CN105636974A - 热稳定性淀粉合成酶基因的表达提高在热应力下的产量 - Google Patents

Abstract

描述了具有对热应力增加的耐受性的遗传修饰植物。还公开了制备所述遗传修饰植物的方法。所述遗传修饰植物包含编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸。遗传修饰植物在升高的条件下与对照植物相比具有增加的产量。

Description

热稳定性淀粉合成酶基因的表达提高在热应力下的产量

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年8月14日递交的美国临时专利申请No.61/865,767，名称为热稳定性淀粉合成酶基因的表达提高在热应力下的产量的优先权，其全部内容通过全文引用的方式并入本申请中。

序列表

以下申请包含计算机可读形式(CRF)的序列表，该序列表作为文本文件以ASCII的格式命名为“序列表”提交，大小为133KB，创建于2014年8月12日。CRF的内容在此通过全文引用的方式并入本申请。仅示出各核酸序列的一条链，但是互补链应理解为与所示的链通过任何参考的形式包括在内。

技术领域

本发明涉及一种在热应力条件下具有增加的耐受性和产量的遗传修饰植物。

背景技术

淀粉合成酶(SS)，其包括可溶性淀粉合成酶(SSS)，是在植物中淀粉沉积和储存中的关键酶。在白天通过光合作用固定碳的过程中淀粉在叶片的质体中合成，其随后在夜间被转移到贮藏器官。淀粉由两种D-葡萄糖均聚物组成：直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是通过α(1-4)连接的D-葡萄糖单体的直链，且通常构成淀粉的约30％。支链淀粉通过α(1-6)连接的高度支链化的单体连接直链。淀粉的生物合成发生在绿色光合作用组织中的叶绿体中，以及在非绿色组织淀粉体如胚乳中。在种子的胚乳中，支链淀粉的生物合成需要一系列的协调合适的酶反应，所述酶反应涉及的酶包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP酶)，四种不同的可溶性淀粉合成酶(SSI-IV)，淀粉分支酶(BE)和淀粉脱支酶(DBE)，而直链淀粉的生物合成仅需要AGP酶和颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)。可能质体淀粉磷酸化酶(Phol)也对淀粉生物合成反应中的引物形成起重要的作用。在高等植物中，AGP酶从Glc-1-P和ATP产生ADP-Glc和焦磷酸(PPi)。淀粉合成酶通过将ADP-Glc的葡萄糖基单元转移到葡聚糖链的非还原端生成线性葡聚糖链。在谷类胚乳中，淀粉合成酶的一些亚型已经被确定，包括GBSS、SSI、SSII、SSIII和SSIV。GBSS有两种亚型，大多存在于(confinedto)贮藏组织且参与直链淀粉的合成，而不同的淀粉合成酶亚型，连同一些直连淀粉，主要参与支链淀粉的形成。在水稻中，在籽粒灌浆期SSIIa和SSIIIa转录是最多的，同时在预贮存阶段发现SSIIb和SSIIIb转录，这表明SSIIa和SSIIIa相对于其他的SS酶在水稻的淀粉生物合成中起到至关重要的作用。尽管水稻仅具有一个SSI亚基，存在任何一种SSI或SSIIIa基因都可以在水稻中持续淀粉生物合成。SSI已经显示出比SSIIIa更高的活性，且构成总SS活性的70％。类似的结果已经在小麦发育中的胚乳(developingendosperm)和玉米胚乳的可溶性部分中发现。这些观察提出SSI对淀粉生物合成是关键的。SSI优选合成短链，而支链淀粉合成的进一步链延长通过其他SS酶进行。

小麦(TriticumaestivumL.)是约36％的世界人口的最重要的主要粮作物。在干燥的小麦种子中，淀粉是占谷物干重75-85％的最丰富的成分。因此，谷物产量(基于每单位面积的种子数目和单个种子重量)在很大程度上依赖于生长中的胚乳内的淀粉沉积。然而，高温对不同作物在籽粒灌浆期中胚乳内的淀粉沉积具有显著的不利影响，可能通过高温失活可溶性淀粉合成酶。例如，温度高于25℃显著降低小麦胚乳中的可溶性淀粉合成酶的活性。全球40％的小麦总产量受到最终热应力的影响。热应力通常通过降低产量和品质影响小麦产量。因此，本领域有提高各种植物包括小麦对热应力的耐受性的需要。

发明内容

本发明广义地涉及与对照植物相比具有对热应力增加的耐受性的遗传修饰植物。所述遗传修饰植物包含编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸。

还提供了提高植物对热应力耐受性的方法。所述方法包括通过用编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸转化植物以产生转化的植物，由此提高转化的植物对热应力耐受性。

还描述了一种生产与对比植物相比具有对热应力增加的耐受性的遗传修饰植物的方法。该方法包括将第一种亲本植物与第二种亲本植物杂交，从而由此产生子代，其中所述第一种亲本植物或第二亲本植物中的至少一种是如本文所描述的遗传修饰植物。有利的是，所述子代与对照植物相比，具有对热应力增加的耐受性。还公开了根据所描述的方法生产的遗传修饰种子。

本发明还公开了重组植物细胞。通过用编码热稳定性蛋白的核酸构建体稳定转化，所述重组植物细胞含有过量表达的具有淀粉合成酶活性的外源性热稳定性蛋白。本发明的各种实施例的附加特征在下文中更详细地描述。

附图说明

图1示出：(a)含有Ubip(玉米泛素启动子)的构建体pAHC17，来自水稻可溶性淀粉合成酶1基因的SSI-cDNA，以及NosT(胭脂氨酸合成酶基因终止子)；(b)具有水稻可溶性淀粉合成酶1基因的构建体pJL10P5，以及DY10(高分子量的麦谷蛋白的启动子)；以及(c)具有BAR基因的构建体pAHC20，其能够赋予对除草剂草铵膦(glufosinate)和双丙氨磷(bialaphos)抗性。

图2是对来自三个T₂代转基因小麦事件和非转基因Bobwhite(BW)对照的Southern印迹分析的图像，其中Ub1为：具有泛素启动子的事件#1286；Ub2为：具有泛素启动子的事件#1700；Dy10：具有Dy10启动子的事件#2173；以及BW：非转基因的Bobwhite品种；

图3是显示以下的图像：(a)叶片样本(左)和种子样本(右)的逆转录酶(RT)-PCR，其中Pls：具有SSI基因的质粒DNA；Ub1：具有泛素启动子的事件#1286；Ub2：具有泛素启动子的事件#1700；Dy10：具有Dy10启动子的事件#2173；以及BW：非转基因的Bobwhite品种；以及(b)叶片样本(左)和种子样本(右)使用微管蛋白基因引物的RT-PCR，其中gDNA为：BW的基因组DNA；

图4示出使用来自三个T₂代转基因小麦事件、一个非转基因Bobwhite(BW)、以及一个水稻样本的种子和叶片样本进行Western印迹分析的图像；

图5为(a)热处理(32/28℃)后的对照种子和转基因种子的照片；以及(b)显示转基因品系的千粒重(TKW)超过对照bobwhite种子的百分比的图，其中，*表示P＜0.05；以及

图6显示了在升高的温度(32℃)和最佳生长条件20℃下(a)非转基因对照Bobwhite的愈合组织与(b)事件2205M-2的转基因愈合组织的生长比较的照片。

具体实施方式

更详细地，本发明涉及遗传修饰植物，以及制备其的方法和使用其提高植物的热应力耐受性的方法。除非上下文另外指出，本文的“植物”或“多个植物”包括植物的组织，器官，或其部分(例如，叶，茎，块茎，枝条，根，花，芽)，果实或其细胞。还提供了制造这种非天然存在的，遗传修饰植物(又名“转基因”植物)的方法，连同在该方法中有用的核酸构建体和载体。本发明适用于各种植物，包括单子叶植物(即，具有一个子叶(seed-leaf)的植物，又名“单子叶植物”)和双子叶植物(即，具有两个子叶的植物，又名“双子叶植物”)二者。适用于所公开的实施例的非限制性的植物样本包括谷物(例如，小麦，燕麦，大麦，水稻，玉米，小米，黑麦，高粱，黑小麦，荞麦，藜麦)，豆类(例如，大豆，菜豆，豌豆，苜蓿)，块茎类(例如，马铃薯，甘薯，木薯，山药)，以及类似物。

