CN105640993A - 用于***的脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆在预防或治疗肝炎中的用途。具体地，脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆可用于制备治疗乙型肝炎的药物组合物。给需要的对象施用所述的药物组合物，可以使乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体等指标改善，并显著减少肝炎病毒DNA，降低ALT，从而促进肝功能的修复。

Description

用于***的脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆组合物

技术领域

本发明涉及脂肪干细胞应用领域，具体地，本发明提供了一种脂肪干细胞用于***的用途。

背景技术

肝病分为病毒性肝病和非病毒性肝炎。病毒性肝炎主要包括甲、乙、丙、丁、戊型病毒性肝炎，非病毒性肝病主要包括酒精性肝病、药物或毒物性肝病、新陈代谢异常性肝病、脂肪性肝病。慢性乙型肝炎呈全球分布，可能导致包括肝功能失代偿、肝硬化以及肝细胞癌等疾病。活动性乙肝病毒(HBV)复制是肝损伤和疾病进展的主要驱动因素。

重型乙型肝炎是感染HBV后导致的重型肝炎，其发病凶险，进展迅速，绝大部分患者预后不良，可迅速出现大面积肝细胞坏死导致肝功能严重受损，肝脏代谢、***和解读的功能减退。从而导致机体免疫能力下降，造成恶性循环。目前临床上缺乏有效的治疗手段，主要是血浆置换和肝移植，但由于供体缺乏，很多患者在等待移植供体期间死亡。因此，及时有效的肝功能支持和促进肝细胞再生可能帮助肝功能衰竭患者无需肝移植而自行恢复或者度过等待移植的难关。

传统药物α干扰素能够有效地抑制病毒复制，疗效相对持久，但其适用的人群范围窄，不良反应发生率较高。而新一代的干扰素-聚乙醇化干扰素，它的疗效略优于普通干扰素，但其仍然具有使用患者群窄，不良反应发生率较高，价格较贵的缺点。拉夫米定是第一个核苷类似物，能够快速、持久抑制病毒复制，改善肝功能，延缓乙肝疾病进展的药物，但其HBeAg血清转阴率低。文献报道服用拉米夫定1年HBeAg血清转阴率为16％左右，停药后容易复发、病毒不能彻底清除随治疗时间延长，病毒耐药突变的发生率增高(第1、2、3、4年分别为14％、38％、49％、66％)。阿德福韦酯长期治疗耐药发生率低，对拉米夫定耐药者仍有效，但其抗病毒作用较弱，起效慢，有潜在的肾毒性。恩替卡韦的抗病毒作用强，耐药率低，在动物实验发现致癌性，且价格较贵。替比夫定抗病毒作用强，HBeAg转换率高，但其变异率较高，有肌酸激酶升高等副作用，上市时间短，抗病毒作用，长期疗效和安全性都有待证实。核苷(酸)类似药物均不能随便停药，长期服用乙肝病毒轻易发生变异耐药，也会出现像流感样、厌食、恶心、腹泻、抑郁、心绞痛等副作用。而且，抗病毒治疗只能抑制HBV复制，不能彻底清除病毒，也无法修复肝炎导致的肝细胞坏死。

目前，乙肝的治疗主要是抗病毒治疗。而现阶段的抗病毒药物只能抑制HBV复制，尚不能彻底清除病毒，也无法修复肝炎导致的肝细胞坏死。因此感染乙肝病毒后容易形成慢性乙肝，有可能导致肝硬化、肝癌等发生。

综上所述，本领域尚缺乏一种能够有效治疗乙型肝炎，特别是能够彻底清除乙肝病毒，修复肝炎导致的肝细胞坏死的手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效治疗乙型肝炎，特别是能够彻底清除乙肝病毒，修复肝炎导致的肝细胞坏死的手段。

本发明的第一方面，提供了一种脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆组合物的用途，用于制备***的药物组合物。

在另一优选例中，所述的组合物中，所述脂肪间充质祖细胞的含量为1×10⁶/ml-1×10⁸/ml。

在另一优选例中，所述的组合物中，所述脂肪间充质祖细胞与所述富含血小板的血浆的体积比为1:9～2:8。

在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是传代培养的脂肪间充质祖细胞。

在另一优选例中，在所述组合物中，主要活性成分仅为脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括：脂肪间充质祖细胞、富含血小板的血浆，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的载体是输液剂载体和/或注射剂载体。

