CN105647968A - 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试***及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试***及其应用，所述测试***包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***；所述报告***是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼接，拼接处***两个限制性核酸内切酶酶切位点；在利用CRISPR/Cas9***编辑(敲除)特定基因之前，靶序列的选择至关重要，这个选择会影响sgRNA对目的DNA的识别效率、与目的DNA的结合效率、Cas9的靶向切割效率和NHEJ修复效率，利用本***可定量比较不同sgRNA–靶DNA序列的基因编辑效率，可以在短时间内确定工作效果最佳的sgRNA，提高实际敲除的成功率，这不仅可以降低工作成本，还可以提高工作效率，推动工作进程。

Description

一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试***及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种CRISPR/Cas9工作效率测试***及其应用，可在细胞水平上快速、简便、准确测试由CRISPR/Cas9sgRNA介导的基因编辑效率，筛选可有效用于基因编辑(敲除、突变、敲入)的sgRNA。
(二)背景技术
成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats)是目前最高效的基因组编辑***，是从一种来自细菌及古细菌中降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制改造而来。它包含三个元件：Cas9蛋白、crRNA(CRISPR-associatedRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)。含有两个核酸酶结构域(RuvC和HNH)的Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过识别和结合靶DNA的PAM(protospaceradjacentmotif)基序(5’-NGG-3’)，解旋靶DNA，通过crRNA中的含20碱基的小向导RNA(sgRNA)与单链靶DNA碱基配对，形成RNA-DNA复合结构，进而利用Cas9RuvC和HNH核酸酶各自切割靶DNA的一条链，形成带有平末端的DNA双链断裂。断裂的DNA要么修复，以保证细胞成活；要么不修复，从而导致细胞死亡。在包括人类细胞的真核细胞中，Cas9诱导的DNA双链断裂主要由细胞内两条保守途径修复：同源重组(homologousrecombination；HR)和非同源末端连接(non-homologousend-joining；NHEJ)。NHEJ会产生删除、***，导致基因变异，甚至失活移码，从而编辑或敲除目的基因。如果能够提供外源同源序列，HR则可以在选定的DNA靶位上、依照基因靶向原理嵌入目的基因或DNA片段。由于PAM基序结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中都能找到大量靶点，利用Cas9诱导的DNA双链断裂及随后的修复，可以通过这些靶点有效敲除目的基因或者嵌入目的基因或基因片段，因此CRISPR/Cas9技术在基因编辑中潜力巨大，在短短的时间内就已得到了广泛的应用。目前，CRISPR/Cas9***已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，在生物、农业、医学等领域具有巨大的应用潜力和经济效益。
CRISPR/Cas9基因编辑***的工作效率主要取决于Cas9的靶向切割效率，而这个靶向切割效率很大程度上依赖于sgRNA对目的DNA靶位的识别能力和亲和力。在CRISPR/Cas9技术应用中，sgRNA对靶的识别能力差、与目的DNA的靶位亲和力低或Cas9的切割效率低下都会降低CRISPR/Cas9的工作效率，并且可能提高sgRNA介导的脱靶，严重限制了CRISPR/Cas9的实际应用，特别是当这个技术被用到生物医学领域。因此，如果能够快速测试sgRNA介导的Cas9的靶向切割效率及随后的基因编辑效率，将大大提高CRISPR/Cas9的实际应用效率，降低CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用成本，推动CRISPR/Cas9基因编辑技术的成功的和广泛的应用。目前，测试sgRNA脱靶倾向的一个常用方法是通过计算机估算sgRNA在基因组的其它部位的错配比重，比如，张锋实验室的计算机测试方法(www.crispr.mit.edu)，但这个方法并不考虑sgRNA在其真正靶位的工作效率，也无实际测试。另外的一个方法是通过测量sgRNA实际应用后的基因编辑效率来返回评估，但这耗时耗力，也未达到测试效果。第三种方法是设计一个基于萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase；FLuc)基因的报告***，比如北京百奥赛图基因生物技术有限公司的CRISPR/Cas9活性检测试剂盒。在这个报告***中，FLuc基因因人为***两段重复序列而失活。为了测试sgRNA介导的基因编辑效率，在两段重复序列之间嵌入靶基因片段，然后将带有靶基因片段的报告***、Cas9表达质粒和需测试的sgRNA表达质粒同时转入细胞，利用sgRNA介导Cas9的靶向切割，断裂的靶基因片段将通过两边的重复序列完成单链退火(singlestrandanealing，SSA)修复，恢复正常的FLuc基因。转染后2-3天，通过测量细胞内FLuc活性，可以判断sgRNA介导的CRISPR工作效率。但是，由于这个报告***中断裂的DNA是通过特殊的、由重复序列介导的SSA来修复，而不是CRISPR技术所利用的HR和NHEJ，因此，这个方法所测试的并不是真正的基因编辑效率，也不能准确地测试sgRNA的优劣，而且选定的靶基因片段需要克隆或扩增获取。因此，该领域急需一个更准确、有效、简便、快速的能测试sgRNA工作效率及CRISPR/Cas9基因编辑效率的测试***。