当植物在短时间例如几小时或几天经受比正常植物生长温度至少高约7℃的升高的生长温度，以及在较长时间例如几天或几周经受比正常植物生长温度至少高约4℃的升高的生长温度，发生热应力。本发明特别涉及对植物生长的淀粉合成期间(例如，种子灌浆期)遭受升高的温度的增强的耐受性。在本发明上下文中的术语“升高的”生长温度，指等于或高于该植物生长的温度和/或收获的温度，包括在植物中的内源性淀粉合成酶的活性的降低或失活的温度。“正常的”植物生长条件或温度是指对于大多数本领域已知的物种所提出的最佳生长和/或收获的条件或温度范围。例如，植物如小麦优选自约15℃和约20℃之间的最佳温度。对于植物例如玉米的最佳温度在约20℃至约23℃之间。植物例如高粱优选自约25℃至约28℃之间用于生殖生长的日间温度。植物例如大豆优选日间温度约为29℃。通常，用于大多数植物的优选的夜间温度是比日间温度低约2℃至约5℃。

根据本发明的遗传修饰植物具有对热应力增加的耐受性，其中术语“耐受性”指植物在其正常的生长条件外的条件下连续生长和产生产量的能力。当在升高的生长温度下转基因植物的生长、发育和/或产量优于对照植物的生长、发育和/或产量，甚至转基因植物不完全抵抗热应力或不受热应力影响，转基因植物的热耐受性被认为是“增加的”。增加的“产量”将取决于修饰植物的特定种类且其本身可以表现为一个或多个以下内容：a)基于单粒种子和/或每株植物和/或每亩的总种子重量，大小或体积的增加，b)增加的千粒重(TKW)，千粒重为一千粒小麦的以克为单位的重量；c)每株植物增加的花数；d)增加的生物质；和/或e)增加的收获指数，其表述为可收获的部分例如种子的产量除以总生物量之比。增加的TKW可以由增加的种子大小和/或种子重量产生，并且也可以由增加的胚芽和/或胚乳大小产生。本发明特别涉及在在升高的生长温度下植物发育的淀粉合成期间与对照植物相比具有增加的产量的修饰的植物。

有利的是，不同于许多其它的转基因植物，根据本发明的植物具有基本上类似于并且在一些情况下，几乎等同于相同种类的野生型植物的表型/形态(当该种野生型植物在非压力条件下生长时)。换句话说，在转基因植物和野生型植物之间，形状，大小和/或种子的丰度，叶片和/或水果/蔬菜是基本上类似的。当在相同的正常生长条件下生长时，如果本领域技术人员视觉区别遗传修饰植物和对照植物有困难，这些植物在本文中被认为是“基本上类似的”。相反的，当在热应力下生长时，根据本发明的各种实施例的转基因植物与在相同条件下生长的对照植物相比具有显著提高的形态。例如，当在热应力下生长时所述转基因植物与对照植物相比可以具有一个或多个以下改进的形态或物理特征：旺盛的生长，丰富的叶片，更长的初生根和高度等。因此，在遗传修饰植物中形态或表型没有不利影响。

遗传修饰植物包含编码具有淀粉合成酶活性并优选具有可溶性淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸。术语“可溶性淀粉合成酶活性”或“淀粉合成酶活性”是指淀粉例如可溶性淀粉的蛋白/酶生物合成。术语“外源的”在本文中指来自宿主植物以外(即外源)来源的核酸序列(例如，DNA，RNA)，基因或蛋白，其被引入宿主植物以创建转基因的植物。例如，在此处使用的上述术语涉及到编码核酸的表达，是指以可表达的形式将外源编码核酸引入宿主植物。换句话说，核酸对特定植物不是天然的，和/或不是从特定植物衍生的。相反的，在本文中使用的术语“内源的”与“天然的”可互换且指在对照植物或野生型植物中发现的或与对照植物或野生型植物天然相关的核酸序列，基因，基因产物，蛋白等。

在一个或多个实施例中，编码热稳定性淀粉合成酶蛋白的外源核酸也是异源的。术语“异源的”是指衍生自参考种类之外的来源的遗传材料，且与“同源的”相反，“同源的”指从宿主植物(尽管不必为宿主植物本身)的种类衍生的，与其天然相关的或源自其(nativeto)的遗传材料。例如，在本发明的一些实施例中，转基因植物通过将一个种类的用于编码淀粉合成酶的遗传物质引入不同种类的宿主植物而产生，其中所述宿主植物表达异源基因产物。因此，由于外源核酸分子相对于所述宿主植物是异源的，转化的植物细胞将包含在对照植物中不能被定性或定量(例如通过PCR)检测的引入的核酸分子的转录。如果在另一方面，外源的核酸分子相对于所述宿主植物是同源的，转化的植物可以基于额外的转录表达区别于对照植物，额外的转录表达可以通过使用“定量”PCR技术来检测。在本发明中，特别有利的是将源自更热耐受的植物种类或热带的植物种类的编码淀粉合成酶的异源核酸，引入更温和的，温带的或凉爽的天气植物种类以增加它们对热应力的耐受性。淀粉合成酶的编码序列可以从更热耐受的植物中分离，或可以基于从所述更热耐受的植物获得的遗传信息合成编码序列(例如，cDNA)。有利的是，外源热稳定性淀粉合成酶的表达或过表达增加了转化的植物对热应力的耐受性。

当蛋白保持酶活性时，蛋白被认为是“热稳定的”，使得该蛋白的功能和/或活性被保持在无活性显著下降的给定的温度(通常升高的温度)。换句话说，如果蛋白保持其天然折叠的(功能性的)构象且不变性，蛋白在给定的高温下是热稳定的，或者否则在这样的温度下赋予非功能性。因此，在本发明的上下文中，热稳定蛋白被选择使得它们，在升高的生长温度下-等于或高于转化的植物的内源淀粉合成酶通常具有降低的淀粉合成酶活性或甚至失活的温度，在转化的植物细胞中保持淀粉合成酶活性。即，外源的热稳定蛋白有较高的相对热稳定性且比转化的植物的内源性蛋白更“耐热”。合适的热稳定蛋白可在比宿主植物的内源淀粉合成酶的热稳定性温度高的约4℃至约30℃(优选5℃至约15℃)的温度范围对热稳定性进行选择。例如，如果宿主植物的内源淀粉合成酶的热稳定性温度约为25℃，然后植物使用在约30℃至约55℃具有热稳定性的外源热稳定蛋白进行转化。然而，应该理解的是，耐热性SS蛋白在整个生长温度的范围内也必须保持酶活性，且在较低温度下也不会失活。在一个或多个实施例中，合适的热稳定性蛋白在高于约55℃，优选约23℃至约55℃，更优选约23.5℃至约43.5℃(75°F-110°F)的温度下具有酶活性。因此，淀粉合成酶基因可以被确定或从具有较高的相对热稳定性的植物中分离，然后被用于转化具有较低固有相对热稳定性的植物，由此增加了修饰的植物的热应力耐受性。热稳定性可使用由堪萨斯大学应用生物信息学实验室的Li等人开发的公众可获得的算法(ThermoRank，通过http：//www.abl.ku.edu/services.htm访问)进行预测。且在下面的工作实施例中显示若干种类的相对热稳定性。在一个或多个实施例中，源自植物例如水稻，三叶杨，葡萄，高粱，大豆，玉米，菜豆，海藻，三叶草，苋菜，拟南芥，可可，番茄，木薯，苜蓿，鹰嘴豆，和/或桃的淀粉合成酶基因和/或淀粉合成酶蛋白可用于提高较低耐热性植物的热耐受性。

用于植物的转化技术在本领域是公知的，且包括通过植物摄取外源遗传材料的任何技术，如颗粒轰击介导的传递，农杆菌-介导的技术，PEG-介导的或电穿孔-介导的摄取，病毒感染，和/或显微注射。

在一些实施例中，通过在植物中表达核酸增加了热应力的耐受性，核酸包括(或由以下组成)：(a)编码具有(或由以下组成)SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的热稳定SS蛋白的核苷酸序列，或(b)编码与SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20具有至少约为50％的氨基酸同一性(优选至少约70％的氨基酸同一性，更优选至少约80％的氨基酸同一性)且保持其功能性特征的热稳定的SS蛋白的核苷酸序列。热稳定的SS蛋白的“功能性特征”指在升高的生长温度下表达蛋白或酶以保持酶促活性，以合成(可溶性)淀粉的能力。在一个或多个实施例中，核酸包含(或由以下组成)序列选自(a)SEQIDNO：1，3，5，或7的核苷酸序列；以及(b)与SEQIDNO：1，3，5，或7具有至少约70％的序列同一性(优选至少约80％序列同一性，更优选至少约90％序列同一性)的核苷酸序列(即其保守修饰的变体)。因此，所公开的核酸和氨基酸序列的“保守变体”是在本文中设想的(contemplated)，只要所得到的蛋白或酶保留淀粉合成酶活性。