在另一优选例中，所述的治疗包括选自下组的一项或多项指标改善：

乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体、乙肝病毒DNA，和ALT。

在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(i)80％以上的细胞具有表面抗原CD29；

(ii)70％以上的细胞具有表面抗原CD73；

(iii)60％以上的细胞具有表面抗原CD105；

(iv)70％以上的细胞具有表面抗原CD90。

在另一优选例中，90％以上的细胞具有表面抗原CD29。

在另一优选例中，80％以上的细胞具有表面抗原CD73。

在另一优选例中，70％以上的细胞具有表面抗原CD105。

在另一优选例中，80％以上的细胞具有表面抗原CD90。

在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(v)在细胞群中，10％以下的细胞具有表面抗原CD34；

(vi)在细胞群中，10％以下的细胞具有表面抗原CD45。

在另一优选例中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34。

在另一优选例中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45。

在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD34。

在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD45。

在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆含有选自下组的细胞因子：干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、人转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、或其任意组合。

在另一优选例中，富含血小板的血浆中干细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.5ng/ml。

在另一优选例中，富含血小板的血浆中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥35pg/ml，较佳地≥40pg/ml。

在另一优选例中，富含血小板的血浆中人转化生长因子β(TGF-β)的浓度≥150pg/ml，较佳地≥180pg/ml。

在另一优选例中，富含血小板的血浆中白介素-2(IL-2)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。

在另一优选例中，富含血小板的血浆中白介素-10(IL-10)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml，最佳地≥40pg/ml。

在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆包括选自下组的一个或多个特征：

红细胞的浓度为≤5×10⁵/mL；

血小板浓度范围为0.5×10⁶-1.5×10¹⁰/mL；

白细胞和红细胞的总浓度为≤10×10⁵/mL。

在另一优选例中，所述富含血小板的血浆具有选自下组的一个或多个特征：

血小板的浓度为5×10⁷-5×10⁸/mL；

白细胞的浓度为≤5×10⁵mL；

红细胞的浓度为≤5×10⁵mL。

在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆中含有一种或多种选自下组的细胞因子：PDGF、TGF-β、VEGF。

在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆中，

PDGF的浓度为400-700mg/ml；较佳地为500-600mg/ml。

TGF-β为1500-2300mg/ml；较佳地为1700-2100mg/ml；更佳地为1800-2000mg/ml。

VEGF为700-1200pg/ml；较佳地为800-1100pg/ml；更佳地为900-1000pg/ml。

在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆中，

PDGF的浓度为543.04±26.1(mg/ml)；

TGF-β为1873.03±81.51(mg/ml)；

VEGF(pg/ml)为937.70±27.38。

本发明的第二方面，提供了一种用于预防或治疗肝炎的药物组合物，所述的药物组合物包括：有效量的脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆，以及药学上可接受的载体；较佳地，所述的药物组合物为静脉注射试剂。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

在另一优选例中，所述的静脉注射试剂中脂肪间充质祖细胞的浓度为0.1-100×10⁷个/ml，较佳地为1-10×10⁷个/ml，更佳地为2-5×10⁸个/ml。

在另一优选例中，所述的静脉注射试剂中富含血小板的血浆的浓度为10v％-20v％。

在另一优选例中，所述的注射试剂的体积为30-70ml。

本发明的第二方面，提供了一种用于预防或治疗肝炎的药物组合试剂盒，所述的试剂盒包括：脂肪间充质祖细胞，富含血小板的血浆，药学上可接受的载体，和说明书；且所述的说明书记载了使用方法。

在另一优选例中，所述的使用方法包括：将脂肪间充质祖细胞，富含血小板的血浆和药学上可接受的载体混合制成制剂，并对治疗对象施用。

在另一优选例中，所述的制剂是注射剂。

本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗肝炎的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用含有：(a)脂肪间充质祖细胞或脂肪间充质祖细胞群、或含有脂肪间充质祖细胞或脂肪间充质祖细胞群；和(b)富含血小板的血浆的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为鼠、兔、牛、羊、猪等。

