化趋势与肾细胞损伤的严重程度成比例，更符合标志物的特征，而c类变化趋势不规律，不适合作为肾毒性进展标志物。

图4潜在标志物预测能力。(a)单一标志物感受曲线(ROC)，曲线下面积(AUC)为0.889。(b)多个标志物联合建立模型的预测准确度，横坐标数字代表通过Monte-Carlo交叉验证筛选出的重要变量的个数。

具体实施方式

现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

1、马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量研究

将悬浮于K-SFM培养基中的人源化正常肾细胞HL7702等量接种于96孔板中(104个/孔),每孔加入K-SFM细胞培养基200ul,置于37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中。过夜，去除原有培养基，分别加入200ul0.312,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80μg/ml浓度的马兜铃酸，马兜铃酸水溶液采用K-SFM细胞培养基进行稀释。每个剂量设计3个平行孔，平行设置不加药，只加等体积培养基的细胞控制组(对照组)和不接种细胞，只加等体积培养基的空白组。置于37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24h后，每孔加入20μL5mg/mlMTT的磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，避光培养4h,弃去培养液，加200μLDMSO，震荡300s,静止30s,酶标仪检测570nm波长下的吸光度(OD)。细胞抑制率按照以下公式计算得出：

抑制率＝(控制组吸光度-给药组吸光度)/(控制组吸光度-空白组吸光度)×100％

对各组数据进行双尾T检验，P值小于0.05认为有明显细胞抑制剂量(图1)，选取有效剂量40μg/ml进行24h肾细胞损伤代谢谱差异研究。

2、样品采集

将肾细胞接种于6孔板中(106个/孔)，每孔加入K-SFM细胞培养基2ml,置于37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中,过夜，去除原有培养基，加入2ml马兜铃酸终浓度为40μg/ml的K-SFM培养基，平行设置不加药，只加等体积K-SFM培养基的对照组。将细胞放置于37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养。在培养时间6h，12h，24h时间点分别采用细胞刮刮取细胞样品(每个时间点6个平行样，共24个样品)分别置于1.5ml离心管中，1000rpm离心5min得细胞饼约10mg/个，存于-80℃冰箱备用。

3、分析方法

3.1细胞样本预处理

细胞样品从冰箱取出，室温解冻。加入1ml甲醇/水(v/v为4:1)溶液，吹打均匀，使其充分混合。用超声细胞破碎仪进行冰上裂解提取胞内代谢物。提取参数：超声功率，25％；超声时间，5s；间隔时间，8s，总时间3min。取20μL裂解液用于总蛋白定量。其他与4℃恒温15000rpm离心10min。取上清，冻干机冻干。分析前用100μL体积分数50％甲醇水溶液复溶。

3.2超高效液相色谱质谱分析

(1)色谱条件：色谱柱为AgilentEclipseplusC18柱(2.1mmi.d.×50mm，1.7μm)，柱温50℃，进样量5μL，流动相A为体积浓度0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件：0-3min，5％B相线性变化到50％，3-15min，线性变化到100％B相并保持5min，再切换到5％B相并保持5min；流速0.3ml/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱***检测；

(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；喷雾器流量为8L/min，喷雾气温度为350℃，毛细管电压为3500V，进样锥电压为40V；采集数据的频率为每秒一张谱图；质量采集范围m/z100-1000，采用322.0481和922.0098作为质谱的锁定质量溶液，获得被分析样本的总离子流图；

取24个样品溶液各20μL混合作为质控样本(QC)，在对24个样本分析过程中，先将QC进样4次，然后每分析6个样本，再将QC进样一次。通过分析QC样总离子流图，来监测实验过程中仪器是否有较大偏差，确保数据可靠性。

遵照以上原则，获得马兜铃酸损伤肾细胞过程中的胞内代谢物谱。对3个时间点及正常组代谢物进行分析。样品分析顺序采用随机方式，分析序列中设置QC样。结果表明，在分析时间内，QC样的稳定性良好，没有出现明显的组分变化，可知所有样品在分析的过程中是稳定的，仪器也没有发生较大的漂移现象，可以确保数据的可靠性。

4、模式识别及标志物筛选

原始数据首先转换成mzXML格式，利用R语言进行峰识别、峰过滤和峰匹配。PLA-DA采用SIMCA-P11.0(Umetrics,Umea,Sweden)软件。预测模型建立采用免费在线软件ROCCET(http://www.roccet.ca/ROCCET/)。