在一个或多个实施例中，增加植物对热应力的耐受性的方法包括在植物细胞中引入和表达含有编码淀粉合成酶活性的热稳定蛋白的核酸构建体。在一个或多个实施例中，所述热稳定性蛋白是淀粉合成酶，优选可溶性淀粉合成酶，且更优选可溶性淀粉合成酶I。本文还提供了包含核酸构建体的重组植物细胞，优选将核酸构建体稳定并入其基因组。核酸构建体可以包含核酸编码序列，该序列可操作地连接至植物细胞中驱动表达的启动子。合适的启动子包括组成型启动子，以及胚乳特异性启动子。启动子的非限制性实例包括玉米泛素启动子，高分子量(HMW)谷蛋白启动子亚基(Dy10)，CaMV35S启动子，大豆GMubi3启动子，和/或水稻肌动蛋白启动子。更优选地，该转基因植物是通过将包含核酸构建体的载体或质粒引入到植物细胞而制备的。因此，在一个或多个实施例中，还提供了用本文中所述的表达载体或质粒转化的植物细胞。在进一步的实施例中，还提供了载体或质粒，用于制备具有对热应力增加的耐受性的转基因植物。所述载体或质粒包含表达盒，其包含编码热稳定SS蛋白的核酸构建体，可操作地连接用于驱动植物细胞中的核酸的表达的合适的启动子。

在一些实施例中，核酸构建体包含(或由以下组成)序列选自：(a)用于编码包含(或由以下组成)SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的热稳定SS蛋白的核苷酸序列；(b)编码与SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20具有至少约50％的氨基酸同一性(优选至少约70％的氨基酸同一性，更优选至少约80％的氨基酸同一性)并保持其功能性特性的编码热稳定SS蛋白的核苷酸序列；(c)SEQIDNO：1，3，5，或7的核苷酸序列；以及(d)与SEQIDNO：1，3，5，或7具有至少约70％的序列同一性(优选至少约80％的序列同一性，更优选至少约90％的序列同一性)(即其保守修饰的变体)的核苷酸序列。

在一些实施例中，提供了一种编码具有淀粉合成酶活性的热稳定蛋白用于增加植物热应力耐受性的分离的核苷酸序列。在一些实施例中，所述核苷酸序列包含与SEQIDNO：1，3，5，或7对应的有义序列，或其保守修饰的变体。在一些实施例中，所述核苷酸序列编码包含SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的蛋白，或编码与SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20具有至少约50％的氨基酸同一性(优选至少约70％的氨基酸同一性，更优选至少约80％的氨基酸同一性)且保持其功能性特性的蛋白。

本发明的方法包括在合适的培养培养基(如Murashige和Skoog(MS)，补充培养基等)上培育植物组织(例如，叶，子叶，或下胚轴)，然后通过使用合适的技术例如上述的那些技术和在工作实例中的技术将外源的核酸导入所述组织。外源的核酸可使用构建体，载体，质粒或其它合适的技术来导入。核苷酸序列的表达产生转化的或修饰的组织。报告基因和/或选择性培养基可用于选择和确认转化。所述转化的组织可以被用于再生具有增加的热应力耐受性的转基因整株植物。取决于所涉及的植物种类类，转基因植物可以使用各种技术再生。在一个或多个实施例中，再生包括从转化的组织诱导愈伤组织的形成，枝条(shoots)的再生，随后通过在土壤或其他适当的生根培养基中使枝条生根以产生所述整株植物。

所得的转基因植物可以杂交以制备子代，优选纯合子代或种子。因此，热耐受性植物也可以间接通过将具有对热应力增加的耐受性的亲本植物与其它热应力耐受性植物，或甚至与其他具有额外所需的特性(例如，抗害虫或抗除草剂，地理适应，茎强度等)的品种育种。然后筛选所得的子代以鉴别具有对热应力增加的耐受性的子代。

在一个或多个实施例中，本发明还涉及制备(转基因)种子的方法。在一些实施例中，该方法包括如本文所述的转基因植物的自花授粉。在一些实施例中，该方法包括将第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物或第二植物中的至少一个是本文中所描述的具有对热应力增加的耐受性的转基因植物。在一些实施例中，第一植物和第二植物二者是本文中所述的具有对热应力增加的耐受性的转基因植物。在一个或多个实施例中，所述第一植物和第二植物可以使用昆虫(例如，布笼中的苍蝇)，手动(用手)等的异花授粉进行杂交。

通过阅读本文以下公开的内容和工作实施例本发明的各种实施例的额外的优点对本领域技术人员是明显的。应当理解为，本文所描述的各种实施例除非本文另有说明不一定是相互排斥的。例如，在一个实施例中所描述的或所描绘的特征也可以被包括在其他实施例中，但不是必须包括在内。因此，本发明包括本文所描述的具体的实施例的多种组合和/或集合。

核酸或蛋白“包含”核苷酸序列或氨基酸序列表示整个序列是存在的，但可以在指定的序列的3′或5′末端包括一个或多个额外的核苷酸或氨基酸，只要序列保留了基因或蛋白的功能性特性。核酸或蛋白“由核苷酸序列或氨基酸序列组成”表示整个序列是存在的，并且不包括另外的核苷酸或氨基酸。

如在本发明中使用的“对照”植物是指用于鉴定转基因或遗传修饰植物的变化的目的，用于与根据本发明的非转基因或遗传修饰植物进行比较的植物。对照植物是与非天然存在的植物相同种类的植物。在一些情况下，对照植物可以是野生型(天然的)植物，尽管品种和遗传改造的原本具有淀粉合成酶的正常表达和/或热耐受性的植物也可以作为参考进行比较。A“野生型”植物是未进行实验意义上的遗传修饰或处理的植物。A“野生型”基因是指具有从天然存在的来源中分离的基因的特征的基因。A“野生型”基因产物是指具有从天然存在的来源中分离的基因产物的特征的基因，而“修饰”基因或基因产物是指与野生型基因或基因产物相比在序列和/或功能性特性具有修饰(即，改变的特征)的那些基因或基因产物。在本文中使用的术语“转基因”指在其一个或多个其细胞中包含至少一种异源基因的植物，植物结构，植物细胞，植物组织，或植物种子。同样地，“遗传修饰的”，“修饰的”或“转化的”细胞，组织，种子，植物等是那些已经被改变的以包括转基因表达的外源基因产物的细胞，组织，种子，植物，与未修饰的细胞，组织等相反。该术语与“转基因的”是含义相同的。

在本文中使用的术语基因“表达”用来指将基因中编码的遗传信息通过基因的转录(即经由RNA聚合酶的酶作用)转换成RNA(例如，mRNA，rRNA，tRNA，或snRNA)，以及通过mRNA的翻译转换成蛋白的过程。基因表达可以在该过程中的多个阶段进行调节。术语“过表达”是指在转基因植物的基因产物的生产超出正常的，对照的或非转基因植物的生产水平。参见表达的改变“水平”是指在修饰的植物如转基因植物中基因产物的生产，不同与正常的，对照的，或非修饰的植物的量和比例。

术语“可操作地连接”是指以核酸序列以下述方式连接，该连接方式使得核酸分子能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白分子的合成。该术语还指氨基酸序列的连接方式，该连接方式使得产生功能性蛋白。

术语“载体”是指将DNA片段从一个细胞转移到另一细胞的核酸分子。该术语包括含有所需的编码序列和适合的核酸序列(例如启动子)的重组DNA分子，该重组DNA分子是在特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的表达所必须的。在本文中可与术语“质粒”互换使用。本发明中使用的合适的载体的例子包括pACH20、pJL10P5、pGmubi、pACH17和类似物。

在本文中使用的术语“转化”指将外源的DNA引入细胞。转化可以通过多种本领域已知且在本文中描述的方式完成。

当术语“分离的”使用于核酸或蛋白时，指在通常与其天然环境相关的从至少一种污染的核苷酸或氨基酸中被鉴别和分离的序列。即分离的核酸或蛋白是以与其天然存在的不同的形式或设置存在的核酸或蛋白。

本文中使用的术语“序列同一性”或“氨基酸同一性”用以描述两个或多个核酸或氨基酸序列当在特定的比较窗之间进行最大相关的比对时序列之间的关系。“同一性”的百分比通过在比较窗比较两个最佳比对的序列来确定。对于两个序列的“最佳比对”，可以理解为，在比较窗口中的序列部分可以包括缺口(例如，缺失或添加)，相比于不包含添加或缺失的参考序列。比对之后，匹配位置(即其中相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都出现的位置)的数目被确定，然后除以比较窗中位置的总数。这个结果再乘以100来计算的序列或氨基酸同一性的百分比。应该理解为，与参考序列具有一定百分比的序列同一性的序列不一定要具有相同的核苷酸或氨基酸总数(参见例如，如上所讨论的微小RNA)。因此，具有一定水平“同一性”的序列包含对应于参考序列的仅一部分(即5′非编码区，3′非编码区，编码区等)的序列。

