CN105646677A - 人***瘤病毒58e7蛋白表达纯化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达纯化方法,通过设计HPV-58E7的扩增引物,从HPV-58阳性细胞中有效扩增出该基因,将含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序***到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中,获得重组载体,再与Glutathione-Sepharose?4B磁珠结合,切除GST标签,获取HPV-58E7蛋白,经PBS透析过夜纯化。本发明获得的人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白,通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体,可在制备多克隆抗体中应用。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备,具体涉及人***瘤病毒58型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。
背景技术
***是最常见的女性生殖***肿瘤之一,我国***发病率居世界第二位,且呈逐年升高和年轻化的趋势,其中青年女性(≤30岁)中***发病率以每年2%-3%的速度增长。研究证实,高危型人***瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)的持续感染是***及癌前病变发生的主要原因。HPV58属于高危型HPV病毒中的一种常见亚型,在我国***患者中,HPV58感染病例数占总HPV感染病例数的11.5%~28%,仅次于HPV16和HPV18,HPV-58E7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持,也可作为感染干预性研究提供理论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法,HPV-58E7蛋白抗体的发明可为HPV临床检测提供新的方法,同时为科学研究提供新的方法学基础。
HPV58型是引起***的主要原因之一,目前的检测手段很有限,如PCR,容易造成假阳性,或假阴性。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达、纯化方法,通过以下步骤实现:
(1)HPV-58E7基因的调取及扩增:设计HPV-58E7的扩增引物,并从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中有效扩增出该基因,其中用于扩增用于原核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.1:5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’,划线部分为BamHⅠ酶切位点,下游引物序列为SEQIDNO.2:5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’,划线部分为EcoRⅠ酶切位点;
用于扩增真核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.3:5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’,划线部分为EcoRⅠ酶切位点,下游引物序列为SEQIDNO.4:5’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’,划线部分为BamHⅠ酶切位点;
(2)HPV-58E7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序***到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中,获得用于后续实验的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-C1-(HPV-58E7);
(3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表达:将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)转入大肠埃希菌DH5α,待细菌OD值介于0.6-0.8之间,加IPTG至终浓度为0.2mM,并在26-28℃的诱导温度下,诱导4-6h后收集细菌,在250-300W超声功率下,超声时间9秒,间歇时间9秒,总时长约3min以破碎细菌,收集上清;
(4)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的纯化及HPV-58E7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose4B磁珠(GEhealthcare)结合,再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST标签,获取HPV-58E7蛋白,PBS透析过夜获得纯化的HPV-58E7蛋白。
在设计蛋白表达载体时,选择含GST标签的pGEX-4T2,有利于蛋白表达的可溶性,且在蛋白纯化后,可将GST标签切除,使获得的蛋白更接近天然HPV-58E7蛋白。在诱导蛋白表达时为避免形成不可溶的包涵体,采取了优化IPTG浓度,诱导时间,降低了诱导温度等措施。
大肠埃希菌宿主DH5α、真核表达载体pEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa。原核表达载体pGEX-4T2从GEhealthcare公司购得。
本发明的另一个目的是提供人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。本发明获得的人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白,通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体。
利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建,在引物的两端引入酶切位点,通过酶切产生粘性末端,可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见(J.萨姆布鲁克等,《分子克隆实验指南》第三版,科学出版社,2008.)。