在另一优选例中，所述的施用方法为静脉回输。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1脂肪细胞分化的油红O染色；

图2脂肪细胞分化的油红O染色对照组(阴性)；

图3haMPC流式检测试验图谱；

图4富含血小板的血浆流式检测试验图谱(A为空白组；B为PRP组)。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆组合物具有极其优异的预防或治疗肝炎(尤其是乙型肝炎)的作用。具体地，给需要的对象施用本发明的含有脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的药物组合物，对于肝炎有显著的预防或治疗作用，可以使多种表面抗原下降，病毒DNA显著减少，并减低ALT，促进肝功能的修复。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95％以上”指≥95％，“0.2％以下”指≤0.2％。

乙型肝炎

乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒(HBV)感染机体后所引起的疾病。

乙肝病毒宿主范围狭窄，且具有明显的嗜肝性，体外培养难度大。乙型肝炎模型涉及乙肝病毒感染及感染后机体免疫反应，因此在治疗过程中不仅需要修复肝脏受损细胞，还需要抑制体内病毒复制及调节免疫反应，与非病毒性肝炎有较大的区别。目前，动物模型主要利用免疫缺陷的动物制成人HBV动物模型。其要求主要是与人临床肝炎特征相似，病毒血症以及血液中免疫学指标维持一定时间，在最大程度上还原乙肝病毒感染人体的疾病状态。而非病毒性肝炎模型，例如酒精性肝病模型、药物性肝炎模型等直接通过饮食或药物进行干预，损伤动物肝脏细胞功能，模拟人体肝炎的临床表现。

常见的乙肝检测指标“乙肝五项”包括乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体。表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白质，自身不具有传染性，但它的出现常伴随着乙肝病毒的存在，因此它的阳性为已经感染乙肝病毒的标志。通常在感染病毒后2-6个月，血清转氨酶还未上升时，便可在血清中测到阳性。急性乙肝患者绝大多数可以在病程初期转阴，但慢性乙肝患者会持续阳性。表面抗体是体内对乙肝病毒免疫和保护性抗体，多在恢复期出现阳性。与此同时，接受乙肝注射疫苗者，绝大多数也呈阳性。e抗原通常在乙肝病毒感染后，表面抗原阳性同时，或其后数天便可测得阳性。e抗体阳性在抗原转阴后数月出现。核心抗体一般在表面抗原出现后3-5周，乙肝症状出现前便会在血清中检查出来。

本发明中，对于乙肝的治疗主要针对于逆转乙肝五项等乙肝病毒相关指标，包括(但并不限于)：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体、乙肝病毒DNA，和ALT。

脂肪

自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。

在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。

富血小板血浆(PRP)

富血小板血浆是从全血中提取的血小板含量超过全血4～5倍的血浆,研究表明PRP体外激活后,其中的血小板α颗粒可释放出多种生长因子，如血小板衍化生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)、转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)、***(insulin-likegrowthfactor,IGF)和表皮生长因子(epidemalgrowthfactor,EGF)等。PRP激活后形成的凝胶状物质又被称为血小板胶(autologousplateletgel,APG)，研究认为参与机体组织的修复如减少出血、抗感染、加速组织愈合、骨组织再生等。故近年来被应用于外科领域包括牙周病、种植义齿及口腔颌面外科等。

PRP源于自体，无免疫反应；含大量生长因子，且比例近似正常生理状态，能充分发挥各生长因子的协同作用；在凝血酶作用下易生成凝胶；良好的止血功能有利于创口愈合和组织再生、减少瘢痕，减轻疼痛；且制取容易，成本低。

研究发现，PRP能够使脂肪间充质祖细胞保持幼稚梭形状态，从而促进其增殖的作用，在不同的生理环境中PRP协同细胞在特定的局部环境中想特定的功能细胞分化，表现特定的功能。因此，PRP促进组织修复的作用可能是为组织修复提供能多的前体细胞，或是刺激存在于不同组织中的干细胞如骨髓干细胞、毛囊干细胞、脂肪干细胞等大量增殖，这些幼稚细胞大量生成的同时，又有其他因子根据创伤的部位、范围等诱导这些幼稚的细胞向不同的组织类型分化修复创伤，完成复杂的机体修复的过程。