(三)发明内容
本发明目的是构建、测试、验证了一种在细胞水平上能准确、有效、简便、快速检测sgRNA工作效率及CRISPR/Cas9基因编辑效率的检测***，为个体化或高通量设计和选择高效的CRISPR/Cas9sgRNA序列提供可靠的核心技术基础。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，所述测试***包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***；所述报告***是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼接，拼接处***两个限制性核酸内切酶酶切位点。
进一步，所述能够编码有效蛋白的核苷酸片段为灭瘟素脱氨酶基因BSD(BlasticidinSdeaminase；BSD)、新霉素抗性基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。
进一步，所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，优选所述报告基因为下列之一：绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP、青色荧光蛋白基因CFP、蓝色荧光蛋白基因BFP、红色荧光蛋白基因RFP、水母发光蛋白基因、克林霉素基因、萤火虫荧光素酶基因(fireflyluciferase；FLuc)、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因，最优选绿色荧光蛋白基因GFP或萤火虫荧光素酶基因FLuc。
进一步，所述限制性核酸内切酶酶切位点包括I-SceI、EcoRI，KpnI或BamHI等，优选下列之一：I-SceI(18个碱基对)、EcoRI，KpnI或BamHI。
进一步，所述报告***是将灭瘟素脱氨酶基因BSD的C-端与绿色荧光蛋白基因GFP的N-端拼接，拼接处***两个限制性内切酶酶切位点，所述两个限制性核酸内切酶酶切位点之一为I-SceI，最优选酶切位点为I-SceI(18个碱基对)和EcoRI。
本发明还提供一种所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***在预测基因编辑效率中的应用，所述应用方法为：通过分子克隆，在用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***的两个酶切位点之间***sgRNA靶向的目标DNA序列；然后将表达sgRNA的质粒、表达Cas9的质粒和***目标DNA的报告***共转染哺乳动物细胞株，转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP阳性细胞的频率或结合常规双荧光素酶报告基因检测试剂盒，利用酶标仪测量萤火虫荧光素酶基因FLuc和海肾荧光素酶(renillaluciferase；RLuc)活性，获取在测试报告***中的相对基因编辑效率，通过该相对编辑效率预测细胞内特定内源基因的基因编辑效率，筛选有效sgRNA，预测所述有效sgRNA在细胞内介导内源基因编辑的效率；所述相对基因编辑效率为GFP阳性细胞频率与转染效率的比值或FLuc活性对RLuc活性的比率。
本发明还涉及一种用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***在检测和定量突变型NHEJ及所产生突变中的应用，所述应用是将用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***编辑的质粒功能框克隆到小鼠基因组ROSA26位点靶向载体pROSA26上，形成pROSA26-BGN质粒，再利用ROSA26的定点靶向将所述pROSA26-BGN质粒中的功能框完整整合到小鼠胚胎干细胞ROSA26位点，建立突变型NHEJ报告细胞，利用报告***结合公知的细胞学和分子生物学技术检测和定量突变型NHEJ及所产生突变；所述报告***的限制性内切酶酶切位点之一为I-SceI。
本发明主要是用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***的构建、验证和潜在应用。但本发明不限制于当前的CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因编辑***的应用，未来的新型CRISPR***也可以适用。
本发明所述用于快速测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***构建方法具体为：(1)将公知的能够编码有效蛋白的核苷酸片段(优选灭瘟素脱氨酶BSD基因)的C-端与报告基因的N-端拼接，形成一个融合基因，由PGK启动子(PGKp)启动表达。BSD基因可以用其它基因或DNA替代，所述报告基因为常规用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，包括各种发光蛋白基因(例如GFP，YFP，CFP，BFP，RFP等)，还包括水母发光蛋白或克林霉素，以及各种荧光素酶(比如萤火虫荧光素酶基因FLuc)、β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和其它许多种酶类等。(2)在融合基因的拼接处***一段含有适合分子克隆的限制性内切酶酶切位点的结合(linker)序列。