如本文所使用，在两个或多个项目中使用的短语“和/或”是指所列出的项目中的任何一个可以单独使用或两种或多种列出的项目的任意组合使用。例如，如果组合物被描述为含有或不含有组分A，B和/或C，则组合物可以含有或仅排除A；含有或仅排除B；含有或仅排除C；含有或仅排除A和B组合；含有或仅排除A和C组合；含有或仅排除B和C组合；或含有或仅排除A，B和C的组合。

本说明书也使用数值范围来量化涉及本发明的各种实施例的某些参数。应当理解为，当提供数值范围时，这样的范围应被理解为仅记载了该范围的较低值的权利要求和仅记载了该范围的最高值的权利要求限制提供文字支持。例如，公开的约10至约100的数值范围是为记载“大于约10”(无上限)的权利要求和记载“小于约100”(无下限)的权利要求提供文字支持。

实施例

下列实施例阐述了根据本发明的方法。然而应当理解为，这些实施例以通过解释的方式提供且不应看作是对本发明的总体范围的限制。

介绍

淀粉合成酶(SS)，包括可溶性淀粉合成酶(SSS)，是在淀粉沉积和谷物生长过程中对高温敏感的关键酶组分之一。在小麦中，高于25℃的气温降低小麦胚乳中可溶性淀粉合成酶的活性。然而，不同的植物种类的可溶性淀粉合成酶对高温具有显著的灵敏度差异。例如，水稻可溶性淀粉合成酶能够在35℃下维持高酶促活性，导致在胚乳中产生长的、直链支链淀粉。因为小麦可溶性淀粉合成酶在升高的温度下失活且水稻可溶性淀粉合成酶承受高温，小麦中的水稻可溶性淀粉合成酶基因的表达可能增加库强度(sinkstrength)，并由此增加热应力下的产量。本研究的目的是调查在热应力条件下水稻可溶性淀粉合成酶基因的表达对淀粉沉积和小麦粒重产量的影响。小麦中克隆的基因SSI与水稻SSI具有81％的氨基酸相似性且生产75kDa的蛋白，而水稻SSI生产57kDa的蛋白。小麦和水稻的SSI是结构是相似的，由15个外显子和14个内含子组成。这两种基因的所述外显子的长度几乎相同，但小麦的SSI的内含子1，2，4和10比相应的水稻的内含子更长，内含子6，11和14比相应的水稻的内含子更短。

实施例1

载体构建体和植物转化

1.载体构建体

不使用Genbank收录号#NM001063416(SEQIDNO：21)的水稻mRNA，直接扩增水稻可溶性淀粉合成酶基因，从使用引物对SSS-AF(SEQIDNO：24)和SSR-BR(SEQIDNO：25)由衍生自水稻植物(Kitakke)的cDNA产生1675bp的PCR产物，并将其克隆入pCR-Blunt质粒(SEQIDNO：26)中。这个1675bpPCR片段(SEQIDNO：23)与水稻SSS基因(SEQIDNO：21)的后面三分之二对应。对于水稻SSS基因的5′端，质粒41637-1(SEQIDNO：22)通过Genscript被合成且含有SEQIDNO：21的从起始密码子的-3开始并包括用于克隆的额外的23bp5′端前导序列的440bp。该前导序列含有XhoI位点，BamHI位点和PmeI位点。

SSS基因的两个片段通过消化质粒41637-1连接，并用XhoI和HindIII酶切，并分离一个486bp片段。所述pCRBlunt-1675SSR质粒用XhoI消化并用HindIII部分消化。接着，将486bp片段连接到PCR-Blunt质粒产生完整的SSS基因(pCRBlunt-SSS)(SEQIDNO：27)，其含有编码SSS蛋白的1960bp编码序列。

为了在小麦中过度表达，pCRBlunt-SSS质粒用BamHI消化并且亚克隆到pAHC17(包含玉米泛素启动子)。为了种子特异性表达，pCRBlunt-SSS用BamHI消化，末端用T4DNA聚合酶填补且平端连接至DY10启动子和终止子之间的PmeI位点。

使用由玉米泛素-1启动子和胭脂碱合成酶(NOS)终止子控制的水稻(栽培品种为卡塔克)可溶性淀粉合成酶1(SSI，1960bp)的cDNA制备的构建体pAHC17示于图1a中。使用由HMW-Dy10启动子和胭脂碱合成酶(NOS)终止子控制的相同的cDNA制成的构建体pJL10P5示于图1b中。第三个构建体，含有由泛素1启动子和NOS终止子控制的bar基因的pAHC20(图1c)赋予对除草剂草铵膦(商品名为Liberty；拜耳作物科学，研究三角，NC，USA)和双丙氨膦的抗性。

2.转化

a.转基因植物的生产

Bobwhite小麦(TriticumaestivumL.品种“Bobwhite”)用于转化。长度为2-3mm的未成熟胚从10-14天年龄，表面消毒的颖果(caryopses)中收集，并颠倒放置于CM4培养基(添加有40g/L的麦芽糖，2.2mg/L的毒莠定，0.5g/L的2，4-D，和2g/L的Gelrite的Murashige和Skoog盐以及GamborgB5维生素)上，在25℃的暗室中两天到七天用于愈伤组织形成。转移后的三到五天，在转化之前最初的愈伤组织，在0.4M的甘露醇/山梨醇CM4培养基上预处理4到18小时或在层流罩中空气干燥30分钟。对于转化，质粒pAHC20与构建体pAHC17或pJL10P5组合使用。使用粒子流入枪(particleinflowgun)进行遗传转化。粒子轰击(particlebombardment)后，将组织在CM4培养基上保持2至5天以允许更好地恢复。然后将小麦愈伤组织转移到选择性培养基(含有5mg/L的草铵膦CM4培养基)上，并在黑暗中维持两个星期。在黑暗中将组织转移至含有10mg/L的草铵膦的CM4培养基中，进行每14天为一个周期的两个周期。然后将该组织转移至含10mg/L的草铵膦的MSP培养基(添加有5mMNH4，20mM的NO3，GamborgB5维生素，4％的麦芽糖，0.2mg/L的2，4-D，和2g/L的Gelrite的Murashige和Skoog盐)，在光照中下生长枝条。将生长枝条的组织(tissuedevelopingshoots)转移至枝条伸长培养基(shootelongationmedia)，含有5mg/L的草铵膦的MSE(添加有5nM的NH4，20mM的NO3，GamborgB5维生素，4％的麦芽糖，和2g/L的Gelrite的Murashige和Skoog盐)，在光照中14天。当枝条伸长到约为3-6mm，将整个团块转移至具有含10mg/L的草铵膦的13mL的MSE培养基的大培养管中。具有良好生长的根和枝条的植物被种植在小泥炭盆中用高湿度进行抗性锻炼。这些抗性锻炼的植物使用0.2％(体积比)的Liberty溶液进行除草剂抗性选择，通过涂画第三个叶片的标记的区域，接着观察三至五天。

b.转基因品系的PCR筛选

在每一代中，使用基因组DNA进行PCR来筛选转基因小麦植株水稻SSI基因。DNA是使用改进的CTAB方法从叶片组织中分离出来。取出100-150mg叶片的叶组织样本并放置在2mL的离心管中，并且在液氮中粉碎。接着，将含4μL的2-巯基乙醇(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)的800μL的2XCTAB提取缓冲液加入到样本中。试管在65℃的水浴中温育60分钟，接着在室温下冷却10分钟。然后，加入500μL的氯仿∶异戊醇(24∶1)并将试管置于旋转振荡器30到60分钟，随后在1,200rpm下离心20分钟。将上清液转移到干净的试管并加入2μL的RNas酶以从DNA中去除RNA。在水相中的DNA通过加入约2/3体积的异丙醇并将该试管在-20℃下过夜进行沉淀。在每一代中，使用两种引物对进行PCR筛选，以筛选含有SSI基因的转基因植物。