但是，PRP中各生长因子间作用机制尚不清楚，且一些基础研究、动物实验和临床疗效之间出现相反结果，使PRP的有效性受到质疑，因此限制了其在临床的应用。

脂肪间充质祖细胞(Humanadiposederivedmesenchymalprogenitorcells)

脂肪来源的间充质祖细胞(Humanadiposederivedmsenchymalprogenitorcells,haMPCs)：不含CD34+细胞，SVF培养P3-P10代纯化扩增获得。

在本发明中，脂肪间充质祖细胞的制备方法可以包括步骤：洗涤脂肪组织，然后用胶原酶消化，离心分离基质血管成分，除去油脂和胶原酶，培养原代细胞，得到传代后的脂肪间充质祖细胞。

脂肪间充质祖细胞的抗原检测

用本发明使用的脂肪间充质祖细胞具有很高的纯度，基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。

脂肪间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。

CD34抗原是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2％，更佳地，≤0.2％。

CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1％。

CD29、CD73、CD49d、CD90等主要存在于脂肪间充质祖细胞表面。

带有CD29的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥80％，更佳地≥90％。

带有CD73的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥80％。

带有CD105的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥60％，更佳地≥70％。

带有CD90的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥80％。

本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪间充质祖细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的脂肪间充质祖细胞、富含血小板的血浆，以及药学上可接受的载体。

通常，可将脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为7-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的脂肪间充质祖细胞、富含血小板的血浆，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常，药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的药物组合物优选为静脉注射试剂。在另一优选例中，所述的皮下注射试剂中脂肪间充质祖细胞的浓度为1×10⁵-2×10⁹个/ml，较佳地为1×10⁶-1×10⁹个/ml，更佳地为1×10⁷-1×10⁸个/ml。

本发明的主要优点：

(1)脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的组合对于肝炎(特别是乙肝)有显著的预防或治疗作用，特别是表现为乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体等乙肝病毒相关指标的逆转。

(2)脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的组合使乙肝细胞多种表面抗原下降，病毒DNA显著减少，并减低谷丙转氨酶ALT。

(3)脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的组合可以促进肝功能的修复。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1haMPC的制备

1.无菌手术器械及耗材

(1)无菌长柄手术镊子5把

(2)无菌100目滤网

(3)灭菌40目滤网

(4)50ml离心管

(5)T175、T75培养瓶

(6)T10ml、T25ml移液管

(7)宽口吸头移液管

2.无菌试剂：

(1)DMEM(无血清培养基)、MSCSFM培养基(life)

(2)I型胶原酶(现配现用)：0.1％胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37℃进行预热。

(3)氯化钠注射液

(4)0.125％Trypsin-0.01％EDTA溶液

(5)1g/L枸橼酸钠

脂肪间充质祖细胞制备:

1.接收脂肪组织，用75％的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；

2.分装脂肪组织，每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。10ml移液管，去吸头，于脂肪采集瓶中先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。

3.洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液变为清澈。

4.胶原酶I消化：加入等量新配制的预热(提前半小时于37℃的气浴摇床预热)的胶原酶I溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到看起来较为平滑。

5.分离基质血管组分(SVF)：将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。

6.净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的除去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。

7.细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。

8.原代细胞培养：

8.1平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。

8.2换液：原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。

9.原代细胞收获：7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，消化收获。

9.1原代细胞收获：在培养瓶中加入消化酶(消化酶为0.125％Trypsin-0.01％EDTA溶液，使用前室温(20～25℃)放置15～25min，每75cm²加入2ml消化酶溶液)，消化时间为1.5～2.5min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。

9.2原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm²，即(3.75～4.5)×10⁵个cells/T75，按照4.5×10⁵个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。培养至细胞融合达85％～90％。

富血小板血浆的制备：

应用二次离心法，用装有1ml枸橼酸钠抗凝剂的注射器一次性采静脉血，离心7分钟(1200r/min)，液体分为上清液层和红细胞层，收集上清液及与其交界面下约2mm液体，二次离心9min(3740r/min)，下层为橙黄色的PRP，约2～3ml即为PRP。进行血小板计数，PRP血小板含量达到或超过全血4倍左右，则为达到要求的PRP。