最优选所述结合序列由限制性内切酶酶切位点I-SceI的18个碱基对和其它合适的核酸限制性内切酶酶切位点(比如EcoRI，KpnI和BamHI)构成。引入I-SceI位点是为了在细胞内产生含3’-外伸端的DNA断端，诱导3’-外伸端起始的NHEJ及突变，而Cas9和Cpf1诱导的DNA断端是平末端和5’-外伸端。因此I-SceI位点的引入将拓展该***在检测NHEJ及其产生突变中的应用。融合基因中的报告基因由于***酶切位点结合序列引起的2对碱基对的移码而无产物活性，但在核酸酶I-SceI、Cas9或Cpf1在其对应位点产生一个DNA双链断裂后，NHEJ修复理论上将会有大约三分之一的机会恢复报告基因的正确编码，使报告基因产生活性。这一步完成了所述用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***的基本载体的构建。这个基本载体原理上是用于测量细胞内突变型NHEJ，因此这个载体也称为突变型NHEJ报告***，其工作原理图(图1)和工作效果示意图(图2)，以基于I-SceI切割、以增强型GFP(EGFP)为报告基因为例(fsGFP代表融合基因中移码的EGFP)。无NHEJ修复(图2中A)和有NHEJ修复所产生GFP阳性细胞的频率可以通过流式细胞仪测定(图2中B)。(3)通过分子克隆，在优选的I-SceI和EcoRI之间(其它位点也可以利用)***sgRNA所靶向的目标DNA序列，生成直接用于测试的针对特定目标DNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***(图3)。目标序列的***也未纠正报告基因(比如EGFP和FLuc)的编码，因此也无活性，但通过CRISPR/Cas9在靶序列的基因编辑，报告基因理论上将有三分之一的机会恢复正确编码，产生活性，这个活性代表了CRISPR/Cas9基因编辑相对效率，同样可以通过细胞流式仪或酶标仪测量。原理图以EGFP为报告基因为例(图3)。
本发明所述用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***以EGFP为报告基因，构建方法为：
(1)构建含有BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN(图4)。PCR扩增公知的BSD基因，5’-PCR引物带HindIII位点，3’-PCR引物引入I-SceI和EcoRI位点。PCR产物(BSD)***EGFP质粒中CMV驱动子和EGFP编码区的连接序列的HindIII和EcoRI位点之间(EGFP质粒核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)，生成含BSD-fsEGFP融合基因的载体(记为质粒pBGN)。BSD-fsEGFP融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。该融合基因由CMV驱动子或PGK驱动子驱动，但EGFP由于移码而无活性，因此称fsEGFP。EGFP可以用其它荧光蛋白基因(比如RFP、BFP等)或其它报告基因替代。
5’-PCR引物为
CTCAAGCTTAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG，
3’-PCR引物为
AGAATTCCAGTAGGGATAACAGGGTAATGCCAGGTCCGCCCTCCCACACATAACCAGAG。
(2)为了利用pBGN质粒定量分析突变型NHEJ，将报告***(即质粒pBGN)的功能框克隆到小鼠基因组ROSA26位点靶向载体pROSA26上形成pROSA26-BGN质粒(图5)，然后利用ROSA26的定点靶向将pBGN中的功能框完整整合到小鼠胚胎干细胞ROSA26位点。由于在功能框上可以诱导含3’-外伸端(I-SceI酶切)、平末端(Cas9)和5’-外伸端(Cpf1)的DNA断端，因此可以在细胞内利用该功能框研究分析不同末端介导的非同源末端连接及随之产生的突变，揭示突变型NHEJ的分子机制。
(3)构建含有sgRNA目标序列的质粒pBGN-T(图6)。根据sgRNA的23对碱基的目标序列，合成互补的含有sgRNA目标序列寡核苷酸，退火后***质粒pBGN的I-SceI和EcoRI位点之间，生成带有目标序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBGN-T。一旦sgRNA在细胞内靶向目标序列，介导Cas9或Cpf1的切割，利用非同源末端连接修复产生的DNA双链断裂，将有三分之一的机会恢复GFP的正确编码，GFP恢复活性(图3)，于是，GFP阳性细胞将代表CRISPR/Cas9基因编辑结果，可以通过细胞流式仪定量。
本发明所述用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***以FLuc为报告基因，构建方法为：
(1)构建含有BSD-fsFLuc融合基因的质粒pBLuc(图7)。利用常规PCR方法和步骤，PCR扩增FLuc基因(核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，氨基酸序列为SEQIDNO.6所示)，5’-PCR引物带KpnI位点，3’-引物带NotI位点。PCR产物(FLuc)取代含BSD-fsEGFP的质粒pBGN中KpnI和NotI之间EGFP部分，生成BSD-fsFLuc质粒pBLuc，FLuc由于移码而无活性，因此称fsFLuc。BSD-fsFLuc融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。
5’-PCR引物为
GACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC，3’-PCR引物为AGTCGCGGCCGCTTTACACGGCGATCTTGCCGC。