转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法,如电穿孔、制备感受态细胞等。成功转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定,如细菌经收集并裂解,提取质粒,然后PCR鉴定、酶切鉴定或测序鉴定。
体外获得HPV-58E7蛋白,是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达GST-HPV-58E7融合蛋白,经过纯化,并切除GST标签蛋白,最终得到HPV-58E7蛋白。该蛋白在***发病机制研究中极具前景,是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。
病毒蛋白一般具有不同程度的毒性,原核表达极容易形成不溶性的包涵体,申请人前期在大量的实验条件下,摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签,并降低IPTG浓度,降低诱导时的温度,缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性,从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度,在提高表达量的同时也有利于分离纯化,使该蛋白在工业化放大生产时降低难度,减少成本。为进一步研究治疗***奠定基础。
HPV58型是引起***的主要原因之一,目前的检测手段很有限,如PCR,容易造成假阳性,或假阴性。HPV-58抗体的发明可通过免疫组化,免疫荧光,酶联免疫吸附反应等技术来检测HPV58型病毒的感染,并且可与PCR技术联用,来检测HPV58型的感染,能大大提高检测的准确率。
附图说明
图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-58E7)的电泳示意图。图中泳道M1:TaKaRaDL2,000DNAmarker;泳道1:HPV-58E7基因(用PCR法从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中扩增得到);泳道2:pGEX-4T2质粒;泳道3:pGEX-4T2质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切;泳道4:重组pGEX-4T2-HPV-58E7质粒;泳道5:重组pGEX-4T2-HPV-58E7质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切;泳道M2:TaKaRaDL15,000DNAmarker。
图2为重组质粒pEGFP-C1-(HPV-58E7)的电泳示意图。图中泳道M1:TaKaRaDL2,000DNAmarker;泳道1:HPV-58E7基因(用PCR法从pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒中扩增得到);泳道2:pEGFP-C1质粒;泳道3:pEGFP-C1质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切;泳道4:重组pEGFP-C1-(HPV-58E7)质粒;泳道5:重组pEGFP-C1-(HPV-58E7)质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切;泳道M2:TaKaRaDL15,000DNAmarker。
图3为重组蛋白GST-HPV-58E7诱导表达的PAGE分析。图中泳道M:蛋白预染marker;泳道1:含pGEX-4T2-HPV-58E7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的上清;泳道2:含pGEX-4T2-HPV-58E7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的沉淀。
图4为重组蛋白GST-HPV-58E7诱导表达后纯化、酶切的PAGE分析。图中泳道M:蛋白预染marker;泳道1、2:纯化酶切后的HPV-58E7蛋白;泳道3、4:透析后的HPV-58E7蛋白。
图5为Westernblotting检测HPV-58E7在293T细胞中的表达。图中泳道1:293T;泳道2:293T转染pEGFP-C1质粒;泳道3:293T转染pEGFP-C1-HPV-58E7质粒;泳道4:HPV-58E7蛋白。
图6为免疫荧光检测HPV-58E7在293T细胞中的表达。
图7为免疫组化检测HPV-58E7病理标本中的表达。图中白色箭头:未感染HPV-58E7的细胞,黑色箭头:感染HPV-58E7的细胞。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。
实施例1:HPV58型E7基因原核表达载体的构建
用PCR方法从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞扩增出HPV-58基因(SEQIDNO.5),所用的引物HPV-58E7_Pup(SEQIDNO.1)、HPV-58E7_Pdn(SEQIDNO.2)由擎科生物合成。用于原核表达的上下游引物分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点
HPV-58E7_Pup:5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’
HPV-58E7_Pdn:5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’
PCR反应条件:50μL反应体系中,加入5μLHPV-58阳性人宫颈上皮细胞溶液,20μmol/L的上下游引物各1μL,2.5mmol/L的dNTPmixture4μL,5×Buffer(Mg2+plus)10μL,rTaq聚合酶0.5μL,剩余用ddH2O补足。用ABI公司的(型号为2720)PCR仪,PCR反应条件为94℃预变性5min;94℃变性30s;56℃退火30s;72℃延伸30s,共40个循环以后,再72℃延伸7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为317bp的用与原核表达的DNA片段。将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