经上述方法分离的细胞得率：5×10⁵～1×10⁶cells/ml脂肪；

培养第7天，P1代细胞扩增的倍数可以达到1-2倍；

培养第14天，P2代细胞扩增的倍数可以达到4-6倍；

培养第21天，P3代细胞扩增的倍数可以达到10倍。

实施例2脂肪干细胞分化的免疫染色分析(成脂诱导对照及油红O染色实验)

将haMPCs以1.5×10⁵cells/孔的密度接种在六孔板中，以正常培养基培养的样本为成脂分化实验阴性对照组。具体方法是：向基础培养基(DMEM+10％胎牛血清)中加入1μmol/L的***、10μmol/L的胰岛素、200μmol/L的吲哚美辛和0.5mmol/L的异丁基甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，每周换2次液，直到进行成脂染色观察为止，以上对照组均做平行实验(n＝3)。

用0.5％油红O，对成脂诱导后的各组样本进行染色。具体操作方法是：先用D-hanks将样本细胞冲洗充分，然后加入油红稀释染色10～15min。以每组样本随机选取5～10视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。

结论：该结果表明脂肪来源干细胞在成脂诱导剂作用下，脂肪间充质祖细胞能够生成脂质，具有分化为脂肪细胞的能力，图1为脂肪细胞分化的油红O染色；图2为脂肪细胞分化的油红O染色对照组(阴性)；图中的红色为脂滴，可以看到成脂分化后的细胞内出现大量密集在一起的小脂滴。

实施例3haMPC的流式检测和PRP的表面抗原检测

通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×10⁵cells/mL，1,800r/min(120g)离心5min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至1mL，加入抗体5～10μL，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2～3次，确保将未结合抗体除净。最后，加入约200至300μL的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。

haMPC流式检测结果，haMPC流式检测试验图谱如图3所示；

I型胶原酶消化方法分离、培养的P3代细胞MSCs表面抗原流式鉴定结果：

结论:

该结果表明：通过流式细胞仪对脂肪间充质祖细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析该细胞纯度高，大部分为脂肪间充质祖细胞，其中CD34、CD45为间充质祖细胞的阴性标记。

细胞分泌因子的检测

将haMPC在特定培养室培养48h，取上清做检测。取脐带干细胞为对照组

以上结果说明，haMPC混合物分泌的细胞因子大于其它类型干细胞,更有利于细胞的修复。

PRP检测结果

血小板检测

经2次离心后，对收集的PRP进行检测，血小板浓度范围为(7.5～10.0)×10¹¹/L。

细胞因子检测

加入含凝血酶500U/mL的10％CaCl2，按10:1(v/v)与PRP混合，室温静置10min，离心12000r/min，5min，提取萃取液。ELISA检测PRP中PDGF(样品稀释2000倍)、TGF-β(样品稀释1000倍)、VEGF(样品不稀释)浓度，酶标仪检测样品光密度OD值。

检测项目	检查值
		PDGF(ng/ml)	276.52±13.05
TGF-β(ng/ml)	1873.03±81.51
		VEGF(pg/ml)	937.70±27.38

结论：PRP能分泌大量的细胞因子，如PDGF、TGF-β、VEGF等。

流式细胞仪检测血小板活化率

上述离心方法提取PRP后，加上未做任何处理(未激活、未离心)的抗凝全血作为空白组。每100μl样品中加入20μlCD41-FITC和20μlCD62p-PE，4℃避光，15min，流式细胞仪检测样品中活化血小板的百分比。富含血小板的血浆流式检测试验图谱如图4所示(A为空白组；B为PRP组)。

组别	Q1	Q2	Q3	Q4
					空白组	0±0.2	0.2±0.5	96.2±3.12	3.6±1.1
PRP	0.1±0.4	0.5±0.4	94.8±4.15	4.5±1.7