(2)构建含有sgRNA目标序列的基于FLuc测试***的质粒pBLuc-T(图8)。根据sgRNA目标序列，设计定制含有sgRNA目标序列的寡核苷酸，退火后***质粒pBLuc的I-SceI和EcoRI位点之间，生成带有目标序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBLuc-T。sgRNA目标序列的***尽管造成额外2对碱基对的移码，但仍未能纠正移码的报告基因，因而不能编码正常蛋白，仍无活性可以检测。一旦sgRNA在细胞内靶向目标序列，介导Cas9或Cpf1的切割，利用非同源末端连接(NHEJ)修复产生的DNA双链断裂将有三分之一的机会恢复FLuc的正确编码，FLuc恢复活性，于是，FLuc活性将代表CRISPR/Cas9基因编辑效果，可以通过酶标仪定量。
本发明所述CRISPR/Cas9工作效率测试***工作原理：利用CRISPR/Cas9工作效率测试***的基本质粒pBGN或pBLuc，如上所述制备直接用于测试的含有sgRNA靶向目标序列的质粒pBGN-T或pBLuc-T。与对应的sgRNA表达质粒和公共的Cas9表达质粒一同转入到细胞内，表达的sgRNA将介导CRISPR/Cas9***在细胞内对靶DNA序列进行识别、结合、DNA双链断裂定点诱导及随后的DNA修复。由于修复引起的再次移码有三分之一的机会纠正报告基因的读码，细胞将产生有正常活性的报告基因产物。因此，在转染2-3天后通过回收细胞，检测报告基因EGFP或FLuc的活性，测量特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率(工作原理见图3)。由于测试结果会受转染效率的影响，将同时测试转染效率，校正所获得的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。针对质粒pBGN-T***，将公知的EGFP表达质粒平行转染细胞，测定转染效率，sgRNA诱导的GFP阳性细胞率与转染效率之比代表特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。针对质粒pBLuc-T***，将公知的RLuc表达质粒一同转染细胞，测定转染效率，sgRNA诱导的FLuc活性与转染内参RLuc活性之比代表特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。
更进一步，所述CRISPR/Cas9工作效率测试***测试流程及潜在应用具体如下：
(1)利用www.crispr.mit.edu网站为目的基因的特定区域设计几个不同的sgRNA。
(2)在CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBGN或质粒pBLuc中I-SceI和EcoRI位点***sgRNA的靶向序列。
(2)按照常规方式构建sgRNA的表达质粒。
(3)将测试***相关质粒(带有sgRNA靶序列的测试质粒pBGN-T或pBLuc-T，sgRNA表达质粒，Cas9表达质粒)共转染哺乳动物细胞株，比如NIH3T3，小鼠胚胎干细胞，HeLa，U2OS细胞等。针对质粒pBGN-T***，因为获取的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率需要利用转染效率校正，将GFP表达质粒平行转染细胞以便转染2-3天后获取转染效率，利用转染效率校正CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。相似地，针对质粒pBLuc-T***，将公知的RLuc表达质粒一同转染细胞以便转染2-3天后获取转染效率(RLuc活性)，利用转染内参RLuc活性校正CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。
(4)转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP阳性细胞的频率(针对质粒pBGN-T)或结合常规双荧光素酶报告基因检测试剂盒，利用酶标仪测量FLuc和RLuc活性(针对质粒pBLuc-T)。
(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率：GFP阳性细胞对转染效率的比率(质粒pBGN-T)或FLuc活性对RLuc活性的比率(质粒pBLuc-T)。
(6)高通量sgRNA筛选潜在应用：在CRISPR-Cas9sgRNA文库构建中，sgRNA和其对应载体可以在芯片上合成和构建，该***中的目的序列及含目的序列的测试载体也可以同样在芯片上合成和构建。为了高通量筛选sgRNA，本发明可以进一步改造，将sgRNA表达载体和对应的含目的序列的测试载体pBLuc-T及转染效率内参(公知的RLuc表达质粒)混合，制备到芯片上，转染表达Cas9的测试细胞，2天后测量FLuc对RLuc的比率，分析sgRNA的工作效率，确定有效的sgRNA。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)本发明所述CRISPR/Cas9工作效率测试***能快速测试sgRNA在其真正靶位的工作效率。目前，通过计算机分析只能大概估计sgRNA脱靶倾向，不能测试sgRNA在其真正靶位的工作效率。许多应用是在没经测试的基础上直接进行基因编辑，通过基因编辑的结果回估sgRNA的工作效率，达不到测试的效果。而本发明是通过在细胞内实际测试特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑效率。(2)真正模拟CRISPR/Cas9基因编辑机制。现有的一个基于萤火虫荧光素酶基因的sgRNA工作效率测试***则是在CRISPR/Cas9诱导DNA双链断裂之后通过测量单链退火(SSA)修复途径来评估，但CRISPR/Cas9基因编辑所利用的修复途径是NHEJ或HR，因此该***不能准确、可靠地反映sgRNA在CRISPR/Cas9基因编辑中的工作效率。而本发明正是通过测试CRISPR/Cas9基因编辑所采用的NHEJ来测试基因编辑效率，更准确、更可靠。(3)简单、易行和快捷。上述现有***测试的目的DNA需要一定长度，需要从基因组DNA中PCR扩增，耗时耗力，甚至可能不成功。而本发明只需要在常规引物合成后退火引物就可以将23对碱基对的目的DNA片段连接到线性化的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试***(载体)中。因此，利用本发明中的测试***测试目的DNA对应的sgRNA介导的基因编辑效率，更准确、更简便、更快捷，并可以制备成测试试剂盒。