对于第一个PCR靶点，正向引物，SEQIDNO：28，退火从SSI的cDNA的起始密码子的下游的1345个碱基开始，而反向引物，SEQIDNO：29，杂交从SSIcDNA的终止密码子的上游的145个碱基开始。引物对可扩增来自基因的3′末端的471bpPCR产物。用于该引物的PCR程序为在95℃下5分钟，95℃下30s进行30个循环，57℃下30s，72℃下90s，随后在72℃下10分钟。对于第二个PCR靶点，正向引物，退火从起始密码子下游的476个碱基开始，且反向引物(SEQIDNO：30)从基因的终止密码子的上游的815个碱基开始，并产生670个碱基对的PCR产物。PCR的条件与上述相同，除了退火温度为60℃而不是57℃。

c.Southern印记分析

使用的第二引物对(SEQIDNOs：32和33)和pAHC17质粒DNA作为模板进行PCR。PCR产物使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒纯化，并使用MegaprimingDNA标记***(安玛西亚，英国)用dCTP(α-³²p)标记。标记的PCR产物用作Southern印迹分析的探针。接着，来自T2植物叶片的25μg的基因组DNA用BamHI和EcoRI酶消化。消化的DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离，并转移到尼龙杂交膜上并与水稻的SSI基因的32p-标记的PCR产物杂交。

d.逆转录酶(RT)的PCR

从叶片和20日龄的T2植物的发育种子二者中分离RNA。对于叶片样本，使用QIAGENRNA分离试剂盒，同时通过使用异硫氰酸胍溶液来完成种子的的分离。收集小麦(TriticumaestivumL.)的种子(50-100mg)并在液氮中用预冷研钵和研杵研磨至细粉末。然后将粉状样本转移到预冷的1.5ml的不含RNase的微离心管。将400μl提取缓冲液I(100mM的TRIS(pH为8.0)，150mM的LiCl，50mM的EDTA，1.5％的SDS和1.5％的2-巯基乙醇)等分试样立即加入到种子粉末中。通过剧烈振荡混合内容物后，加入250μl的苯酚∶氯仿(1∶1，pH值为4.7)的混合物，并且通过倒置将样本混合好。样本随后立即在13000g在4℃下离心15分钟。将上层水相小心的转移到新的含有250μl的提取缓冲液II(4.2M的硫氰酸胍，25mM的柠檬酸钠，0.5％的月桂醇肌氨酸和1M的乙酸钠(pH4.0))的1.5ml试管中。样本通过轻轻的翻转混合，并在室温下温育10分钟。温育后，加入200μl的氯仿∶异戊醇(24∶1)，然后将样本在4℃，13,000g下离心15分钟。为了回收上清液，加入300μl的异丙醇和250μl的1.2M的氯化钠。然后将样本颠倒混合并置于冰上15分钟。将样本在4℃在13,000g下离心15分钟，然后将上清液弃去并且将RNA沉淀小心的用400μl的70％的乙醇洗涤。然后将RNA沉淀物在室温下在层流罩中干燥15至20分钟，并重新悬浮在不含RNase的合适的体积(例如50μl)的水中，并储存于-70℃。使用购自Promega的逆转录***试剂盒将RNA逆转录为cDNA。PCR用如上所述的第一引物对(基因特异性引物)进行，并在1％的琼脂糖凝胶上显示所述扩增。RNA中的DNA污染的检查通过使用称为微管蛋白(SEQIDNOs：34和35)的管家基因进行PCR而进行。PCR的条件与第一引物对相同，除了退火温度为58℃而不是57℃。

e.Western印记分析

在开花后的20天的，从每个T₂转基因小麦事件中，一个非转基因小麦品种(BW)和一个水稻品种(Nipponbare)中，萃取旗叶和种子的总可溶性蛋白。通过在蛋白提取缓冲液中研磨和匀化样本，提取在叶片和种子样本二者中的总蛋白质。蛋白浓度使用快速启动Bradford蛋白测定试剂盒(BioRad)估计。样本在缓冲液中稀释以维持相同的浓度进行相等加样。相等加样也可通过检查染色的凝胶而维持。通过将40μg的各样本加样到10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白分离。将SDS-PAGE-分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PDVF)膜进行免疫印迹。具有转移蛋白的PDVF膜使用由AnaSpec，Inc.(加利福尼亚，美国)培养的兔子多克隆抗-SSI抗体，以及结合辣根过氧化物酶(SantaCruz生物技术公司，加利福尼亚州，美国)的山羊抗兔子第二抗体对水稻可溶性淀粉合成酶I(SSI)蛋白进行探测。将等量的总蛋白(40μg)加样到每个泳道。

实施例2

热应力处理和表型

在热应力和最佳的温度条件下，在每个实验中对每个事件/每个品系的8至20盆进行实验。在第一个实验中(实验1)，使来自1个泛素启动子事件(Ub-1)的T₂植物、1个Dy10启动子事件(Dy10)和产生自组织培养基(BWTC)中的非转基因的Bobwhite在温室中生长。在发芽后，对幼苗在实验室中进行PCR以筛选SSI基因的存在，单个幼苗被移植到装有MetroMix200盆栽土(Hummert公司，托皮卡，堪萨斯州)的盆(14cm的高度，50cm的上部周长和36cm的底部周长)中。温室被设定在22/15℃的日间/夜间温度，以及16小时的光照和8小时的黑暗用于正常生长。植物每天浇水。在花期标记每个植物的一个或两个分蘖(tillers)，并且花期后的10天(使用标记的分蘖确定)来自每个事件/品系的一半植物在被转移到高温生长室。生长室设定为在31/24℃(日间/夜间)16个小时/8个小时(光照/黑暗)和70-80％的湿度。剩余的植物被转移到另一个生长室中，具有最佳的日间/夜间温度(22/15℃)并且其它条件与高温室相同。千粒重(TKW)从标记的分蘖数获得，通过干燥种子至相等的含水量，将种子称重，并使用标记的头的种子数转换为TKW。在收获期间也计算有效的分蘖数。由旗叶测量叶绿素含量，在开花后12天开始测量，然后在隔日测量12天。开花之日起到生理成熟的日子为生理成熟所需的天数。非转基因事件和转基因事件通过使用具有α＝0.05的不等样本方差的两个样本t检验而进行比较。

在第二个实验(实验2)中，来自2个泛素启动子事件Ub-1，Ub-2的T2植物，1个Dy10启动子事件(Dy10)，BWTC和来自非组织培养基(BWNTC)的Bobwhite以下述实验1中的程序在温室中生长。给予生长室的热应力设定在33/26℃并维持所有其他条件与实验1类似。对照植物在最佳温度(22/15℃)，16个小时/8个小时(光照/黑暗)以及70-80％的湿度的温室中生长。实验2除了不获取叶绿素含量，按照下文中实验1的程序来完成。

在第三个实验(实验3)中，来自2个泛素启动子事件Ub-1，Ub-2的T₃植物，1个Dy10启动子事件(Dy10)，BWTC和BWNTC在温室中生长。在热应力(34/28℃)和最佳温度(22/15℃)下的表型分析依照在实验1中的程序在生长室中来完成。

在最后的实验(实验4)中，来自3个转基因事件的T₄植物连同非转基因的Bobwhite(BWNTC)在温室中生长，并依照实验1中的程序在高温条件和最佳的温度条件下转移到生长室中进行表型分析。在该实验中，生长室被维持在32-33/30℃的热应力下和20/15℃的最佳温度条件下。仅获取每头的千粒重和种子数的数据。

在生长室最高温度被发现从设定点有±1.5℃的温度波动，而在温室中根据外部空气温度有(±2至4)的波动变化。

结果与讨论

1.转基因植物生产，转基因稳定***，遗传以及拷贝数估计

使用pAHC17/pAHC20和pJL10P5/pAHC20的共转化一共有六杆(sixbar)阳性转基因小麦品系被开发。6个品系中的5个品系包含修饰的水稻SSI基因，如通过PCR分析来自To代的叶片DNA所确定的。

表1.6个Liberty阳性的小麦事件中存在水稻可溶性淀粉合成酶以及其X²值。

最终，两个以前的SSI-阳性品系测试为PCR阴性。剩余的三个SSI-阳性品系用于进一步的分析。两个品系包含泛素启动子，一个品系包含DY10启动子。

在T1植物中使用X²-试验进行的SSI基因分离(segregation)分析表明SSI基因对于Ub1、Ub2和Dy10事件以3∶1的比例分离，表明SSI的至少一个拷贝的***。使用来自T2叶片的基因组DNA和SSI基因序列作为探针进行Southern分析表明所有的三个转基因事件和非转基因的BW具有三个共同的条带(图2)，表明探针与小麦内源性SSI基因序列杂交且由于其六倍体性质，小麦基因组具有3个同源的SSI基因(拷贝)。在转基因事件的每条泳道还显示额外的独特条带(图2)，证实转基因的整合。基于不寻常的条带数，Ub1和Dy10转基因事件显示为仅具有单一SSI基因***(单一拷贝)，同时，Ub2似乎具有水稻基因的三个拷贝。这些结果证明了水稻基因依照预期的遗传模式的稳定***小麦基因组。

