CN105646677A - 人***瘤病毒58e7蛋白表达纯化方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达纯化方法，通过设计HPV-58E7的扩增引物，从HPV-58阳性细胞中有效扩增出该基因，将含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序***到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，再与Glutathione-Sepharose？4B磁珠结合，切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，经PBS透析过夜纯化。本发明获得的人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体，可在制备多克隆抗体中应用。

Description

人***瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法及应用
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备，具体涉及人***瘤病毒58型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。
背景技术
***是最常见的女性生殖***肿瘤之一，我国***发病率居世界第二位，且呈逐年升高和年轻化的趋势，其中青年女性(≤30岁)中***发病率以每年2％-3％的速度增长。研究证实，高危型人***瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)的持续感染是***及癌前病变发生的主要原因。HPV58属于高危型HPV病毒中的一种常见亚型，在我国***患者中，HPV58感染病例数占总HPV感染病例数的11.5％～28％，仅次于HPV16和HPV18，HPV-58E7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持，也可作为感染干预性研究提供理论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法，HPV-58E7蛋白抗体的发明可为HPV临床检测提供新的方法，同时为科学研究提供新的方法学基础。
HPV58型是引起***的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR,容易造成假阳性，或假阴性。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达、纯化方法，通过以下步骤实现：
(1)HPV-58E7基因的调取及扩增：设计HPV-58E7的扩增引物，并从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.1：5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物序列为SEQIDNO.2：5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点；
用于扩增真核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.3：5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列为SEQIDNO.4：5’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；
(2)HPV-58E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序***到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得用于后续实验的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-C1-(HPV-58E7)；
(3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表达：将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)转入大肠埃希菌DH5α，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，并在26-28℃的诱导温度下，诱导4-6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清；
(4)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的纯化及HPV-58E7蛋白的获得：通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose4B磁珠(GEhealthcare)结合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV-58E7蛋白。
在设计蛋白表达载体时，选择含GST标签的pGEX-4T2，有利于蛋白表达的可溶性，且在蛋白纯化后，可将GST标签切除，使获得的蛋白更接近天然HPV-58E7蛋白。在诱导蛋白表达时为避免形成不可溶的包涵体，采取了优化IPTG浓度，诱导时间，降低了诱导温度等措施。
大肠埃希菌宿主DH5α、真核表达载体pEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa。原核表达载体pGEX-4T2从GEhealthcare公司购得。
本发明的另一个目的是提供人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。本发明获得的人类***瘤病毒HPV-58E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体。
利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建，在引物的两端引入酶切位点，通过酶切产生粘性末端，可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2008.)。
转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法，如电穿孔、制备感受态细胞等。成功转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细菌经收集并裂解，提取质粒，然后PCR鉴定、酶切鉴定或测序鉴定。
体外获得HPV-58E7蛋白，是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达GST-HPV-58E7融合蛋白，经过纯化，并切除GST标签蛋白，最终得到HPV-58E7蛋白。该蛋白在***发病机制研究中极具前景，是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。
病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表达极容易形成不溶性的包涵体，申请人前期在大量的实验条件下，摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签，并降低IPTG浓度，降低诱导时的温度，缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本。为进一步研究治疗***奠定基础。
HPV58型是引起***的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR,容易造成假阳性，或假阴性。HPV-58抗体的发明可通过免疫组化，免疫荧光，酶联免疫吸附反应等技术来检测HPV58型病毒的感染，并且可与PCR技术联用，来检测HPV58型的感染，能大大提高检测的准确率。
附图说明