事实上，本***完全模拟CRISPR/Cas9基因编辑***的工作原理，通过sgRNA介导的目的DNA靶向识别、Cas9引起的定点DNA双链断裂及随后的NHEJ修复，完成基因编辑，产生有功能的EGFP或萤火虫荧光素酶基因FLuc，从而可以定量分析基因编辑相对效率，对符合要求的任何靶序列可以进行基因编辑测试及效率预测。并且，本***重组质粒的构建简单易行。因此，本***具有灵敏度高、操作简便、实用性强、经济节约的特点。此外，通过进一步改造，该发明可用于高通量测试sgRNA工作效率，为优化现有的和正在建立的CRISPRsgRNA文库提供技术基础。而且，这个发明不仅适用于当前CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1基因编辑***，也可应用于未来新型的CRISPR***。
在利用CRISPR/Cas9***编辑(敲除)特定基因之前，靶序列的选择至关重要，这个选择会影响sgRNA对目的DNA的识别效率、与目的DNA的结合效率、Cas9的靶向切割效率和NHEJ修复效率。其中一个或几个方面的效率低甚至无效将直接导致基因编辑(敲除)失败。因此，利用本***可定量比较不同sgRNA–靶DNA序列的基因编辑效率，可以在短时间内确定工作效果最佳的sgRNA，提高实际敲除的成功率。这不仅可以降低工作成本，还可以提高工作效率，推动工作进程。
(四)附图说明
图1为突变型NHEJ报告***工作原理图。
图2为突变型NHEJ报告***NHEJ工作效果示意图，A:无NHEJ修复(流式图)；B:有NHEJ修复(流式图)。
图3为CRISPR/Cas9基因编辑测试***工作原理图。
图4为含有BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN示意图。
图5为pROSA26-BGN质粒示意图。
图6为含有sgRNA目标序列的基于EGFP测试***的质粒pBGN-T(3’-GactgcgcaGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctatccc，5’-AATTCtgacgcgtCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgatagggATAA代表sgRNA目标序列，N代表任何碱基，下划线表示PAM基序)示意图。
图7为含有BSD-fsFLuc融合基因的质粒pBLuc示意图。
图8为含有sgRNA目标序列的基于EGFP测试***的质粒pBGN-T(3’-GactgcgcaGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctatccc，5’-AATTCtgacgcgtCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgatagggA代表sgRNA目标序列，N代表任何碱基，下划线表示PAM基序)示意图。
图9为基于测试质粒pBGN-T、以筛选靶向小鼠FBXW7基因的sgRNA为例的CRISPR/Cas9基因编辑***的测试结果。
图10为基于测试质粒BLuc、以筛选靶向小鼠MDC1基因的sgRNA为例的CRISPR/Cas9基因编辑***的测试结果。
图11为基于测试质粒pBGN-T、以靶向人HPRT基因的sgRNA为例的CRISPR/Cas9工作效率测试***的测试和应用结果，A:测试结果；B:应用结果。
图12为CRISPR/Cas9工作效率测试***检测和定量突变型NHEJ效率的应用结果。
图13为CRISPR/Cas9工作效率测试***检测突变型NHEJ所产生的删除突变的应用结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：基于含BSD-fsEGFP融合基因pBGN质粒的CRISPR/Cas9工作效率测试***的应用(筛选靶向小鼠FBXW7基因的sgRNA)
(1)BSD-fsEGFP融合基因：利用常规PCR，扩增公知的BSD基因，5’-PCR引物带HindIII位点，3’-PCR引物引入I-SceI和EcoRI位点。将PCR产物(BSD)***EGFP质粒(EGFP核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)中CMV驱动子和EGFP编码区的之间的HindIII和EcoRI位点，生成含BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN(图3)，BSD-fsEGFP融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。该融合基因由CMV驱动子或PGK驱动子驱动，但EGFP由于移码而无活性，因此称fsEGFP。
5’-PCR引物为
CTCAAGCTTAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG，
3’-PCR引物为
AGAATTCCAGTAGGGATAACAGGGTAATGCCAGGTCCGCCCTCCCACACATAACCAGAG。
