CN105640992A - 椎间盘退化的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了椎间盘退化的治疗。本发明公开了一种阻止或延缓椎间盘缺损部位的椎间盘退化的方法，其包括将哺乳动物***细胞注射到所述椎间盘缺损部位。

Description

椎间盘退化的治疗
本申请是申请日为2009年3月23日，申请号为200980118119.6，发明名称为“椎间盘退化的治疗”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及椎间盘退化的阻止和延缓。本发明也涉及通过阻止或延缓椎间盘退化治疗退化的椎间盘。本发明也涉及将软骨细胞引入到损伤的椎间盘区中以及阻止或延缓该椎间盘退化的方法。本发明也涉及将至少一种编码转化生长因子β超家族成员的基因引入到至少一种哺乳动物***细胞中的方法，用于阻止或延缓哺乳动物宿主中的椎间盘退化。本发明也涉及将软骨细胞和含有编码转化生长因子β超家族成员的基因的***细胞的混合物引入到损伤的椎间盘区中以及阻止或延缓该椎间盘退化的方法。
发明内容
一方面，本发明涉及阻止或延缓椎间盘缺损部位的椎间盘退化的方法，该方法包括将哺乳动物***细胞注射到椎间盘缺损部位中。该过程优选不使用支架或任何细胞支撑结构。优选地，使用软骨细胞或成纤维细胞，并且受试者优选为人类。如果使用软骨细胞，则该软骨细胞优选为非盘软骨细胞(non-discchondrocyte)，或者幼年软骨细胞，即从小于两岁的孩子中分离出的细胞。其它方面，该软骨细胞可以是预处理的软骨细胞(primedchondrocyte)。特别地，该***细胞可以是相对需要治疗的哺乳动物受试者的同种异体(allogeneic)型的。
一方面，本发明涉及将同种异体幼年软骨细胞或同种异体的非盘软骨细胞引入到损伤的椎间盘区中并阻止或延缓该椎间盘退化的方法。
一方面，本发明可用来阻止或延缓已损伤、撕裂或突出的椎间盘区域的进一步退化。
另一方面，本发明涉及阻止或延缓哺乳动物椎间盘缺损部位的椎间盘退化的方法，该方法包括a)将编码具有椎间盘再生功能的蛋白质的基因***到哺乳动物细胞中，和b)将哺乳动物***细胞移植到椎间盘缺损部位中。该过程优选不使用支架或任何细胞支撑结构。在这种方法中，该基因可属于TGF-β超家族，例如TGF-β，并优选为TGF-β1。该***细胞可以是软骨细胞或成纤维细胞。更优选使用软骨细胞，且哺乳动物受试者优选为人类。该***细胞可以是相对哺乳动物受试者的同种异体型的。
又一方面，本发明涉及阻止或延缓哺乳动物椎间盘缺损部位的椎间盘退化的方法，该方法包括a)将编码具有椎间盘再生功能的蛋白质的基因***到第一哺乳动物***细胞中，和b)将a)中哺乳动物***细胞和未经修饰的(unmodified)第二哺乳动物***细胞的混合物移植到椎间盘缺损部位中。该过程优选不使用支架或任何细胞支撑结构。在这种方法中，该基因可属于TGF-β超家族，例如TGF-β，优选TGF-β1。该第一和第二哺乳动物***细胞可以是软骨细胞或成纤维细胞。在软骨细胞的情况下，该软骨细胞可以是非盘软骨细胞或幼年软骨细胞。特别地，用作第二哺乳动物***细胞的软骨细胞可以是预处理的软骨细胞。在另一方面，该第一或第二哺乳动物***细胞中的一个或两个都可以为相对哺乳动物受试者或相对彼此的同种异体。
附图说明
图1-A～图1-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)可以看到脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，和(iii)使L3/4盘损伤并注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。特别地，混合的细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图2-A～图2-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)可以看出脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。特别地，混合的细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图3-A～图3-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。特别地，混合的细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图4-A～图4-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。特别地，产生TGF-β1的软骨细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图5-A～图5-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。特别地，产生TGF-β1的软骨细胞治疗和混合细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图6-A～图6-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图7-A～图7-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图8-A～图8-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)通过针穿刺使T12/L1盘损伤，无注射，(ii)脊柱部位L1/2处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L2/3盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向T12/L1和L2/3盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)通过针穿刺使T12/L1盘损伤，无注射，(ii)脊柱部位L1/2处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L2/3盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向T12/L1和L2/3盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退化作用。