2.转基因表达

使用来自三个PCR阳性转基因品系和非转基因的Bobwhite的叶片和种子样本分离的RNA进行逆转录酶(RT)PCR。来自两个泛素启动子事件(Ub1和Ub2)的叶片样本产生与水稻SSI基因的预期大小匹配的条带(图3a)。所述Dy10启动子事件和非转基因的BW没有显示任何条带(图3a)，表明如预期的，Dy10启动子是种子特异性的。非转基因的BW的种子没有显示出水稻SSI条带，而所有三个独立的事件的种子显示出清晰的水稻SSI条带，表明泛素和Dy10启动子在转基因植物的种子中是活跃的。在基因组DNA样本和RNA样本之间的具有不同大小的单个微管蛋白条带证明，RNA样本没有被DNA污染(图3b)。用引物基因组DNA制备550bp的条带而cDNA制备409bp的条带。

Western印迹法用于检测小麦中SSI蛋白的存在。还包括水稻叶片样本。从水稻SSI蛋白序列开发的抗体识别在水稻和小麦中的SSI蛋白。在种子中，三个转基因事件，非转基因BW和水稻中仅检测到一个SSI蛋白条带。所述SSI蛋白在小麦和水稻中都显示相同的分子量(75kD)(图4)。然而，SSI条带强度在转基因小麦事件中比在非转基因小麦中强很多，这表明水稻SSI蛋白在三个转基因小麦事件的种子中生产。在种子样本中，所有的转基因事件连同水稻一起显示比非转基因小麦更强的信号。抗体与小麦内源性SSI和水稻SSI蛋白都结合。

在叶片中，在三个转基因事件和非转基因的BW中检测到2个SSI蛋白条带(亚型60KD和75KD)。75KD的SSI亚型在Ub2事件中比在Ub1事件中、Dy10和非转基因BW中显示出更强的条带强度。在水稻中仅检测到75KD的亚型(图4)。

3.热应力下的转基因事件的与产量相关的性状分析

基于PCR和RT-PCR，Southern印记分析和Western印记分析，三个事件(Ub1，Ub2和Dy10)被发现转基因(SSI)阳性。来自不同的品系(BWTC)的PCR阴性植物和非衍生自组织培养物(BWNTC)的Bobwhite植物与不同的SSI阳性品系进行比较。

Ub2不包括在第一个实验中，且只有BWTC植物被认为是对照。相比于BWTC，Ub1(3.22％)和Dy10(6.71％)事件在TKW有显著差异，如列于下表中的数据。

表2.使用水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSI)在T2代(实验1)中转基因的和非转基因小麦的TKW和种子数/筛选的头。

在这个实验中研究的植物的数量伴随在括号中的事件名称。BWTC-非转基因Bobwhite通过组织培养物建立，Ub1-具有泛素启动子的事件1286，Dy10-具有Dy10启动子的事件2173。

*和**分别表示P＜0.05和0.01的置信水平。

表3.与对照比较的三个实验的TKW改变的百分比

在比较中*、**、以及***，分别表示P＜0.05，0.01和0.001。

Ub观察结合Ub1和Ub2观察。

如表4所示，每个植物的有效分蘖数和生理成熟所需的天数显示无显著差异，但从上面的表2可以看出，Dy10事件的每个筛选的头的种子数是显著较低的。在最佳温度条件下，转基因事件和非转基因事件在任何研究的性状上无显著差异(表2和表4)。

表4.使用水稻可溶性淀粉合成基因(SSI)在T2代(实验1)中的转基因和非转基因小麦中的分蘖数/植物以及开花到PM所需天数

在这个实验中研究的植物总数伴随括号中的事件名称。BWTC-非转基因Bobwhite是通过组织培养建立的，Ub1-具有泛素启动子的事件1286，Dy10-具有Dy10启动子的事件2173。

T₂植物用于实验2(实验2)，且较高的温度用于热应力处理。将所有三个转基因事件与非转基因的Bobwhite植物比较。发现对于所考虑的性状，PCR阴性的Bobwhite(BWTC)和正常的Bobwhite(BWNTC)之间无显著差异。组织培养物来源的植物和非组织培养物来源的植物被合并作为对照。如上面表3，以及下面表5中所示的，与非转基因(BW)的植物相比，具有泛素(10.70％)和Dy10(25.67％)的启动子的转基因事件表现出显著的TKW增加。如表5所示，具有转基因的所有事件分别具有比非转基因品系更高的TKW。

表5.使用水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSI)在T₂和T₃代(实验2和3)中的转基因小麦和非转基因小麦之间进行的TKW比较。

这个实验中研究的植物数量伴随括号中的平均值。平均值“+”是阳性转基因植物，平均值“-”是非转基因植物。BWTC-非转基因的Bobwhite是通过组织培养建立的，BWNTC，非转基因Bobwhite植物，不是通过组织培养再生的。Ub1-具有泛素启动子的事件1286，Ub2-具有泛素启动子的事件1700。Ub观察结合Ub1观察和Ub2观察。Dy10-具有Dy10启动子的事件2173。STD是标准差。

*、**以及***，分别表示P＜0.05、0.01和0.001。

表6.使用水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSI)在T₂和T₃代中(分别为实验2和3)的转基因小麦和非转基因小麦之间的每个筛选的头的种子数的比较。

平均值“+”是阳性转基因植物，平均值“-”是非转基因植物。BWTC-非转基因的Bobwhite通过组织培养建立，BWNTC，非转基因的Bobwhite植物，不是组织培养再生的。Ub1-具有泛素启动子的事件1286，Ub2-具有泛素启动子的事件1700。Ub观察结合Ub1观察和Ub2观察。Dy10-具有Dy10启动子的事件2173。STD-标准差。

*和**，分别表示P＜0.05、0.01置信水平。

如可以看到的，相比于非转基因对照(BW)，Dy10事件在热应力(33/26℃)和最佳温度(25/15℃)的条件下产生显著较低的种子数目。在最佳温度条件下，TKW、分蘖数和生理成熟所需的天数没有显著区别。

表7.使用水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSI)在T₂和T₃代(分别为实验2和实验3)中的转基因小麦和非转基因小麦之间的用于生理成熟所需的天数的比较。

平均值“+”是阳性转基因植物，而平均值“-”是非转基因植物。BWTC-非转基因的Bobwhite通过组织培养建立，BWNTC，非转基因的Bobwhite，不是组织培养再生的。Ub1-具有泛素启动子的事件1286，Ub2-具有泛素启动子的事件1700。Ub观察结合Ub1观察和Ub2观察。Dy10-具有Dy10启动子的事件2173。STD-标准差。

*表示P＜0.05的置信水平。

可以看到，在热应力下Dy10事件比非转基因事件要用显著更长的时间达到生理成熟(2.66天)。

实验3使用T₃植物来完成，且使用比实验2更高的温度(34/28℃)进行应力处理。具有泛素(22.94％)和Dy10(34.59％)启动子二者的转基因事件产生的种子具有显著更高的TKW，相比于在热应力下的非转基因事件(表3和表5)。Dy10事件每个筛选的头产生显著更低的种子数，而具有泛素启动子的事件与非转基因事件相比没有显著差异(表6)。

表8.使用水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSI)在T₂和T₃代(分别为实验2和实验3)中的转基因小麦和非转基因小麦之间的分蘖数/植物的比较

平均值“+”是阳性转基因植物，而平均值“-”是非转基因植物。BWTC-非转基因的Bobwhite通过组织培养建立，BWNTC，非转基因的Bobwhite，不是组织培养再生的。Ub1-具有泛素启动子的事件1286，Ub2-具有泛素启动子的事件1700。Ub观察结合Ub1观察和Ub2观察。Dy10-具有Dy10启动子的事件2173。STD-标准差。

可以看到，每个植物的分蘖数在转基因事件和非转基因事件之间没有显著区别。生理成熟所需的天数在转基因和非转基因事件之间有显著区别，相比于非转基因植物，转基因事件具有平均1.28天额外的灌浆期(表7)。

不在实验2中，在实验1和实验3中，在最佳温度(22/15℃)下发现TKW中的一些差异。在实验3中，Ub2具有比非转基因BW显著更高的单个种子重量。在热应力或最佳温度条件下，在实验1和实验3中没有发现叶绿素含量的显著变化(数值未示出)。

使用T₄转基因植物，对于热应力使用比第三个实验更高的夜间温度和更低的日间温度(32-33)来完成第四个试验。

表9.实验4中的平均千粒重(TKW)，与BW相比的TKW变化百分比，以及平均种子数

*和**分别表示P＜0.05和0.01的置信水平。

与前面的实验一样，Ub1(13.58％)、Ub2(12.06％)和Dy10(29.51％)在高温下显示出比非转基因对照在千粒重上相当大的增量。在事件中千粒重有高的变化；其结果是，尽管在Ub1和Ub2中有显著的增加，在5％的水平没有显著的区别。在任何的温度条件下，所有的转基因事件都没有显示出对于每头的种子数的显著变化。在最佳温度条件的实验即将结束时，生长室的运行不良产生极端高温。因此，我们已经忽略在最佳温度条件下的千粒重的结果。