(2)以小鼠肿瘤抑制基因FBXW7为目标DNA，利用www.crispr.mit.edu网站为目的基因的特定区域设计3个不同的sgRNA。通过分子克隆，根据sgRNA的23碱基对目标序列，合成两条互补的对应于sgRNA目标序列正反链的寡核苷酸，退火后***质粒pBGN的I-SceI和EcoRI位点之间，生成3个带有对应目标序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBGN-T。sgRNA目标序列的***尽管造成额外2对碱基对的移码，但仍未能纠正移码的报告基因，因而不能编码正常蛋白，在sgRNA介导基因编辑前无活性可以检测。同时，利用常规操作和公知的sgRNA的表达质粒，制备这3个sgRNA的表达质粒。
3条小鼠FBXW7sgRNA表达序列及靶向序列，下划线部分表示PAM基序：
sgRNA1表达序列5’to3’CGGCTCAGACTTGTCGATAC
sgRNA1靶序列5’to3’CGGCTCAGACTTGTCGATACTGG
sgRNA2表达序列5’to3’TGTGGCAACCGCATAGTTAG
sgRNA2靶序列5’to3’TGTGGCAACCGCATAGTTAGTGG
sgRNA3表达序列5’to3’CAGTGTCTGAGAACGTTAGT
sgRNA3靶序列5’to3’CAGTGTCTGAGAACGTTAGTGGG
(3)将测试质粒pBGN-T，sgRNA表达质粒，公知的Cas9表达质粒共转染哺乳动物细胞株，比如NIH3T3，小鼠胚胎干细胞，HeLa，U2OS细胞等，本实施例选择NIH3T3。同时，将常规用的GFP表达质粒平行转染细胞以测定转染效率，利用转染效率校正获取的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。
(4)转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP+细胞的频率。
(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。这个相对效率由GFP阳性细胞频率与转染效率的比值代表，结果如图9所示。我们发现在测试***中，FBXW7sgRNA1，sgRNA2和sgRNA3介导的基因编辑所产生的GFP阳性细胞频率分别约为1％，0.4％和2％(图9)。因此，我们预测sgRNA3在基因敲除编辑小鼠FBXW7基因时将是最佳的。根据这个测试结果(图9)，我们将选择应用FBXW7sgRNA3在小鼠细胞或小鼠模型中敲除小鼠FBXW7基因。
实施例2：基于含BSD-fsFLuc融合基因pBLuc质粒的CRISPR/Cas9工作效率测试***的应用(筛选靶向小鼠MDC1基因的sgRNA)
(1)利用常规PCR扩增体系和条件，PCR扩增FLuc基因(核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，氨基酸序列为SEQIDNO.6所示)，5’-PCR引物带KpnI位点，3’-引物带NotI位点。PCR产物(FLuc)取代质粒pBGN(含有BSD-fsEGFP)中KpnI和NotI之间EGFP部分，生成BSD-fsFLuc质粒pBLuc(图4)，FLuc由于移码而无活性，因此称fsFLuc。BSD-fsFLuc融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。
5’-PCR引物为
GACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC，
3’-PCR引物为AGTCGCGGCCGCTTTACACGGCGATCTTGCCGC。
(2)跟实施例1相似，以小鼠MDC1基因为目标基因，利用www.crispr.mit.edu网站为目标基因的特定区域设计6个不同的sgRNA。通过分子克隆，含有sgRNA目标序列的寡核苷酸，退火后***质粒pBLuc的I-SceI和EcoRI位点之间，生成6个带有对应目标序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBLuc-T(图6)。sgRNA目标序列的***尽管造成额外2对碱基的移码，但仍未能纠正移码的报告基因，因而不能编码正常蛋白，在sgRNA介导基因编辑前无活性可以检测。同时，利用常规操作和公知的sgRNA的表达质粒，制备这6个sgRNA的表达质粒。
6条小鼠MDC1sgRNA表达序列及靶向序列，下划线部分表示PAM基序：
sgRNA1表达序列5’to3’ACAGATCATGGAAAGCACCC
sgRNA1靶序列5’to3’ACAGATCATGGAAAGCACCCAGG
sgRNA2表达序列5’to3’AGCATCCCAGTCAATCACCT
sgRNA2靶序列5’to3’AGCATCCCAGTCAATCACCTGGG
sgRNA3表达序列5’to3’GAACTATCCAGTGGCTCCTT
sgRNA3靶序列5’to3’GAACTATCCAGTGGCTCCTTGGG
sgRNA4表达序列5’to3’ACTATACCCCAAGGAGCCAC
sgRNA4靶序列5’to3’ACTATACCCCAAGGAGCCACTGG
sgRNA5表达序列5’to3’TGGCTCCTTGGGGTATAGTG
sgRNA5靶序列5’to3’TGGCTCCTTGGGGTATAGTGTGG
sgRNA6表达序列5’to3’AAGAGACGTAGCTGCCCTAT
sgRNA6靶序列5’to3’AAGAGACGTAGCTGCCCTATAGG
(4)跟实施例1相似，将测试***相关质粒(带有sgRNA靶序列的测试质粒pBLuc-T，sgRNA表达质粒，公知的Cas9表达质粒和作为转染内参的公知的RLuc表达质粒)共转染哺乳动物细胞株，比如NIH3T3，小鼠胚胎干细胞，HeLa，U2OS细胞等，本实施例选择NIH3T3。转染2-3天后，利用酶标仪测量FLuc和RLuc活性。
(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率：FLuc活性对RLuc活性的比率，结果见图10所示。我们发现在测试***中，sgRNA6介导的基因编辑产生的FLuc活性对RLuc活性的比率是大约2％，而sgRNA1到sgRNA5产生的活性比率都小于1.5％(图10)。因此，我们预测sgRNA6在基因敲除编辑小鼠MDC1基因时将是最佳的。根据这个预测结果，我们将选择应用sgRNA6以在小鼠细胞或小鼠模型中敲除小鼠MDC1基因。