图9-A～图9-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L2/3盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L3/4处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L4/5盘损伤并注射预处理的软骨细胞；箭头指向L2/3和L4/5盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。预处理的软骨细胞治疗具有椎间抗退化作用。
具体实施方式
如本文使用的关于核酸、蛋白质、蛋白质片段或其衍生物的术语“生物活性”，定义为该核酸或氨基酸序列模拟野生型核酸或蛋白质所诱导的已知生物功能的能力。
如本文使用的术语“***”是连接和支撑其它组织或器官的任何组织，包括但不限于哺乳动物宿主的韧带、软骨、腱、骨和滑膜。
如本文使用的术语“***细胞”或“***的细胞”包括在***中发现的细胞，例如分泌胶原细胞外基质的成纤维细胞、软骨的细胞(软骨细胞)和骨的细胞(成骨细胞/骨细胞)，以及脂肪的细胞(脂肪细胞)和平滑肌细胞。优选地，该***细胞是成纤维细胞、软骨细胞或骨细胞。更优选地，该***细胞是软骨细胞。应当认识到本发明可用***细胞的混合培养物实施，也可以用单一类型的细胞。还应当认识到组织细胞可用例如化学物或放射治疗，以便该细胞稳定表达感兴趣的基因，优选TGF-β1。优选地，该***细胞在注入到宿主有机体中时不会引起不良免疫反应。应当理解同种异体细胞可应用于此，以及自体细胞可应用于细胞介导的基因治疗或体细胞治疗。
如本文使用的“***细胞系”包括起源于共同亲本细胞的多种***细胞。
如本文使用的“透明软骨”是指覆盖关节表面的***。仅为举例，透明软骨包括但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨。
特别地，已知透明软骨能自我更新，对变化起反应并提供较少摩擦的稳定运动。发现甚至在同一关节内或在厚度、细胞密度、基质组成和机械特性不同的关节中透明软骨仍保持相同的总体结构和功能。透明软骨的一些功能包括对压力有惊人的刚性、回弹性和分散重量负荷的特殊能力、将软骨下骨上的峰压力减至最小的能力，和很好的耐久性。
大体上和组织学上，透明软骨表现为抵抗变形的光滑、坚固的表面。软骨的细胞外基质包含软骨细胞，但缺少血管、***或神经。维持软骨细胞和基质之间相互作用的精巧、高度有序的结构起保持透明软骨结构和功能的作用，同时保持低水平的代谢活动。参考文献O'Driscoll,J.BoneJointSurg.,80A:1795-1812,1998详细描述了透明软骨的结构和功能，该文献通过引用整体地合并在此。
如本文使用的“可注射的”组合物是指不包括这种结构的组合物，这种结构为用允许细胞附在其上并允许细胞生长成一层以上的任何材料或形状制成的，一般是植入而非注射的各种三维支架、框架、筛网或毡结构。在一个实施例中，本发明注射方法典型地通过注射器进行。但可采用任何方式注射感兴趣的组合物。例如，也可采用导管、喷雾器，或温度依赖性聚合凝胶。
如本文使用的“幼年软骨细胞”是指从小于两岁的人中获取的软骨细胞。典型地，该软骨细胞优选从肢体的透明软骨区中获得，例如手指、鼻子、耳垂等。幼年软骨细胞可用作治疗缺损或损伤的椎间盘的同种异体的供体软骨细胞。
如本文使用的术语“哺乳动物宿主”包括动物王国的成员，包括但不限于人类。
如本文使用的“混合细胞”或“细胞的混合物”或“细胞混合物”是指多种细胞的组合，该细胞包括用感兴趣的基因转染或转导的第一细胞群和未转导的第二细胞群。
在本发明的一个实施例中，混合细胞可以指多种***细胞的组合，该***细胞包括已用编码转化生长因子β超家族成员的基因或DNA转染或转导的细胞和未用编码转化生长因子β超家族成员的基因转染或转导的细胞。典型地，未用编码转化生长因子β超家族成员的基因转染或转导的细胞与已用TGF超家族基因转染或转导的细胞的比例为3-20:1。该范围可包括约3-10:1。特别地，就细胞数而言，该范围可以为约10:1。但应当理解，这些细胞的比例无需固定到任何特定范围，只要这些细胞的组合可通过减慢或延缓缺损椎间盘的退化而有效治疗损伤的椎间盘即可。
如本文使用的“非盘软骨细胞”是指从除椎间盘软骨组织以外的身体任何部分分离出的软骨细胞。本发明的非盘软骨细胞可用于同种异体移植或注射到患者中从而治疗缺损或损伤的椎间盘。
如本文使用的术语“患者”包括动物王国的成员，包括但不限于人类。
如本文使用的术语“预处理的”细胞是指已被活化或改变从而表达某些基因的细胞。
如本文使用的椎间盘退化的“减慢”或“阻止”是指与给定时间内在导致正常退化的损伤部位正常发现的体积或高度水平相比，椎间盘体积或盘高度随着时间的不断保留。这可表示为与给定时间内预期的正常退化水平相比，体积或高度增大的百分比，例如约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或90％，或可表示为该部位椎间盘的体积或高度损伤或消耗的减轻。
如本文使用的“转化生长因子-β(TGF-β)超家族”包括在胚胎发育期间影响各式各样的分化过程的结构相关的一组蛋白质。该家族包括，正常雄性性发育所需(Behringer等人,Nature,345:167,1990)的穆勒氏抑制物质(MIS)、背腹轴形成和成虫盘形态发生所需(Padgett,等人，Nature,325:81-84,1987)的黑腹果蝇(Drosophiladecapentaplegic)(DPP)基因产物、位于卵植物极(Weeks等人,Cell,51:861-867,1987)的非洲爪蟾Vg-1基因产物、可诱导非洲爪蟾胚胎的中胚层和前结构形成(Thomsen等人，Cell,63:485,1990)的活化素(Mason等人，Biochem,Biophys.Res.Commun.,135:957-964,1986)，和可诱导新生软骨(denovocartilage)和骨形成(Sampath等人，J.Biol.Chem.,265:13198,1990)的骨形态发生蛋白(BMP，如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素，OP-1)。TGF-β基因产物可影响各种分化过程，包括脂肪形成、肌形成、软骨形成、血细胞形成和上皮细胞分化(综述参见Massague,Cell49:437,1987)，其通过引用完整地合并在此。