图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-58E7)的电泳示意图。图中泳道M1：TaKaRaDL2,000DNAmarker；泳道1：HPV-58E7基因(用PCR法从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中扩增得到)；泳道2：pGEX-4T2质粒；泳道3：pGEX-4T2质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道4：重组pGEX-4T2-HPV-58E7质粒；泳道5：重组pGEX-4T2-HPV-58E7质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道M2：TaKaRaDL15,000DNAmarker。
图2为重组质粒pEGFP-C1-(HPV-58E7)的电泳示意图。图中泳道M1：TaKaRaDL2,000DNAmarker；泳道1：HPV-58E7基因(用PCR法从pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒中扩增得到)；泳道2：pEGFP-C1质粒；泳道3：pEGFP-C1质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道4：重组pEGFP-C1-(HPV-58E7)质粒；泳道5：重组pEGFP-C1-(HPV-58E7)质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道M2：TaKaRaDL15,000DNAmarker。
图3为重组蛋白GST-HPV-58E7诱导表达的PAGE分析。图中泳道M：蛋白预染marker；泳道1：含pGEX-4T2-HPV-58E7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的上清；泳道2：含pGEX-4T2-HPV-58E7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的沉淀。
图4为重组蛋白GST-HPV-58E7诱导表达后纯化、酶切的PAGE分析。图中泳道M：蛋白预染marker；泳道1、2：纯化酶切后的HPV-58E7蛋白；泳道3、4：透析后的HPV-58E7蛋白。
图5为Westernblotting检测HPV-58E7在293T细胞中的表达。图中泳道1：293T；泳道2：293T转染pEGFP-C1质粒；泳道3：293T转染pEGFP-C1-HPV-58E7质粒；泳道4：HPV-58E7蛋白。
图6为免疫荧光检测HPV-58E7在293T细胞中的表达。
图7为免疫组化检测HPV-58E7病理标本中的表达。图中白色箭头：未感染HPV-58E7的细胞，黑色箭头：感染HPV-58E7的细胞。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。
实施例1：HPV58型E7基因原核表达载体的构建
用PCR方法从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞扩增出HPV-58基因(SEQIDNO.5)，所用的引物HPV-58E7_Pup(SEQIDNO.1)、HPV-58E7_Pdn(SEQIDNO.2)由擎科生物合成。用于原核表达的上下游引物分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点
HPV-58E7_Pup：5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’
HPV-58E7_Pdn：5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’
PCR反应条件：50μL反应体系中，加入5μLHPV-58阳性人宫颈上皮细胞溶液，20μmol/L的上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTPmixture4μL，5×Buffer(Mg2+plus)10μL，rTaq聚合酶0.5μL，剩余用ddH2O补足。用ABI公司的(型号为2720)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，共40个循环以后，再72℃延伸7min。通过1.5％凝胶电泳分析得到预期为317bp的用与原核表达的DNA片段。将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
原核表达质粒pGEX-4T2及HPV-58E7序列用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，以适当比例将上述线性pGEX-4T2和HPV-58E7基因片段混合，用T4DNA连接酶在16℃水浴中连接过夜。然后转化入DH5α后，铺于含100μg/mLAmp的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒，并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送擎科生物进一步测序验证正确。从而完成HPV-58E7基因原核表达载体的构建(见图1)。
实施例2：HPV58型E7基因真核表达载体的构建
用PCR方法从pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒中扩增出HPV-58基因，所用的引物HPV-58E7_Eup(SEQIDNO.3)、HPV-58E7_Edn(SEQIDNO.4)由擎科生物合成。用于真核表达的上下游引物分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。
HPV-58E7_Eup：5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’
HPV-58E7_Edn：’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’
PCR反应条件：50μL反应体系中，加入1μLpGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒，20μmol/L的上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTPmixture4μL，5×Buffer(Mg2+plus)10μL，rTaq聚合酶0.5μL，剩余用ddH2O补足。用ABI公司的(型号为2720)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s，共40个循环以后，再72℃延伸7min。通过1.5％凝胶电泳分析得到预期为317bp的用于真核表达的HPV-58E7序列。将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
真核表达质粒pEGFP-C1及HPV-58E7序列用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切。以适当比例将上述线性pEGFP-C1和HPV-58E7基因片段混合，用T4DNA连接酶在16℃水浴中连接过夜。转化入DH5α后，铺于含50μg/mLkana的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含50μg/mLkana的LB液体培养基中，37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pEGFP-C1-(HPV-58E7)质粒，并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送擎科生物进一步测序验证正确。从而完成HPV-58E7基因真核表达载体的构建(见图2)。
实施例3：HPV58型E7蛋白的诱导表达
pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒分别转化至大肠杆菌DH5α，接种于含氨苄青霉素(Amp)100μg/mL的LB培养液，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，诱导温度：26-28℃，诱导4-6h后收集细菌，冰浴超声裂解菌体，4℃12000rpm10min离心分离上清和沉淀，并经15％聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图3)。