实施例3：筛选靶向人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶HPRT的sgRNA及人HPRT基因编辑(敲除)应用
(1)pBGN构建与实施例1同。
(2)利用本发明CRISPR/Cas9基因编辑测试***筛选用于人细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶HPRT的基因编辑(敲除)的最佳sgRNA。实施方案同实施例1。首先，利用www.crispr.mit.edu网站为人HPRT基因设计7个不同的sgRNA。
6条人HPRTsgRNA表达序列及靶向序列，下划线部分表示PAM基序：
sgRNA0表达序列5’to3’GTGCTTTGATGTAATCCAGC
sgRNA0靶序列5’to3’GTGCTTTGATGTAATCCAGCAGG
sgRNA1表达序列5’to3’TAAATTCTTTGCTGACCTGC
sgRNA1靶序列5’to3’TAAATTCTTTGCTGACCTGCTGG
sgRNA2表达序列5’to3’TGTAGCCCTCTGTGTGCTCA
sgRNA2靶序列5’to3’TGTAGCCCTCTGTGTGCTCAAGG
sgRNA3表达序列5’to3’GTAGCCCTCTGTGTGCTCAA
sgRNA3靶序列5’to3’GTAGCCCTCTGTGTGCTCAAGGG
sgRNA4表达序列5’to3’TAGCCCTCTGTGTGCTCAAG
sgRNA4靶序列5’to3’TAGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGG
sgRNA5表达序列5’to3’AGCCCTCTGTGTGCTCAAGG
sgRNA5靶序列5’to3’AGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGG
sgRNA6表达序列5’to3’GCCCTCTGTGTGCTCAAGGG
sgRNA6靶序列5’to3’GCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGGG
通过常规分子克隆操作，与实施例1步骤相似，制备7个带有对应目标序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBGN-T。sgRNA目标序列的***尽管造成额外2个碱基对的移码，但仍未能纠正移码的报告基因，因而不能编码正常蛋白，如无基因编辑，则无活性可以检测。同时，利用常规操作和公知的sgRNA表达质粒，制备7个对应的sgRNA表达质粒。
然后，通过转染，将构建好的sgRNA测试报告***与公知的Cas9表达质粒和如上制备的对应的sgRNA表达质粒一同转入NIH3T3小鼠细胞株。与实施例1一样，测试gRNA0-gRNA6各自介导的CRISPR/Cas9基因编辑的效率(图11中A)。与实施例1相同，这个编辑效率已利用转染效率校正。我们发现在测试***中，sgRNA0，sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5和sgRNA6介导的基因编辑所产生的GFP阳性细胞频率分别约为5％，0.5％，2％，2％，4.5％，3.5％和9％(图11中A)。因此，我们预测在基因敲除编辑人源HPRT基因时sgRNA1将是最差的，sgRNA3一般，sgRNA6最好。
(3)根据上述预测结果，在人细胞内验证所选sgRNA(gRNA6、gRNA3和gRNA1)介导的内源HPRT的基因编辑(敲除)效率。构建好的sgRNA测试报告***与对应的sgRNA表达质粒，分别与Cas9表达质粒一起同时转入人U2OS细胞。由于修复引起的移码或突变会使HPRT失活，HPRT失活的细胞将产生6-巯基鸟嘌呤(6-TG)抗性。利用公知的6-TG筛选方法筛选2-4周后，抗6-TG的细胞克隆将形成，该形成频率与在无6-TG筛选下的细胞克隆形成频率之比值代表真正的6-TG抗性细胞克隆形成效率。这个效率代表内源HPRT基因被编辑的效率，可以用于评估特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9的基因编辑效率。我们发现，在U2OS细胞内，预测结果最好的sgRNA6介导的内源HPRT基因编辑效率可以达到近50％，预测结果最差的sgRNA1约6％，预测结果一般的sgRNA3约26％(图11中B)。这显示，所选出的最好、中等、最差的sgRNA在失活内源HPRT上表现也是一致的，进一步证明了CRISPR/Cas9基因编辑效率测试***的可靠性。
实施例4：CRISPR/Cas9工作效率测试***检测和定量细胞内NHEJ及所产生突变的应用
(1)建立突变型NHEJ报告细胞。优选基于BSD-fsEGFP的报告***(即质粒pBGN)，将其含有BSD-fsEGFP的功能框克隆到公知的小鼠基因组ROSA26位点靶向载体pROSA26上形成pROSA26-BGN质粒(图5)，然后利用常规靶向技术，将pROSA26-BGN中含有BSD-fsEGFP的功能框完整整合到小鼠胚胎干细胞的ROSA26基因组位点，建立突变型NHEJ报告细胞。