原核表达质粒pGEX-4T2及HPV-58E7序列用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,以适当比例将上述线性pGEX-4T2和HPV-58E7基因片段混合,用T4DNA连接酶在16℃水浴中连接过夜。然后转化入DH5α后,铺于含100μg/mLAmp的LB琼脂平皿,37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中,37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒,并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切进行初步鉴定,阳性克隆送擎科生物进一步测序验证正确。从而完成HPV-58E7基因原核表达载体的构建(见图1)。
实施例2:HPV58型E7基因真核表达载体的构建
用PCR方法从pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒中扩增出HPV-58基因,所用的引物HPV-58E7_Eup(SEQIDNO.3)、HPV-58E7_Edn(SEQIDNO.4)由擎科生物合成。用于真核表达的上下游引物分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。
HPV-58E7_Eup:5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’
HPV-58E7_Edn:’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’
PCR反应条件:50μL反应体系中,加入1μLpGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒,20μmol/L的上下游引物各1μL,2.5mmol/L的dNTPmixture4μL,5×Buffer(Mg2+plus)10μL,rTaq聚合酶0.5μL,剩余用ddH2O补足。用ABI公司的(型号为2720)PCR仪,PCR反应条件为94℃预变性5min;94℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸30s,共40个循环以后,再72℃延伸7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为317bp的用于真核表达的HPV-58E7序列。将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
真核表达质粒pEGFP-C1及HPV-58E7序列用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切。以适当比例将上述线性pEGFP-C1和HPV-58E7基因片段混合,用T4DNA连接酶在16℃水浴中连接过夜。转化入DH5α后,铺于含50μg/mLkana的LB琼脂平皿,37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含50μg/mLkana的LB液体培养基中,37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pEGFP-C1-(HPV-58E7)质粒,并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切进行初步鉴定,阳性克隆送擎科生物进一步测序验证正确。从而完成HPV-58E7基因真核表达载体的构建(见图2)。
实施例3:HPV58型E7蛋白的诱导表达
pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒分别转化至大肠杆菌DH5α,接种于含氨苄青霉素(Amp)100μg/mL的LB培养液,待细菌OD值介于0.6-0.8之间,加IPTG至终浓度为0.2mM,诱导温度:26-28℃,诱导4-6h后收集细菌,冰浴超声裂解菌体,4℃12000rpm10min离心分离上清和沉淀,并经15%聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图3)。
实施例4:HPV58型E7蛋白的纯化和酶切
取菌体上清与Glutathione-Sepharose4B磁珠结合,再用凝血酶切除GST标签,获取HPV-58E7蛋白,PBS透析蛋白过夜,并经聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图4)。
实施例5:HPV58E7蛋白兔多克隆抗体的制备和纯化
用纯化后的HPV-58E7蛋白免疫新西兰雌兔,体重为2.5kg为宜。初次免疫用含E7蛋白500μg的抗原完全弗氏佐剂乳化剂1.6mL于兔子背部多点皮内注射,以后每隔10d用含E7蛋白500μg的抗原不完全弗氏佐剂乳化剂加强免疫3次。耳缘静脉采血,双向免疫扩散法测定血清中多价抗血清效价(1:8以上符合要求)。10d后,E7蛋白500μg直接腹股沟区肌肉注射。5d后麻醉下心脏取血,分离血清后分装并置-20℃保存。血清按rProteinGAgaros说明书操作,亲和层析获得抗体IgG。
实施例6:HPV58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(Westernblot)
转染24h前将293T细胞以5×106个/mL浓度接种于10cm的培养皿(含10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%CO2、37℃)。转染前,培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine2000说明书操作,将质粒pEGFP-C1、重组质粒pEGFP-C1-(HPV-58E7)各取10μg分别与20μl转染试剂Lipofectamine2000在DMEM培养基中形成复合物,混合室温放置30min后覆盖于10cm的培养皿,293T未转染细胞做转染空白对照。转染6h后,将培养基换成含10%FBS的DMEM,培养24h后,荧光显微镜下观察转染效率,终止转染。用RIPA细胞裂解液提取蛋白,用BCA试剂盒(碧云天)测蛋白浓度,以每孔40μg的总蛋白经95℃变性后5min后,以10%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜,5%脱脂奶粉封闭2h,以兔抗HPV58型E7多克隆抗IgG为一抗,稀释比1:5000,1:5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹,ECL显色(见图5)。
实施例7:HPV58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫荧光)