4.讨论

以前的工作已经证明SSI基因在淀粉质体的可溶相中进行的淀粉生物合成过程中的负责较短A和B1链的伸长。其结果是，SSI基因的突变或酶的破坏可能对结晶支链淀粉基质形成以及灌浆具有严重的影响。在这里，我们验证了使用高温(35℃)耐受的水稻SSI基因增加小麦在适度高温下的籽粒灌浆能力的假设。在这个实验中，我们使用两种不同的启动子将水稻SSI基因引入春季小麦品种(BW)，其通过PCR和基因组DNA印迹在T2代中确认(图3a)。分子分析(Southern印迹)揭示了小麦中内源性的SSI基因的三个拷贝，因为非转基因Bobwhite，连同所有转基因事件一起，用探针产生了针对水稻SSI基因的三个共同杂交条带(图3a)。这表明水稻SSI和小麦内源性SSI的高水平的相似性。此外，水稻SSIcDNA序列的blast分析(Blast2序列程序)揭示了与小麦的SSI基因具有88％的核苷酸同一性和81％的氨基酸同一性。使用DY10启动子以在逆转录酶(RT)PCR中使用来自叶片样本的cDNA(图3b)产生条带事件的失败证明转基因的启动子特异性表达。在Western印迹分析中，由于两种蛋白的大小相似，水稻SSI与小麦SSI的分离是不可能的。先前的工作已经报道，水稻SSI蛋白产生57KD的蛋白条带，但在我们的Western凝胶中，它产生与75KD小麦SSI条带几乎类似的75KD条带。使用水稻SSI的cDNA序列，我们发现该蛋白的预期的大小为75.7KD，其支持我们的发现。在叶片蛋白中的两种蛋白条带支持小麦叶片组织中的SSI的两种亚型的表达，但种子中只有一个亚型表达。

在这里，我们验证了在高温下的具有增加的活性的水稻SSI基因将补充在高温应力下的小麦SSI并通过维持淀粉生物合成增加单个谷物重量的假设。

在高温下的三个不同实验中，与非转基因品系相比，三个表达水稻SSI基因的转基因品系产生显著较重的种子。在一些实验中在最佳温度下一些转基因事件产生稍微更重的种子。这可能是由于生长室的最高温度的波动。我们观察到实际温度相对于设定温度稍稍升高，这可能会影响SSI的活性。在冬季的温室中进行的实验2中的最佳温度条件下转基因事件和非转基因事件没有变化。在这个实验中实际温度从未超过设置的点。小麦的SSI活性可能在25℃左右或甚至更低的温度下开始下降。很明显的转基因品系和非转基因品系之间的TKW差异随着热应力从实验1到实验2到实验3增加而增加(表3)。这个结果也支持温度增加降低小麦SSI活性比降低水稻SSI活性更多的假设，也支持之前的涉及SSI活性对籽粒灌浆的重要性的研究。

转基因和非转基因事件之间没有观察到叶绿素含量(数据未示出)的显著变化，这表明淀粉沉积的差异不是由于光合能力差异造成。这一结果与先前报道的工作一致，该工作报道了高温下籽粒灌浆的降低不是由于来自光合作用同化物的供给造成的。

分蘖数(表4和表8)和植物的高度(目测)的无变化表明转基因没有损害植物的形态。在具有Dy10启动子的转基因事件的实验1，实验2和实验3而不是实验4中发现每穗的显著较少的种子。这可能暗示Dy10启动子和种子结实能力之间可能存在相互作用，或基因的***点的简单产物或体细胞突变的作用，这种突变随着代的推进可能被修复。在文献中没有证据支持Dy10启动子可能损害植物的结实能力。

我们也注意到在测试的最高温度下转基因植物的生理成熟时间的略微增长。然而，我们的数据表明，SSI活性在高温下保持且可能允许继续使用光同化物。我们观察到的增加的籽粒灌浆期可能是由于通过降低糖类的积累降低光合作用的反馈抑制造成的。

用Dy10启动子进行的转基因生产最重的种子且具有最长籽粒灌浆期(GFD)。这个结果可以支持反馈抑制理论。尽管我们观察到一些Dy10植物也产生每穗较少的种子且总谷物产量降低，这可能是基于基因***位点的假象，因为基因***位点并非在所有Dy10植株中观察到。这种体细胞突变可以通过小麦品系的推进来解决。

我们的研究结果表明，引入更热稳定形式的关键酶可能是提高农作物耐热性的很好的策略。这种方法对那些在热应力条件下生长可能会限制产量的所有凉快季节的种类是有益的。该方法对于探索在高温条件下生长的其它种类的SS的相对热稳定性，以确定最耐热的酶的来源是有用的。

小麦内有为了维持在热应力下的绿度(greenness)的遗传变异。在此研究中使用的品种对热应力没有特别的耐受性。在品系中设置水稻构建体，显示了热耐受性，这可能是在热应力下达到更高生产水平的途径。

实施例3

相对热稳定性的预测

各种可溶性淀粉合成酶蛋白的相对热稳定性是使用由Li等人(Anovelscoringfunctionfordiscriminatinghyperthermophilicandmesophilicproteinswithapplicationtopredictingrelativethermostabilityofproteinmutants，BMCBioinformatics11：62，2010，开放访问)开发的算法预测的。得分值是分配给序列的相对(加权)值。比较Genbank中淀粉合成酶的几种蛋白序列，可以预测水稻蛋白比来自小麦的淀粉可溶合成酶具有更大的热稳定性(表1)。从表达修饰的水稻(Oryzasativa)SSS基因的小麦转基因品系获得的数据证实了这一预测。小麦(Triticumaetivum)的SSS蛋白序列(SEQIDNO：36)、粗山羊草(Atausachii)的SSS蛋白序列(SEQIDNO：37)和大麦(Hordeumvulgare)的SSS蛋白序列(SEQIDNO：38)被预测为最差热稳定性的品系。

基于该数据，由Genscript合成葡萄(Vitisvinifera)的密码子-优化的DNA序列(SEQIDNO：39)、毛果杨(Poplartriocarpa)的密码子-优化的DNA序列(SEQIDNO：40)和高粱(Sorghumbicolor)的密码子-优化的DNA序列(SEQIDNO：41)。核酸序列的修饰不改变最终的氨基酸序列。修饰部分是由于序列的密码子优化且用于克隆目的。这些基因已被亚克隆到用于小麦转化的两个质粒中(如上所述的DY10和玉米泛素启动子)。用这些载体进行遗传修饰的小麦处在被加工的过程中。

表10.筛选的来自各种类的淀粉合成酶蛋白的热稳定性关系预测

*转基因小麦品系中表达的氨基酸测序

**引入小麦的修饰的DNA序列

^A顺序列出的较高热稳定性到较低热稳定性。

基于此数据，表上部的种类与表中进一步向下的种类相比，具有更高相对热稳定性。

实施例4

在表达被预测具有升高的耐热性的SSS蛋白的转基因小麦中的热耐受性研究

将来自毛果杨、高粱和葡萄的基因针对小麦进行密码子优化(基于它们的内源/天然序列进行修饰)并合成，随后转化进小麦并测试筛选的事件的热耐受性。三种密码子优化的可溶性淀粉合成酶的基因(毛果杨(PtriSSS)的(SEQIDNO：40)，葡萄(VvitusSSS)的(SEQIDNO：39)和高粱(SbieolorSSS))的(SEQIDNO：41))被亚克隆到pAHC17(包含玉米泛素启动子)或pJL10P5(含有小麦的HMW-Dy10的谷蛋白启动子和胭脂碱合成酶(NOS)终止子)(图1)且如实施例1中所述被转化进小麦。几个事件被回收并从这些植物收获种子(表11)。

表11.由用衍生自葡萄、毛果杨和高粱的密码子-优化SSS基因序列转化小麦所回收的转基因事件。

载体和GOI	#转基因BW植物
		pJL-Vvitus	19
p17-Vvitus	14
		pJL-Ptri	16
p17-Ptri	9
		pJL-Sbi	9
p17-Sbi	4

*PJL：pJL10P5载体(谷蛋白启动子)；P17：pAHC17载体(玉米泛素启动子)

在T1代毛果杨和葡萄事件上进行热处理试验。由2205M(PJL-Vvitus)、2294D(p17-Vvitus)、2267B(pJL-Ptri)和2230D(p17-Ptri)事件，以及对照(未转化的)Bobwhite的种子，每种种植十个幼苗。最佳生长温度下，所有的转基因植物和非转基因的Bobwhite植物之间没有观察到生理差异。热处理的结果表明，在热应力下与Bobwhite对照植物相比所有SSS基因转基因品系在籽粒灌浆阶段具有增加粒重(2205MTKW比对照组高，但不显著)(图5)。具体而言，数据表明在升高的温度下转基因植物的种子重量比对照重(即高)20-30％。