实施例4：HPV58型E7蛋白的纯化和酶切
取菌体上清与Glutathione-Sepharose4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，PBS透析蛋白过夜，并经聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图4)。
实施例5：HPV58E7蛋白兔多克隆抗体的制备和纯化
用纯化后的HPV-58E7蛋白免疫新西兰雌兔，体重为2.5kg为宜。初次免疫用含E7蛋白500μg的抗原完全弗氏佐剂乳化剂1.6mL于兔子背部多点皮内注射，以后每隔10d用含E7蛋白500μg的抗原不完全弗氏佐剂乳化剂加强免疫3次。耳缘静脉采血，双向免疫扩散法测定血清中多价抗血清效价(1：8以上符合要求)。10d后，E7蛋白500μg直接腹股沟区肌肉注射。5d后麻醉下心脏取血，分离血清后分装并置-20℃保存。血清按rProteinGAgaros说明书操作，亲和层析获得抗体IgG。
实施例6：HPV58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(Westernblot)
转染24h前将293T细胞以5×106个/mL浓度接种于10cm的培养皿(含10％FBS和双抗的DMEM培养基、5％CO2、37℃)。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine2000说明书操作，将质粒pEGFP-C1、重组质粒pEGFP-C1-(HPV-58E7)各取10μg分别与20μl转染试剂Lipofectamine2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30min后覆盖于10cm的培养皿，293T未转染细胞做转染空白对照。转染6h后，将培养基换成含10％FBS的DMEM，培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。用RIPA细胞裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒(碧云天)测蛋白浓度，以每孔40μg的总蛋白经95℃变性后5min后，以10％SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5％脱脂奶粉封闭2h，以兔抗HPV58型E7多克隆抗IgG为一抗，稀释比1：5000，1：5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹，ECL显色(见图5)。
实施例7：HPV58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫荧光)
转染24h前将293T细胞以2.5×105个/mL浓度接种于放有细胞爬片的6孔板(含10％FBS和双抗的DMEM培养基、5％CO2、37℃)。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine2000说明书操作，将质粒pEGFP-C1、重组质粒pEGFP-C1-(HPV-58E7)各取4μg分别与8μl转染试剂Lipofectamine2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30min后覆盖于6孔板中，293T未转染细胞做转染空白对照。培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。将6孔板中的细胞爬片用PBS洗3遍后依次4％多聚甲醛室温固定10min、0.1％TritonX-100室温孵育7min，期间PBS洗3遍，每次5min。置于4℃保存或进行免疫荧光分析。免疫荧光实验在暗盒中进行。取出上述爬有293T细胞(转染pEGFP-C1质粒的细胞作对照)盖玻片于10％山羊血清室温封闭2h，1：500(5％山羊血清稀释)的HPV-58E7兔多克隆抗体IgG为一抗4℃孵育过夜，1：500(5％山羊血清稀释)的AlexaFlour555羊抗兔IgG为二抗室温孵育1h，0.5μg/mlDAPI染色8min，期间用PBS洗3遍每次5min。封片后荧光显微镜观察(见图6)
实施例9：HPV58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫组化)
收集临床***标本，通过RT-PCR鉴定HPV感染的类型。取HPV58型阳性的组织，通过包埋，切片，烤片，脱蜡，抗原修复(柠檬酸缓冲液)，血清封闭。一抗(1：500)，4℃孵育过夜。PBS洗三次后，滴加二抗(1：1000)，室37℃静置1h，PBS再洗三次后，DAB显色5-10min。自来水冲洗10min，苏木精复染，盐酸酒精分化，自来水再冲洗10min。脱水后封片镜检(见图7)。

Claims (3)

1.人***瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现：
(1)HPV-58E7基因的调取及扩增：设计HPV-58E7的扩增引物，并从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.1：5’-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物序列为SEQIDNO.2：5’-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点；
用于扩增用于真核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQIDNO.3：5’-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列为SEQIDNO.4：5’-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；
(2)HPV-58E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序***到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得用于后续实验的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-C1-(HPV-58E7)；
(3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表达：将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)转入大肠埃希菌DH5α，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，并在26-28℃的诱导温度下，诱导4-6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清；
(4)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的纯化及HPV-58E7蛋白的获得：通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV-58E7蛋白。
2.根据权利要求1所述的人***瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中，大肠埃希菌宿主DH5α、真核表达载体pEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa，原核表达载体pGEX-4T2从GEhealthcare公司购得。
3.根据权利要求1所述方法获得的人***瘤病毒58E7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
CN201610186695.6A 2016-03-28 2016-03-28 人***瘤病毒58e7蛋白表达纯化方法及应用 Pending CN105646677A (zh)

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