为了考察代谢谱的差异，对样品进行峰识别和峰匹配，主要的设置参数是，峰宽为5-10s，质量偏差为25ppm，质量窗口为0.01m/z，信噪比为6，其他参数默认。峰识别匹配之后形成一个由保留时间、质量数和峰面积形成的数据矩阵。

采用多元统计分析方法能够从数以百计的代谢成分中筛选出有价值的变量。PLS-DA作为一种有监督的识别模式，能够模拟数据与样本分类之间的关系，解释产生差异的主要因素。进行模式识别之前需要对数据进行校正。

采用蛋白定量试剂盒对每个样品进行总蛋白量的测定，给药组样品的总蛋白含量分别除以对照组样品的总蛋白含量得到蛋白差异系数，给药组样本的代谢峰强度除以各自计算的蛋白系数以此校正由于细胞数目的微小差异造成的代谢谱差异。对样本进行概率商校正(PQN)，扣除仪器偏差。对每个变量进行帕雷托标度(paretoscaling)，以减少PLS-DA运算中因变量响应强度造成的偏差。正常组赋予值0，6h，12h，24h分别赋予值1,2,3，其他值默认，由此得到PLS-DA模型，称为模型1。其相关系数如下：A(主成分数)＝2，R2X＝0.779，R2Y＝0.977，Q2＝0.938。R2X，R2Y分别代表模型对原X，Y信息的保留程度，Q2为模型的预测能力。以上数据表明模型具有良好的预测能力和有效性。

根据模型1的两个主成分，得到得分图(图2a)，不同时间点的代谢谱分别落在不同的区域，表明随着损伤时间的延长，胞内代谢物谱出现显著性差异。根据各个变量在PLS-DA模型分类中的贡献大小得到每个变量的重要性因子VIP。VIP值小于0.5，认为此变量在分类中没有贡献，VIP值大于1，认为此变量对分类有贡献，VIP值大于1.5，则认为此变量对分类具有较大的贡献。VIP越大代表此变量对分类的贡献值越大。将VIP大于1.5的变量认为是候选的潜在标志物。

为了进一步筛选能够指示肾毒性进展程度的标志物，申请者考察了候选潜在标志物的时间依赖变化规律。共有三种变化趋势(图3)a和b两种变化趋势与肾细胞损伤的严重程度成比例，更符合标志物的特征，而c类变化趋势不规律，不适合作为肾毒性进展标志物。据此筛选出可靠的肾毒性进展标志物谱(表1)。

表1.马兜铃酸致肾细胞损伤潜在标志物

对表1中的离子进行结构鉴定，采用精确分子量进行数据库匹配((Metlin(http://metlin.scripps.edu),HMDB(http://www.hmdb.ca/),ChemSpider(http://www.chemspider.com),MassBank(http://www.massbank.jp),KEGG(http://www.genome.jp)))。采用二级质谱碎片进行解析，结合相关文献推测出化合物名称如表1所示。

5、潜在标志物验证

为了考察表1标志物的预测能力，采用感受曲线对各个标志物的预测准确度进行评估。采用SPSS19.0软件进行分析，附图4a是其中一个化合物的感受曲线，曲线下面积为0.889。研究表明，曲线下面积大于0.6，则认为预测性能良好，曲线下面积大于0.8，则认为预测性能很好。表1中标志物的曲线下面积如表2。结果表明所选标志物的预测能力很好。

表2标志物的感受曲线下面积(AUC)

表1中差异性代谢物与马兜铃酸导致的急性肾损伤过程有着重要的关系。以油酰胺为例，其随着肾细胞损伤的严重呈升高的趋势。油酰胺是一种重要的脂肪酸酰胺，研究表明，它可以影响肾细胞的Ca2+信号通路，使细胞内的游离钙离子显著升高。钙离子水平的持续升高具有一定的细胞毒作用。油酰胺升高引起胞内钙离子水平异常可能是造成肾毒性的重要原因。

实施例2

1、肾毒性剂量研究，细胞样品采集，处理，分析以及代谢谱分析与实施例1类似，主要差异参数如下：

1)设置组别：对照组，24h马兜铃酸损伤组。每组12个平行样，共24个样本。

2)每个样品的细胞数量离心后约为50mg。代谢谱分析流动相A采用体积分数0.2％的甲酸水溶液。

3)PLSDA模型(模型2)主要参数为A(主成分数)＝2，R2X＝0.609，R2Y＝0.985，Q2＝0.96。

模型2中正常组和损伤组也得到了很好的分离。并且表1中的离子都包含在模型2筛选出的候选标志物中。说明该方法筛选的标志物具有稳定性，可重复性的特点。

模型2潜在标志物的预测能力见表3，结果表明所选潜在标志物的预测能力良好。

表3标志物的感受曲线下面积(AUC)