最初合成了作为大前体蛋白的TGF-β家族蛋白质，然后在距C-端约110-140个氨基酸的一簇碱性残基处进行蛋白水解切割。这些蛋白质的C-端区都是结构相关的，不同家族成员可基于其同源性程度分成不同亚组。虽然特定亚组内氨基酸序列的同源性为70％～90％，但亚组之间的同源性明显较低，一般为20％～50％。在各种情况下，活性种类似乎是C-端片段经二硫化物连接的二聚体。对于已研究的大部分家族成员，发现同源二聚体种类具有生物活性，但对于其它家族成员，如抑制素(Ung等人，Nature,321:779,1986)和TGF-β(Cheifetz等人，Cell,48:409,1987)，也检测到异源二聚体，这些异源二聚体似乎有着不同于各同源二聚体的生物学性质。
TGF-β基因超家族成员包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(鸡)、TGF-β1、TGF-β5(非洲爪蟾)、BMP-2、BMP-4、果蝇DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蝇60A、GDF-1、非洲爪蟾Vgf、BMP-3、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。Massague,Ann.Rev.Biochem.67:753-791中讨论了这些基因，其通过引用整体地合并在此。
优选地，TGF-β基因的超家族成员为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、或BMP-7。
椎间盘
椎间盘构成脊柱长度的四分之一。寰椎(C1)与枢椎(C2)和尾骨之间无椎间盘。椎间盘无血管，因此需要依靠终板来渗透所需营养。终板的软骨层将盘固定在适当的位置。
椎间盘是用作脊柱减震***的纤维软骨垫，其可以保护椎体、脑和其它结构(即，神经)。该椎间盘可以允许一些椎体活动：伸展和弯曲。单个椎间盘的移动是非常有限的—但当数个椎间盘的力结合时可发生相当强的运动。
椎间盘由纤维环和髓核组成。纤维环是坚固的辐射轮胎状结构，该结构由片层(lamellae)，连接到椎体终板的胶原纤维同心薄片组成。该薄片以不同角度取向。纤维环包围着髓核。
尽管纤维环和髓核都由水、胶原蛋白，和蛋白聚糖(PG)组成，但髓核中流体(水和PG)量是最多的。PG分子是很重要的，因为它可吸收并保留水分。髓核含有水合凝胶状物质，其可以抵抗压力。髓核中的水分量可因为每天的活动而有所变化。随着人变老，髓核开始脱水，这限制了它的减震能力。纤维环随着年龄逐渐变得脆弱并开始撕裂。虽然对于一些人这不会引起疼痛，但对于另一些人或这两类人都可引起慢性疼痛。
由脱水的髓核不能减震引起的疼痛称为轴性痛或盘间隙痛。这一般是指髓核因退化性椎间盘疾病逐渐退化。当纤维环由于损伤或老化过程撕裂时，髓核可开始通过裂隙伸出(exclude)。这称为椎间盘突出症。在整个脊柱中每个椎间盘的后侧附近，主要脊神经伸出到不同的器官、组织、肢体等。非常常见的是，突出椎间盘压迫这些神经(挤压神经)，引起放射痛、麻木、刺痛、活动强度和/或范围减小。另外，含有炎性蛋白的内核凝胶与神经的接触还可引起明显疼痛。神经相关的疼痛称为神经根痛。
突出椎间盘有许多名称，对医务人员来说，这些名称可表示不同状况。滑行椎间盘、破裂椎间盘，或膨出椎间盘都可以表示相同的医学病况。椎间盘突出到邻近椎体中称为许莫氏结节(Schmorl，nodes)。
预处理的细胞治疗
本发明包括向哺乳动物的椎间盘区施用预处理的细胞从而通过阻止或延缓椎间盘退化治疗损伤的椎间盘。预处理的细胞典型地为***细胞，并包括软骨细胞或成纤维细胞。
例如，当原始软骨细胞群被传代约3或4次时，它们的形态典型地变为形成纤维的软骨细胞(fibroblasticchondrocyte)。由于原始软骨细胞被传代，因此它们开始丧失一些软骨细胞特征，并开始呈现形成纤维的软骨细胞特征。当用细胞因子，例如TGF-β超家族蛋白质孵化或“预处理”这些形成纤维的软骨细胞时，这些细胞可重新获得软骨细胞特征，该特征包括产生胶原蛋白。
此种预处理的细胞包括形成纤维的软骨细胞，该形成纤维的软骨细胞已用TGFβ1孵化并从而恢复为产生胶原蛋白的软骨细胞。使用预处理的细胞延缓椎间盘退化的优点在于容易形成可用于引入到椎间盘中产生胶原蛋白的软骨细胞，另外的优点在于可维持软骨基质。
该细胞可包括但不限于原始细胞或已经历约1次～20次传代的细胞。该细胞可以是***细胞。该细胞可包括已经历形态发生变化的细胞，其中预处理使原始细胞特性恢复。该细胞包括但不限于软骨细胞、成纤维细胞，或形成纤维的软骨细胞。预处理可这样进行，即，用细胞因子孵化该细胞至少40小时，或1～40小时、2～30小时、3～25小时、4～20小时、5～20小时、6～18小时、7～17小时、8～15小时或9～14小时，然后可选地将该细胞与该细胞因子分离，并将该预处理的细胞注射到感兴趣的软骨缺损部位以便产生软骨，优选透明软骨。一方面，该细胞因子可以为TGF-β超家族成员。特别地，该细胞因子可以是TGF-β，特别是TGF-β1。