转染24h前将293T细胞以2.5×105个/mL浓度接种于放有细胞爬片的6孔板(含10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%CO2、37℃)。转染前,培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine2000说明书操作,将质粒pEGFP-C1、重组质粒pEGFP-C1-(HPV-58E7)各取4μg分别与8μl转染试剂Lipofectamine2000在DMEM培养基中形成复合物,混合室温放置30min后覆盖于6孔板中,293T未转染细胞做转染空白对照。培养24h后,荧光显微镜下观察转染效率,终止转染。将6孔板中的细胞爬片用PBS洗3遍后依次4%多聚甲醛室温固定10min、0.1%TritonX-100室温孵育7min,期间PBS洗3遍,每次5min。置于4℃保存或进行免疫荧光分析。免疫荧光实验在暗盒中进行。取出上述爬有293T细胞(转染pEGFP-C1质粒的细胞作对照)盖玻片于10%山羊血清室温封闭2h,1:500(5%山羊血清稀释)的HPV-58E7兔多克隆抗体IgG为一抗4℃孵育过夜,1:500(5%山羊血清稀释)的AlexaFlour555羊抗兔IgG为二抗室温孵育1h,0.5μg/mlDAPI染色8min,期间用PBS洗3遍每次5min。封片后荧光显微镜观察(见图6)
实施例9:HPV58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫组化)
收集临床***标本,通过RT-PCR鉴定HPV感染的类型。取HPV58型阳性的组织,通过包埋,切片,烤片,脱蜡,抗原修复(柠檬酸缓冲液),血清封闭。一抗(1:500),4℃孵育过夜。PBS洗三次后,滴加二抗(1:1000),室37℃静置1h,PBS再洗三次后,DAB显色5-10min。自来水冲洗10min,苏木精复染,盐酸酒精分化,自来水再冲洗10min。脱水后封片镜检(见图7)。
Claims (3)
1.人***瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法,通过以下步骤实现:
(1)HPV-58E7基因的调取及扩增:设计HPV-58E7的扩增引物,并从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中有效扩增出这个基因,其中用于扩增用于原核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.1:5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’,划线部分为BamHⅠ酶切位点,下游引物序列为SEQIDNO.2:5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’,划线部分为EcoRⅠ酶切位点;
用于扩增用于真核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.3:5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’,划线部分为EcoRⅠ酶切位点,下游引物序列为SEQIDNO.4:5’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’,划线部分为BamHⅠ酶切位点;
(2)HPV-58E7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序***到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中,获得用于后续实验的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-C1-(HPV-58E7);
(3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表达:将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)转入大肠埃希菌DH5α,待细菌OD值介于0.6-0.8之间,加IPTG至终浓度为0.2mM,并在26-28℃的诱导温度下,诱导4-6h后收集细菌,在250-300W超声功率下,超声时间9秒,间歇时间9秒,总时长约3min以破碎细菌,收集上清;
(4)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的纯化及HPV-58E7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose4B磁珠结合,再用凝血酶切除GST标签,获取HPV-58E7蛋白,PBS透析过夜获得纯化的HPV-58E7蛋白。
2.根据权利要求1所述的人***瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法,其特征在于,步骤(1)、(2)、(3)中,大肠埃希菌宿主DH5α、真核表达载体pEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa,原核表达载体pGEX-4T2从GEhealthcare公司购得。
3.根据权利要求1所述方法获得的人***瘤病毒58E7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
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CN1381583A (zh) * | 2002-04-24 | 2002-11-27 | 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 | 人***瘤病毒e6/e7融合基因及其高效表达载体和融合蛋白疫苗 |
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2016
- 2016-03-28 CN CN201610186695.6A patent/CN105646677A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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CN1381583A (zh) * | 2002-04-24 | 2002-11-27 | 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 | 人***瘤病毒e6/e7融合基因及其高效表达载体和融合蛋白疫苗 |
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