(2)检测和定量细胞内突变型NHEJ的发生效率。将公知的I-SceI基因表达质粒转染到突变型NHEJ报告细胞中，利用I-SceI基因的瞬时外源表达，在细胞基因组报告***上的I-SceI位点诱导定点的DNA双链断裂。如果该DNA损伤利用突变型NHEJ途径修复，位于I-SceI位点后面的报告基因理论上将有三分之一的机会恢复正确编码，产生EGFP阳性细胞。EGFP阳性细胞的发生频率代表突变型NHEJ的相对效率，可以通过细胞流式仪检测和定量。结果显示，在没有I-SceI表达时，没有I-SceI诱导的DNA双链断裂及随后的突变型NHEJ，因此GFP阳性细胞频率极低，大约是0.05％。但在有I-SceI表达时，GFP阳性细胞频率提高了大约60倍，近3％(图12)。这表明，在I-SceI诱导产生DNA双链断裂后，细胞将动员DNA修复机器修复这个DNA双链断裂，其中突变型NHEJ修复的相对效率大约是3％。突变型NHEJ效率的可定量允许对这条修复途径的机制与应用的深入研究。比如，如果一个基因的缺陷影响了突变型NHEJ的效率，这个影响可以通过这个突变型NHEJ报告***来测量。CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1诱导突变型NHEJ也可以相似地检测和定量。
(3)检测和定量突变型NHEJ所产生的突变。将带有突变型NHEJ产物的细胞(EGFP阳性细胞)通过细胞流式分选仪回收，制备基因组DNA，通过常规深度靶向测序分析突变型NHEJ产物的接口序列和特定突变的发生频率。结果显示，在小鼠野生型胚胎干细胞中，突变型NHEJ修复I-SceI诱导的带3’-外伸端的DNA双链断裂时，产生的突变绝大部分是删除突变(deletion)，占总突变频率的86.6％；绝少部分是***突变(insertion)，只占0.8％；剩余的12.6％是***删除组合突变(indel)(图13)。CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1诱导的突变型NHEJ所产生的突变也可以相似地检测和定量。突变型NHEJ发生频率、突变类型及频率将揭示突变型NHEJ的发生机制和突变规律。可以预见，该***可用于突变型NHEJ作用机制及其应用的研究。

Claims (10)

1.一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，其特征在于所述测试***包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***；所述报告***是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼接，拼接处***两个限制性核酸内切酶酶切位点。
2.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，其特征在于所述能够编码有效蛋白的核苷酸片段为灭瘟素脱氨酶基因、新霉素抗性基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。
3.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，其特征在于所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因。
4.如权利要求3所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，其特征在于所述报告基因为下列之一：绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP、青色荧光蛋白基因CFP、蓝色荧光蛋白基因BFP、红色荧光蛋白基因RFP、水母发光蛋白基因、克林霉素基因、萤火虫荧光素酶基因FLuc、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。
5.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，其特征在于所述限制性核酸内切酶酶切位点为下列之一：I-SceI、EcoRI、KpnI或BamHI。
6.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***，其特征在于所述报告***是将灭瘟素脱氨酶基因的C-端与绿色荧光蛋白基因GFP的N-端拼接，拼接处***两个限制性核酸内切酶酶切位点；所述两个限制性核酸内切酶酶切位点之一为I-SceI。
7.一种权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试***在预测特定sgRNA介导的基因编辑效率中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用方法为：通过分子克隆，在用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***的两个酶切位点之间***sgRNA靶向的目标DNA序列；然后将表达sgRNA的质粒、表达Cas9的质粒和***目标DNA序列的报告***共转染哺乳动物细胞株，转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP阳性细胞的频率或结合常规双荧光素酶报告基因检测试剂盒，利用酶标仪测量萤火虫荧光素酶基因FLuc和海肾荧光素酶RLuc活性，筛选有效sgRNA，预测所述有效sgRNA在细胞内介导内源基因编辑的效率。
9.一种权利要求1所述用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***在检测和定量突变型非同源末端连接及所产生突变中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用是将用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告***编辑的质粒功能框克隆到小鼠基因组ROSA26位点靶向载体pROSA26上形成载体质粒，再利用ROSA26的定点靶向将所述载体质粒中的功能框完整整合到小鼠胚胎干细胞ROSA26位点，建立突变型非同源末端连接报告细胞，利用建立在细胞中的突变型非同源末端连接报告***，结合常规的细胞学技术和分子生物学技术，检测和定量突变型非同源末端连接及所产生突变；所述报告***的限制性内切酶之一为限制性核酸内切酶I-SceI。
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