该预处理孵化混合物中存在细胞因子，其量可以充分“预处理”软骨细胞从而使它对椎间治疗方法有用。在这方面，该预处理孵化混合物可含有至少约1ng/ml细胞因子。特别地，该混合物含有的细胞因子量可以为约1～1000ng/ml、约1～750ng/ml、约1～500ng/ml、约1～400ng/ml、约1～300ng/ml、约1～250ng/ml、约1～200ng/ml、约1～150ng/ml、约1～100ng/ml、约1～75ng/ml、约1～50ng/ml、约10～500ng/ml、约10～400ng/ml、约10～300ng/ml、约10～250ng/ml、约10～200ng/ml、约10～150ng/ml、约10～100ng/ml、约10～75ng/ml、约10～50ng/ml、约15～500ng/ml、约15～400ng/ml、约15～300ng/ml、约15～250ng/ml、约15～200ng/ml、约15～150ng/ml、约15～100ng/ml、约15～75ng/ml、约15～50ng/ml、约20～500ng/ml、约20～400ng/ml、约20～300ng/ml、约20～250ng/ml、约20～200ng/ml、约20～150ng/ml、约20～100ng/ml、约20～75ng/ml、约20～50ng/ml、约25～500ng/ml、约25～400ng/ml、约25～300ng/ml、约25～250ng/ml、约25～200ng/ml、约25～150ng/ml、约25～100ng/ml、约25～75ng/ml、约25～50ng/ml、约30～500ng/ml、约30～400ng/ml、约30～300ng/ml、约30～250ng/ml、约30～200ng/ml、约30～150ng/ml、约30～100ng/ml、约30～75ng/ml、约30～50ng/ml、约35～500ng/ml、约35～400ng/ml、约35～300ng/ml、约35～250ng/ml、约35～200ng/ml、约35～150ng/ml、约35～100ng/ml、约35～75ng/ml、约35～50ng/ml、约40～500ng/ml、约40～400ng/ml、约40～300ng/ml、约40～250ng/ml、约40～200ng/ml、约40～150ng/ml、约40～100ng/ml、约40～75ng/ml或约40～50ng/ml。
实施本发明的一个方法可包括用细胞因子孵化细胞一定的时间从而形成预处理的细胞，和可选地将细胞因子与该细胞分离，以及将该预处理的细胞注射到椎间盘或靠近它的感兴趣部位中。或者，可用感兴趣的细胞因子孵化该细胞一段时间，并可在不分离出细胞因子的情况下将该组合物施用到缺损部位。
应当理解，尽管在本发明的预处理细胞治疗方案中可一起植入诸如支架或框架以及各种外源性组织等物质，但本发明的注射***中也可以不包括此种支架或组织。在创造性体细胞治疗的优选实施例中，本发明涉及将预处理的***细胞群注射到椎间盘间隙中的简单方法。
技术人员应当理解，用于治疗人患者的细胞来源可以是患者自身的***细胞，例如自体成纤维细胞或软骨细胞，但也可使用所有的同种异体细胞以及异种细胞，无需考虑细胞的组织相容性。或者，在本发明的一个实施例中，可以使用与哺乳动物宿主的组织相容性匹配的同种异体细胞。为进一步详细地描述，确定供体和患者的组织相容性以便向哺乳动物宿主施用组织相容性细胞。同样地，也可异体地使用幼年软骨细胞，无需确定供体和患者之间的组织相容性。
基因递送
一方面，本发明公开了递送感兴趣的DNA序列到哺乳动物宿主***细胞的离体法(exvivo)和体内(invivo)技术。该离体法技术涉及培养靶***细胞、体外转染DNA序列、将DNA载体或其它感兴趣的递送载体导入到***细胞中，然后将该修饰的***细胞移植到哺乳动物宿主的靶区域中，以便影响感兴趣基因产物的体内表达。
应当理解，尽管在本发明方案中可一起植入诸如支架或框架以及各种外源性组织等物质，但优选本发明的注射***中不包括此种支架或组织。在一个实施例中，本发明涉及将TGF超家族蛋白质或者培养的、未转染/未转导的或转染/转导的***细胞群或其混合物注射到椎间盘间隙中的简单方法，以便外源性TGF超家族蛋白质在椎间盘间隙中被表达或是活性的。
技术人员应当理解，用于治疗人患者的一种细胞来源是患者自身的***细胞，例如自体软骨细胞。另一种细胞来源包括同种异体细胞，无需考虑该细胞对需要治疗的患者的组织相容性。
更具体地，这个方法包括采用基因产物，或其生物活性衍生物或片段。该基因产物为转化生长因子β超家族成员，或其生活活性衍生物或片段。
在本发明的另一个实施例中，提供了用于肠胃外给予病人治疗有效量的化合物，该化合物含有TGF-β超家族蛋白质和合适的药物运载体。
本发明的另一个实施例提供了用于肠胃外给予病人预防有效量的化合物，该化合物包括TGF-β超家族蛋白质和合适的药物运载体。
在治疗应用中，TGF-β蛋白质可配制用于局部给药。技术和配方一般可在Remington'sPharmaceuticalSciences，Mack出版公司，Easton,Pa.,最新版中找到。活性成分TGF蛋白质一般与运载体结合，例如赋形剂稀释液，其可包括填充剂、补充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、可侵蚀性聚合物或润滑剂，这取决于给药模式和剂型特点。典型剂型包括粉剂，包括悬浮剂、乳剂和溶液的液体制剂，颗粒和胶囊。
本发明TGF蛋白质也可与药物可接受的运载体结合以便给予受试者。合适的药物可接受的运载体实例是多种多样的阳离子脂质，包括但不局限于N-(l-2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphophotidylethanolamine)(DOPE)。脂质体也是本发明TGF蛋白质分子的合适的运载体。另外合适的运载体是缓释凝胶或包含TGF蛋白质分子的聚合物。
TGFβ蛋白质可与大量生理可接受的运载体或稀释液混合，例如生理盐水或其它合适的液体。TGF蛋白质分子也可与其它运载体装置结合从而保护该TGF蛋白质和其生物活性形式在到达它们的靶之前不被降解和/或促进该TGF蛋白质或其生物活性形式穿过组织屏障。
本发明的进一步实施例包括在转染细胞之前储存***细胞。所属领域技术人员应当理解，该***细胞可冷冻储存在于液氮中的10％DMSO中。
在本申请中，提供了通过注射用编码转化生长因子β(TGF-β)超家族成员的基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞，使椎间盘再生或阻止椎间盘退化的方法，该TGF-β超家族成员包括，但不限于BMP-2和TGF-β1、2和3。