实施例5

在表达被预测具有升高的耐热性的SSS蛋白的小麦胚性愈伤组织中的热耐受性研究

在本实施例中，测试了体外对衍生自组织培养物(愈伤组织或愈伤组织)的材料作用。在转基因愈伤组织上进行热处理试验。热处理前，将愈伤组织切成平均的两部分并放入每个培养皿中相同数目的网格内。用淀粉比色/荧光检测试剂盒，测试在热处理下的一些愈伤组织的可溶性淀粉的浓度。如图6所示，证明了在32℃下的对热应力的一些耐受性。与20℃(右上)的对照相比，在热处理后的4周，许多非转基因愈伤组织死亡(左上)。在相同的热处理下的转基因愈伤组织生长(左下)持续生长。初步结果表明，在热处理后，相比于非转基因对照，转基因愈伤组织具有增加的耐热性，并含有显著更高的可溶性淀粉。数据表明，这些SSS基因在胚性组织中是有效的。此外，这些体外热处理试验可用于筛选目标转基因的有效性。

实施例6

在表达被预测具有升高的耐热性的SSS蛋白的玉米愈伤组织中耐热性的研究

为了验证耐热性SSS基因在除了小麦的其他物种的有效性，玉米愈伤组织(HiIIAXHiIIB基因型)被用毛果杨(PtriSSS)的(SEQIDNO：40)或葡萄(VvitusSSS)的(SEQIDNO：39)，在玉米泛素启动子和含有草胺磷抵抗基因的pACH20控制下共转化，并通过Songstadt等人(1996)所描述的再生。具有毛果杨性状的48个事件以及具有葡萄SSS基因的13个事件被鉴定并且正在再生。

为了测试在升高的温度下耐热性SSS基因对生长的有效性，对非转基因的(对照)和转基因的玉米胚性愈伤组织进行热处理(35℃)，玉米愈伤组织在正常生长温度(25℃)生长13天。最初约250mg的愈伤组织用于每个样本中，然后在实验完成时称重。在25℃下对照愈伤组织的生长与最初重量相比，组织增长了8.56倍。在35℃下生长的对照组织，生长仅增加了1.8倍。从转基因品系中观察到在25℃下的生长超过了最初重量7.56倍，与对照类似。与最初重量相比，在35℃下的转基因品系具有9.28倍的增长。实验数据表明将来自毛果杨的耐热密码子-优化的SSS基因(SEQIDNO：40)加入到玉米，显著提高了组织在升高的温度下的生长，并表明毛果杨序列的表达可以赋予玉米耐热性。

Claims (36)

1.一种遗传修饰植物，所述遗传修饰植物与对照植物相比具有对热应力增加的耐受性，所述遗传修饰植物包含编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸。

2.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述热稳定性蛋白在温度大于25℃下维持淀粉合成酶活性。

3.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中当植物在热应力下生长时，所述遗传修饰植物与所述对照植物相比具有增加的产量。

4.根据权利要求3所述的遗传修饰植物，其中所述增加的产量选自增加的总种子重量、增加的千粒重、增加的生物量，及其组合。

5.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述植物包含具有淀粉合成酶活性的内源性蛋白，所述内源性蛋白具有第一相对热稳定性，并且所述热稳定性蛋白具有第二相对热稳定性，其中所述第二相对热稳定性大于所述第一相对热稳定性。

6.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述植物选自谷物、块茎类植物和豆科植物。

7.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述遗传修饰植物是第一植物种类，并且其中所述具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白源于第二植物种类，所述第一植物种类与所述第二植物种类是不同的。

8.根据权利要求7所述的遗传修饰植物，其中所述第二植物种类是耐热性植物。

9.根据权利要求7所述的遗传修饰植物，其中所述第二植物种类选自水稻、三叶杨、葡萄、高粱、大豆、玉米、豆类、藻类、三叶草、苋、拟南芥、可可、番茄、木薯、苜蓿、菜豆、鹰嘴豆和桃。

10.根据权利要求7所述的遗传修饰植物，其中所述第一植物种类选自小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米、小米、黑麦、高粱、黑小麦、荞麦、藜麦、大豆、豆类、豌豆、苜蓿、马铃薯、甘薯、木薯和山药。

11.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，所述核酸编码包含SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20氨基酸序列的热稳定性淀粉合成酶蛋白，或编码与SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20具有至少约50％的氨基酸同一性并保持其功能特性的热稳定性淀粉合成酶蛋白。

12.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述核酸包括：(a)SEQIDNO：1，3，5，或7的核苷酸序列；或(b)与SEQIDNO：1，3，5或7具有至少约70％的序列同一性的核苷酸序列。

13.根据权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述外源核酸与所述植物是异源的。

14.一种提高植物对热应力耐受性的方法，所述方法包括：

用编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的外源核酸转化植物以产生转化的植物，由此增强所述转化的植物的热应力耐受性。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述转化包括：

将包含编码具有淀粉合成酶活性的热稳定性蛋白的核酸的核酸构建体引入所述植物中，所述核酸构建体在所述转化的植物中表达淀粉合成酶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸可操作地连接到在植物细胞中驱动表达的启动子上。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸构建体通过载体或质粒引入。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸由从耐热植物中分离的淀粉合成酶基因合成，并在所述引入前克隆进所述构建体。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述转化的植物包括具有淀粉合成酶活性的内源性蛋白，所述内源性蛋白具有第一相对热稳定性，所述淀粉合成酶基因编码具有第二相对热稳定性的热稳定性蛋白，其中所述第二相对热稳定性大于所述第一相对热稳定性。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述热稳定性蛋白包括选自SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的氨基酸序列，或包括与选自SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的序列具有至少50％的氨基酸同一性并保留其功能特性的氨基酸序列。

21.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸包括：(a)选自SEQIDNO：1，3，5，或7的核苷酸序列；或(b)与SEQIDNO：1，3，5，或7具有至少约70％的序列同一性的核苷酸序列。

22.根据权利要求14所述的方法，其中所述植物包括植物组织，且所述转化包括：

在培养基上培养所述组织；以及

将所述外源核酸引入所述组织的细胞以产生转化的组织。

23.根据权利要求22所述的方法，进一步包括：

从所述组织再生整个植物，其中所述再生的植物具有对热应力增加的耐受性。

24.根据权利要求23所述的方法，所述再生包括：

从所述转化的组织诱导愈伤组织的形成；

再生枝条；以及

在生根培养基中使所述枝条生根以再生整个植物。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述引入选自：农杆菌介导的转化，PEG介导的摄取，电穿孔介导的摄取，粒子轰击-介导的传递、病毒感染、和/或显微注射。

26.根据权利要求14所述的方法，进一步包括在升高的生长条件下使所述转化的植物的生长，其中所述转化的植物在所述升高的生长条件下与对照植物相比具有增加的产量。

27.一种遗传修饰种子，由根据权利要求14的方法获得的转化的植物产生。

28.根据权利要求27所述的遗传修饰种子，其中所述种子与由对照植物生产的种子相比具有增加的种子重量。

29.一种生产与对照植物相比具有对热应力增加的耐受性的遗传修饰植物的方法，所述方法包括：将第一亲本植物与第二亲本植物杂交以由此产生子代，其中所述第一亲本植物或第二亲本植物中的至少一个是根据权利要求1-13任一所述的遗传修饰植物，所述子代与对照植物相比具有对热应力增加的耐受性。

30.根据权利要求29所述的方法，其中每个所述第一亲本植物和第二亲本植物是根据要求1-13任一所述的遗传修饰植物。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一亲本植物是根据权利要求1-13任一所述的遗传修饰植物，并且所述第二亲本植物具有抗虫特性。

32.根据权利要求29所述的方法，进一步包括筛选对热应力增加的耐受性的子代植物。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述杂交包括：

从所述第一亲本植物和所述第二亲本植物生产子代种子；

收获和种植所述子代种子以生产子代植物。

34.一种重组植物细胞，通过用含有编码具有淀粉合成酶活性的外源性热稳定性蛋白的核酸构建体稳定转化，所述重组植物细胞含有过量表达的具有淀粉合成酶活性的外源性热稳定性蛋白。

35.根据权利要求34的重组植物细胞，其中所述热稳定性蛋白包含选自SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的氨基酸序列，或包含与选自SEQIDNO：2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20的序列具有至少约50％氨基酸同一性并保持它们的功能特性的氨基酸序列。

36.根据权利要求34的重组植物细胞，其中所述核酸构建体包括：(a)SEQIDNO：1，3，5，或7的核苷酸序列；或(b)与SEQIDNO：1，3，5，或7具有至少约70％的序列同一性的核苷酸序列。