结论：上述离心法提取的血小板与空白组无明显差异，该方法提取的PRP中CD41阳性血小板较少。

CCK-8法检测PRP对haMPC增殖能力的影响

组别	2d	4d	6d	8d	16d
						对照组	1.57±0.19	1.32±0.11	1.24±0.16	1.21±0.21	1.04±0.14
0.5％PRP	1.83±0.15	1.88±0.13	1.78±0.15	2.06±0.17	1.65±0.12
						1％PRP	1.94±0.11	2.08±0.18	2.03±0.21	2.26±0.13	1.89±0.15
2％PRP	2.4±0.16	2.31±0.20	2.31±0.17	2.41±0.12	2.33±0.10
						4％PRP	2.52±0.20	2.61±0.14	2.56±0.18	2.71±0.10	2.53±0.17

(4％PRP组比较0.5％PRP组合空白组，P＜0.05)

结论：PRP能促进haMPC的增殖，且当PRP的浓度在0.5％～4％范围内时，所述促进作用随浓度增加而增加。

实施例4富含血小板的血浆与haMPC组合对乙肝的治疗效果

将收获的细胞注入30ml生理盐水，制备成细胞悬液,以备回输使用。

乙肝患者2例,细胞制备成功后，静脉注射，细胞量＞10⁸，每周注射一次，连续四周。回输前以及回输后的第3个月，6个月分别进行做临床效果评分评估脂肪间充质祖细胞复合物***的疗效。抽血检测乙肝五项,乙肝病毒DNA以及ALT.其结果如下：

患者1，男性，49岁，2011年1月诊断为慢性乙肝并肝功能异常，于2011年7月接受PRP+haMPCs制剂回输治疗，治疗前后检测指标具体如下：

检测项目

回输前

回输后3个月

回输后6个月

乙肝表面抗原	8769	2840	1749
				乙肝表面抗体	<2	<2	<2
乙肝e抗原	0.385	0.134	0.235
				乙肝e抗体	0.002	0.002	0.003
乙肝核心抗体	0.005	0.005	0.005
				乙肝病毒DNA	4.39*10^5	3.72*10^3	1.83*10^3
ALT	65.4	33	28

患者2，男性，39岁，2011年10月诊断慢性乙型肝炎，于2012年4月首次接受PRP+haMPCs细胞回输治疗，治疗前后检查指标具体如下：

检测项目	回输前	回输后3个月	回输后6个月
				乙肝表面抗原	5384	3285	1730
乙肝表面抗体	<2.0	<2.0	<2.0
				乙肝e抗原	3928	2495	1639
乙肝e抗体	8.45	6.73	4.83
				乙肝核心抗体	0.005	0.005	0.005
乙肝病毒DNA	5.34*10^6	4.63*10^6	7.84*10^4
				ALT	66	58	29

从以上结果看出，富含血小板的血浆与haMPC的细胞混合物对于乙肝有治疗作用，可以使表面抗原下降，病毒DNA减少，并减低ALT，促进肝功能的修复。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆组合物的用途，其特征在于，用于制备***的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括：脂肪间充质祖细胞、富含血小板的血浆，和药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗包括选自下组的一项或多项指标改善：

乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体、乙肝病毒DNA，和ALT。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(i)80％以上的细胞具有表面抗原CD29；

(ii)70％以上的细胞具有表面抗原CD73；

(iii)60％以上的细胞具有表面抗原CD105；

(iv)70％以上的细胞具有表面抗原CD90。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(v)在细胞群中，10％以下的细胞具有表面抗原CD34；

(vi)在细胞群中，10％以下的细胞具有表面抗原CD45。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的富含血小板的血浆含有选自下组的细胞因子：干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、人转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、或其任意组合。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的富含血小板的血浆包括选自下组的一个或多个特征：

红细胞的浓度为≤5×10⁵/mL；

血小板浓度范围为0.5×10⁶-1.5×10¹⁰/mL；

白细胞和红细胞的总浓度为≤10×10⁵/mL。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的富含血小板的血浆中含有一种或多种选自下组的细胞因子：PDGF、TGF-β、VEGF。

9.一种用于预防或治疗肝炎的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：有效量的脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆，以及药学上可接受的载体；较佳地，所述的药物组合物为静脉注射试剂。

10.一种用于预防或治疗肝炎的药物组合试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：脂肪间充质祖细胞，富含血小板的血浆，药学上可接受的载体，和说明书；且所述的说明书记载了使用方法。