在本申请的另一个实施例中，提供了通过注射未用编码转化生长因子β(TGF-β)超家族成员的基因转染或转导，或者未用任何其它基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞，阻止或延缓椎间盘退化的方法。另一方面，本发明涉及通过使用上述方法阻止或延缓椎间盘退化来治疗损伤或退化的椎间盘。
在本申请的另一个实施例中，提供了通过注射用编码转化生长因子β(TGF-β)超家族成员的基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞，延缓或阻止椎间盘退化的方法。另一方面，本发明涉及通过使用上述方法阻止或延缓椎间盘退化来治疗损伤或退化的椎间盘。
在本发明的另一个实施例中，提供了通过注射用编码转化生长因子β(TGF-β)超家族成员的基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞，和未用编码转化生长因子β(TGF-β)超家族成员的基因转染或转导或者未用任何其它基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞的组合物或混合物，阻止或延缓椎间盘退化的方法。
在本发明的实施例中，应当理解，可将该细胞注射到其中椎间盘退化需要通过使用上述细胞组合物阻止或延缓的区域中，该组合物含有或不含有支架材料或任何其它辅助材料，例如外源性细胞或任何其它生物相容性载体。也就是说，可将仅经修饰的细胞、仅未经修饰的细胞，或其混合物或组合物注射到其中椎间盘退化需要被阻止或延缓的区域中。
下列实例是为了说明本发明，而不是限制。
实施例
实施例1-材料和方法
脂粒构建
通过将含有TGF-β1编码序列和3’末端处的生长激素聚A位点的1.2-kbBglII片段亚克隆到pMTMLV的BamHI位点中，产生质粒pMTMLVβ1。pMTMLV载体通过除去全部gag和env序列以及一些ψ包装序列从逆转录病毒载体MGF衍生而得。
细胞培养和转导-将在逆转录病毒载体中克隆的TGF-βcDNA单独转导到软骨细胞(hChon-TGF-β1)中。在含10％胎牛血清的Dulbecco's改良Eagles培养基(GIBCO-BRL,Rockville,MD)中培养这些软骨细胞。
为了选择具有转导的基因序列的细胞，将新霉素(300μg/ml)加入到该培养基中。有时将具有TGF-β1表达的细胞储存在液氮中，在注射之前进行培养。
用Fugene转染方法将pMTMLVβ1和pVSVG质粒DNA共转染到GP2-293细胞中。培养48小时之后，用0.45μm聚砜过滤器过滤上清液。该滤过的培养上清液然后用培养基和10％FBS进行二倍稀释，并用来感染人软骨细胞。用该滤液和聚凝胶(8μg/ml,Sigma,St.Louis,MO)对感染前18小时在60mm培养皿中接种的人软骨细胞进行感染。培养4小时之后，用新鲜培养基替换该培养基。24小时之后，用储存的病毒上清液进行重复感染。在二次感染之后，在含10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养该转导的细胞。将挑选的菌落转移到24或6孔板中，并使用QuantikineELISA分析试剂盒(R&Dsystem,Minneapolis,MN)测量TGF-β1产量。
椎间盘高度的X射线放射图片分析
在穿刺后每周(variousweekintervals)施用盐酸***(25mg/kg)和Rompun(1mg/kg)之后，拍摄X射线放射图片。应特别小心地将每个动物在X射线放射图片拍摄期间和每个时间的麻醉维持在一致水平上，从而获得相似程度的肌肉松弛，肌肉松弛可影响椎间盘高度。因此，总是用术前X射线放射图片作为基线测量。也应尽量将脊柱保持在轻度屈曲位。为了减小来自脊柱的轴向旋转和光束发散角的误差，对处于侧卧位的每个动物重复拍摄X射线放射图片至少两次，将光束集中在距离兔髂嵴4cm处。数字化扫描X射线放射图片，并使用图像捕捉软件进行数字化存储。
影像分析
利用数字化放射图片，运用公用图像分析软件分析包括椎体高度和IVD高度的测量值。将数据导入Excel软件中，使用Lu等人的方法将IVD高度表示为DHI。"EffectsofchondroitinaseABCandchymopapainonspinalmotionsegmentbiomechanics。Aninvivobiomechanical,radiologic,andhistologiccaninestudy",Spine1997；22:1828-34。通过求得从IVD的前部、中部和后部获得的测量值的平均值并将它除以相邻椎体高度的平均值，计算出平均IVD高度(DHI)。被注射的椎间盘的DHI变化表示为DHI％，并归一化到术前IVD高度(DHI％＝术后DHI/术前DHI×100)。使用下面等式计算出受试者内部标准差:
√(∑(x1-x2)2/2n)
其中X1是第一测量值，X2是第二测量值，并且n＝450。按(Sw/所有测量结果的平均值×100)计算变异系数百分率(CV％)。DHI测量的观察者内误差(intraobservererror)估算为极小(Sw:0.001800316；CV％:3.13)。报道DHI测量的观察者间误差(interobservererror)也很小(Sw:0.003227；CV％：9.6)。
MRI评价
使用带有正交象限线圈接收器(quadratureextremitycoilreceiver)的0.3-T成像仪(AirisII,4.0A版；HitachiMedicalSystemAmerica,Inc.)对本研究中的所有兔进行MRI检查。处死之后，分离出带有周围软组织的脊柱，对其进行MRI分析。在下面环境中获得矢状面中的T2-权重横断面：快速自旋回波序列，TR(重复时间)4000毫秒和TE(回波时间)120毫秒、256(h)×128(v)矩阵、视野(fieldofview)260、刺激次数4次。层厚(sectionthickness)为2mm，间距为0-mm。基于1～4级(1＝正常、2＝信号强度降低极小但高信号范围明显缩小、3＝信号强度降低中度，以及4＝信号强度降低严重)信号强度的等级和范围变化，不知情的观察者利用改良的Thompson分类法评价MRI。基于2次评价，MRI分级的观察者内和观察者间的可信度相关系数优异(分别为K＝0.98、0.90)，如Cohenkappa相关系数确定的。
实施例II-实验方法和结果