研究表明，多个代谢物联合预测比单一标志物预测的准确度高。采用多变量探索性ROC分析表1中潜在标志物，建立不同个数标志物预测模型。变量的个数由Monte-Carlo交叉验证得出的变量重要性决定，选择前2、3、5、7、10、11个重要的变量分别构建预测模型，考察预测准确度。在每一次Monte-Carlo交叉验证过程中，2/3的样本用来建立模型确定变量重要性，进而用剩余1/3样本进行验证，得出模型预测准确度。最终得到的预测准确度是多次交叉验证得到的平均值(图4b)。可见，多个标志物联合预测的准确度较单一标志物高。

本发明所述体外方法筛选的标志物具有良好的预测能力，可作为体外肾毒性发展程度的指标性成分，有望推广到临床实验。

Claims (9)

1.一种体外用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法，其特征在于：应用代谢组学方法研究体外细胞损伤模型中代谢物差异；

包括以下步骤：

(1)确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量；

(2)对正常肾细胞、马兜铃酸药物损伤肾细胞的胞内代谢物进行分析得到胞内代谢轮廓；

(3)应用多变量统计方法分析正常细胞和马兜铃酸药物损伤细胞的代谢轮廓数据，结合代谢物随药物作用时间的变化规律，筛选标志物。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(1)使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色法确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量，细胞明显损伤指同等培养条件下马兜铃酸诱导损伤实验组细胞数目与正常组细胞数目相比，具有显著性差异，P<0.5，能够导致这种明显损伤的马兜铃酸剂量即为马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)所述正常肾细胞为人源化正常肾细胞HL7702；所述马兜铃酸药物损伤肾细胞为采用马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量诱导损伤的人源化正常肾细胞HL7702，诱导损伤时间为6-24h。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)使用超高效液相色谱-质谱联用技术对胞内代谢物进行分析。

5.根据权利要求1或4所述方法，其特征在于：步骤(2)所述得到胞内代谢轮廓的过程中，采用一套细胞样本采集和处理的规范化流程来采集、处理细胞，该流程的步骤为：

细胞刮刮取正常细胞、诱导作用时间为24h以及在0-24h中间两个时间点的(n×4)个细胞样品分别置于离心管中，离心得细胞饼即为所需细胞样品(每个细胞样品约10-100mg)；细胞样品重悬于1-1.5ml甲醇的水溶液(甲醇/水，v/v，4/1-2/1)，用超声细胞破碎仪冰上裂解细胞，得到的细胞裂解液0-4℃离心，上清液冻干复溶于100-300ul体积分数为1/4-3/4的甲醇溶液中，得n×4个样本；对n×4个样本依次进行超高效液相色谱-质谱联用技术分析，最终得到n×4个样本的总离子流图，即为肾细胞内代谢轮廓谱；

其中n为每组平行试验的数量，为大于或等于6的正整数。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：超高效液相色谱-质谱联用技术中，色谱柱为C18柱,流动相采用体积分数为0.1％-0.2％甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)，梯度洗脱，质谱采用ESI正离子模式检测。

7.根据权利要求5所述的细胞样本采集和处理的规范化流程，其特征在于；取细胞裂解液10-20μL，采用蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量，给药组与对照组样品的蛋白总量相除得出总蛋白差异系数，给药组各色谱峰面积除以此系数将给药组细胞数目校正到对照组的细胞数目，即可校正由于细胞数目的微小差异所造成的代谢谱强度的差异。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)所述多变量统计方法为偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)方法；

具体步骤为：采用R语言对样本的胞内代谢轮廓谱进行峰提取，峰匹配，生成一个数据矩阵，数据矩阵采用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)方法进行多元统计分析，对肾细胞不同损伤程度的代谢谱数据进行建模，根据模型中变量重要性因子筛选大于或等于1.5的检测离子；结合这些离子在肾损伤进展过程中变化规律，进一步筛选呈单一性变化(升高或者下降)的离子，可被认为是在马兜铃酸致肾损伤过程中的潜在标志物。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)最后要对筛选出的潜在标志物进行验证，采用感受曲线(ROC)下面积值(AUC)对其预测准确度进行评估，AUC通常在0.5到1之间，AUC＞0.5的情况下，AUC越接近1，说明预测准确度越好，AUC<0.5不符合真实情况；然后对筛选出的标志物进行结构鉴定。