阻止损伤的椎间盘退化
使用新西兰白色雄性兔。运用开放式手术技术。用实验方法治疗每个动物腰脊柱的3个椎间层面：L2-3、L3-4、L4-5或将它们作为对照组观察。均衡治疗这些层面，观察每个兔的多个部位/盘。在主题设计范围内，手术前后的比较、盘层面的变化用作对照。
实施例III
通过仅将未转导的软骨细胞、仅产生TGF-β1的软骨细胞，或混合的细胞(人软骨细胞和产生TGF-β1的软骨细胞)注射到兔中，阻止损伤的椎间盘退化
实施例I-V中使用的软骨细胞都是非盘软骨细胞，并且是从小于2岁孩子手指的透明软骨部分中获得的幼年软骨细胞。
在腰脊柱椎间盘中进行针穿刺。针穿刺之后，注射产生TGF-β1的软骨细胞、原始未转导的人软骨细胞、产生TGF-β1的软骨细胞和原始未转导的人软骨细胞的混合物、预处理的未转导的人软骨细胞或运载体/培养基。使用多个对照组。实验条件在下表1中列出。
表I
简言之，在兔或猪的腰脊柱椎间盘中进行针穿刺损伤。在这个针穿刺之后，让兔愈合4周。然后在第二手术程序中，注射包括产生TGF-β1的软骨细胞和/或原始未转导的人软骨细胞(～5×105)的实验治疗组合物，或者观察对照条件(表I)。
在气管内插管，和例如通过施用盐酸***和实现全身麻醉之后，将动物摆成侧卧位。使用乳酸林格液(Lactatedringers)，约(5ml/kg/hr)。切口区脱毛、备皮、交替地用聚烯吡酮磺擦洗和酒精擦拭(>3次)进行常规消毒铺巾。将温和的眼药膏放在眼睛上。采用左侧腹膜后途径暴露L2～L5(兔具有6～7个腰椎体)椎间盘的右前面观。使用各种准备方案，并将治疗方案应用到每个盘层面。对于椎间盘的“针穿刺”准备，使用18号针穿刺椎间盘，穿刺深度为5mm(Aoki等人"Nervefiberingrowthintoscartissueformedfollowingnucleuspulposusextrusionintherabbitanular-puncturediscdegenerationmodel:effectsofdepthofpuncture."Spine.2006；31(21):E774-80)。穿刺之后，注射表I中列出的测试材料。将测试组合物给予到每只兔的L1-2、L2-3、L3-4、L4-5区中的任何一个中。
每月使用X射线放射图片监测任何盘的变化。在手术后2、8和24周处死动物。
放射图片/MRI。相比其它盘层面处的盘，基线处(手术前(preop))相同盘的盘高度增大的可检测的放射图片的变化指示愈合。仅在针穿刺之前和之后与其它盘相比较，前后均未针穿刺的其它盘随时间逐渐产生正常退化指数。
逆转录PCR。进行逆转录PCR从而测定存活的转染的软骨细胞相对量。
组织学分析。也利用组织学分析确认胶原蛋白I型和II型的特性，新生软骨细胞的大体形态和评价(evaluation)。
Western印迹分析和/或ELISA。胶原蛋白I型和II型的定量表达、蛋白聚糖浓度、Smads2/3、Sox-9。另外，利用ELISA评价TGFβ-1、BMP2、BMP7、GDF5以及其它具有可用抗体的相关生长因子。
通过观察Capase-3的表达，在椎间盘其它组织结构中检查细胞凋亡情况。
实施例IV
结果
结果如图和本申请附图描述中所示。与载体对照组相比，仅用未转导的软骨细胞、仅用转导的软骨细胞、仅用预处理的软骨细胞，或转导和未转导的软骨细胞混合物治疗的穿刺的椎间盘表现出阻止或延缓盘退化的有益作用。
实施例IV-1用混合细胞(转导和未转导的软骨细胞)治疗兔穿刺的椎间盘
当对兔测试时，混合细胞的治疗具有抗椎间退化的作用。该作用见图1-4的各个实验。图1-A～图1-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)可以看出脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
图2-A～图2-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)可以看出脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
图3-A～图3-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
实施例IV-2用转导的软骨细胞治疗兔穿刺的椎间盘
产生TGF-β1的软骨细胞的治疗具有抗椎间退化作用。该作用见图4-A～图4-D，其示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
实施例IV-3用转导的软骨细胞和混合细胞治疗兔穿刺的椎间盘
产生TGF-β1的软骨细胞的治疗和混合细胞的治疗具有抗椎间退化作用。该作用见图5-A～图5-D，其示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射1:3比例的产生TGF-β1的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射产生TGF-β1的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
实施例IV-4未转导的软骨细胞治疗兔穿刺的椎间盘
未转导的软骨细胞的治疗具有抗椎间退化作用。该作用见图6-8的各个实验中。图6-A～图6-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
图7-A～图7-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向Ll/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
图8-A～图8-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后四(4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)通过针穿刺使T12/L1盘损伤，无注射，(ii)脊柱部位L1/2处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L2/3盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向T12/L1和L2/3盘区。(C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)通过针穿刺使T12/L1盘损伤，无注射，(ii)脊柱部位L1/2处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L2/3盘损伤并注射未转导的软骨细胞；箭头指向T12/L1和L2/3盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
实施例IV-5用未转导的预处理的软骨细胞治疗兔穿刺的椎间盘
预处理的软骨细胞具有抗椎间退化作用。该作用见图9-A～图9-D，其示出损伤盘的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；(B)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中(i)使L2/3盘损伤并注射细胞培养基DMEM，(ii)脊柱部位L3/4处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L4/5盘损伤并注射预处理的软骨细胞；箭头指向L2/3和L4/5盘区。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
实施例V
人软骨细胞来源
原始人软骨细胞是从软骨组织中生长的，该软骨组织是从1岁女性人供体的多指手指的手术切除物中获得。多指组织是在手术室中取出的。在生物安全柜中进行下面程序，以分离出软骨细胞。用酒精擦拭含有软骨组织的塑料瓶，并利用移液管用无菌PBS(IX)清洗该软骨组织。通过将7mg胶原酶(GibcoBRL)溶解在10mLDMEM(含有10％FBS)中并通过0.2μm注射器式过滤器(Corning)过滤制备胶原酶溶液。在37℃的震荡培养箱中用该胶原酶溶液处理清洗过的软骨组织17～18小时。第二天，用酒精给该瓶子消毒。用吸管吹打(pipettedupanddown)经胶原酶处理的材料数次，从而从该组织块中分离出松散的细胞。用吸管吹打之后，将上清液通过70μm尼龙细胞过滤器(Falcon)过滤。失去完整性(例如，松散的细胞)的经胶原酶处理的组织可以通过该过滤器。将该细胞滤液收集在50mL管子(Falcon)中，并然后在1,500rpm下离心5分钟。丢弃三分之二的上清液，用10ml无菌PBS(IX)清洗颗粒。再次将该重悬的细胞在1,500rpm下离心5分钟，并在除去三分之二的上清液之后，用10ml无菌PBS(IX)清洗。再次将该细胞在1,500rpm下离心5分钟，并然后将其重悬在DMEM(含有10％FBS)中。然后，将该重悬的细胞转移到四个未包被的25cm2培养瓶中，并在37℃，5％CO2下培养4天。然后将该细胞转移到两个未包被的185cm2培养瓶中。培养该细胞2周，然后收集、清洗并重悬在5:4:1比例的DMEM、FBS和DMSO的冷冻储存培养基中。将该细胞等份放入含有1mL4×105细胞/mL的细胞悬浮物的冷冻管中。将该细胞保存在气相液氮存储器中。

Claims (4)

1.软骨细胞在制备用于阻止或延缓椎间盘缺损部位的椎间盘退化的药物中的应用，所述应用包括：将所述软骨细胞的药物制剂注射到所述椎间盘缺损部位中，其中所述软骨细胞为已经与人分离并且体外培养和繁殖的非盘软骨细胞或幼年软骨细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述软骨细胞是相对哺乳动物的同种异体型。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述软骨细胞为预处理的软骨细胞。
4.根据权利要求2所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136169A (zh) * 2018-08-09 2019-01-04 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种皮肤成纤维细胞转变为人工椎间盘的***及其使用方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102006014B1 (ko) * 2008-03-21 2019-08-30 코오롱 티슈진 인크. 추간디스크 퇴행 치료용 조성물
WO2010129692A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Cornell University Composite tissue-engineered intervertebral disc with self-assembled annular alignment
JP5620668B2 (ja) * 2009-10-26 2014-11-05 学校法人北里研究所 椎間板変性の評価装置及びプログラム
WO2017075719A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 University Health Network Compositions and methods comprising growth factors, chondroitin and glucosamine for degenerative disc regeneration
EP3646878A4 (en) * 2017-06-30 2021-03-24 Kolon Life Science, Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS
SG11202110845YA (en) * 2019-03-29 2021-10-28 Kolon Tissuegene Inc Treatment of intervertebral disc degeneration
CN110613837A (zh) * 2019-10-24 2019-12-27 内蒙古医科大学第二附属医院 TGF-β在制备预防或治疗腰椎间盘突出药物中的应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2261292C (en) * 1996-07-25 2008-09-30 Genzyme Corporation Chondrocyte media formulations and culture procedures
US20030225021A1 (en) * 2001-11-14 2003-12-04 Mckay William F. Methods of inducing the expression of bone morphogenetic proteins (BMPs) and transforming growth factor-beta proteins (TGF-betas) in cells
US6197586B1 (en) * 1997-12-12 2001-03-06 The Regents Of The University Of California Chondrocyte-like cells useful for tissue engineering and methods
WO2000066177A1 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Tissuegene Co. GENE THERAPY USING TGF-$g(b)
US7338655B1 (en) * 1999-06-30 2008-03-04 Tissuegene, Inc. Gene therapy using TGF-β
US6479066B1 (en) * 1999-12-16 2002-11-12 Rst Implanted Cell Technology, Llc Device having a microporous membrane lined deformable wall for implanting cell cultures
US20030165473A1 (en) * 2001-11-09 2003-09-04 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Engineered intervertebral disc tissue
JP2003250549A (ja) * 2002-02-25 2003-09-09 Kringle Pharma Inc Ｎｋ４遺伝子または組換えｎｋ４蛋白質からなる医薬
KR20050025149A (ko) * 2002-03-28 2005-03-11 티슈진, 인코포레이티드 유전자 치료에 의한 골 생성
US7005127B2 (en) * 2002-03-29 2006-02-28 Tissuegene, Inc. Mixed-cell gene therapy
EP1469064A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-20 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Expression of proteins in endothelial cells derived from precursor cells from cord blood
ATE478092T1 (de) * 2003-06-10 2010-09-15 Nsgene As Verbesserte sekretion von neublastin
US7169405B2 (en) * 2003-08-06 2007-01-30 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods and devices for the treatment of intervertebral discs
US7897384B2 (en) * 2003-09-08 2011-03-01 Ethicon, Inc. Chondrocyte therapeutic delivery system
US7879604B2 (en) * 2004-02-20 2011-02-01 Isto Technoliges, Inc. Intervertebral disk repair, methods and devices therefor
US20060275273A1 (en) * 2004-02-20 2006-12-07 Seyedin Mitchell S Intervertebral Disc Repair, Methods and Devices Therefor
AU2005267748B2 (en) * 2004-07-30 2012-09-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Amorphous cell delivery vehicle treated with physical/physicochemical stimuli
AU2006249302A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Emory University Chondrogenic compositions and methods of use
KR20080075494A (ko) * 2005-09-21 2008-08-18 다스크 테크날러지, 엘엘씨 장기 및 조직 기능성을 위한 방법 및 조성물
KR102006014B1 (ko) * 2008-03-21 2019-08-30 코오롱 티슈진 인크. 추간디스크 퇴행 치료용 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136169A (zh) * 2018-08-09 2019-01-04 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种皮肤成纤维细胞转变为人工椎间盘的***及其使用方法

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