CN105624320B - 利用ssr指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法，涉及到茶树全基因组中3条特异的SSR标记(SEQ ID No:1‑3)及其引物。利用32份来自12个省份的优良茶树品种作为样本材料，在茶树全基因组中选取415对SSR引物进行多态性筛选，最终确定3对引物作为舒茶早品种鉴定的核心SSR引物，可有效将舒茶早和其它茶树品种区分开，不仅有利于舒茶早品种的保护，还对市售舒茶早茶的真伪鉴别提供了一个快速、准确的方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法。
背景技术
舒茶早无性系，灌木型，中叶类，早生种，由安徽省舒城县农业技术推广中心于1975-1994年从舒城舒茶镇九一六茶场采用单株育种法选育而成，1995年安徽省农作物品种审定委员会审定为省级品种，2002年舒茶早由全国农作物品种审定委员会审定为国家品种。树姿半开张，分枝较密，叶片稍上斜状着生，叶片长椭圆，叶色深绿，有光泽，叶质厚较软。芽叶生育力强，发芽整齐，长势强。一芽三叶盛期在4月上旬，产量高，主要分布在安徽江北茶区，安徽岳西、金寨、东至山东茶区已有大面积种植。适合制作茶树，如舒城小兰花和岳西翠兰，制兰花茶，外形色泽翠绿，香气清鲜持久，滋味醇厚。
随着国家对植物新品种保护制度不断的完善，越来越多的育种者对新品种权保护的意识增强，积极申请新品种保护。由舒茶早所制成的“小兰花茶”是当地名茶，每年都会有不同的新品种出现，而仅凭肉眼从外观形态上很难辨别真伪，随着国家对植物新品种保护制度的不断完善，急需开发有效的技术措施对舒茶早优良品种进行精准鉴定。本发明利用SSR指纹图谱技术对舒茶早品种进行鉴定，从DNA水平上给予舒茶早独特的指纹身份，有效防止其他品种冒充舒茶早，从而达到保护舒茶早优良品种的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法。
本发明利用SSR指纹图谱技术鉴别舒茶早品种，其中涉及茶树基因组中三个特异的微卫星SSR标记，该标记的重复单元是由二碱基和三碱基组成，是茶树基因组中比较丰富的微卫星标记，分别为：①SSR-54：5′-AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3′；②SSR-256：5′-AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG-3′；③SSR-285：5′-ATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3′。(SEQ ID No:1-3)。
上述标记SSR-54、SSR-256和SSR-285的左、右侧翼保守序列分别如SEQ ID No:6和7、SEQ ID No:10和11以及SEQ ID No:14和15所示。
基于SSR引物设计原则，根据上述SSR标记的侧翼序列设计引物，引物序列为：
SSR-54引物序列为：
上游引物：5′-AGACACGAAATAGGTAGG-3′，Tm：51.4℃(SEQ ID No:4)
下游引物：5′-AGACACGAAATAGGTAGG-3′，Tm：51.4℃(SEQ ID No:5)
SSR-256引物序列为：
上游引物：5′-ACTGGTAGGCGACAAACT-3′，Tm：53℃(SEQ ID No:8)
下游引物：5′-GCGACCCAAATCACTTAG-3′，Tm：53℃(SEQ ID No:9)
SSR-285引物序列为：
上游引物：5′-GCCATAAAGAGCAACAAG-3′，Tm：51.4℃(SEQ ID No:12)
下游引物：5′-CCTCACCATAACAACACC-3′，Tm：53℃(SEQ ID No:13)
SSR引物的筛选步骤如下：以32份来自12个省份的优良茶树品种作为样本材料，进行样品总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物的设计筛选，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，然后采用Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***复筛，根据电泳结果筛选出核心引物。
本发明中茶树总DNA提取是采用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组DNA。对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择和引物设计筛选，在获得10万个含SSR位点的序列中，二碱基和三碱基是茶树基因组中比较丰富的微卫星类型，从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物，其中SSR引物筛选的原则如下：
①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。
②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。
③退火温度在45℃-55℃，最好在50℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃。
④引物3’端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。
所述的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，具体是将PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，选取扩增率大于等于75％、条带单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引物的初筛。并通过Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***进行复筛，能够精确地反映等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物，最终确定了三对核心引物SSR-54(SEQ ID No:4和5)、SSR-256(SEQ ID No:8和9)和SSR-285(SEQ ID No:12和13)，其PIC值分别为0.882、0.900和0.886，用于舒茶早品种的鉴定。
本发明还提供一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法，包括如下步骤：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述核心引物，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物，如果用引物SSR-54能够扩增出193bp和221bp大小的特征条带，则待测植株为舒茶早茶树品种。
PCR扩增体系：50ng/μL基因组DNA 2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，10×EasyTaq酶缓冲液2μL，EasyTaq DNA聚合酶1U，2.5mM dNTP 2μL，ddH2O加至总量20μL。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色；或者通过毛细管电泳检测PCR扩增产物。
优选用Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***检测PCR扩增产物，由于Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***最低分辨为2bp，因此利用所述核心引物对待测植株扩增出的特征条带分别是193±3bp、221±3bp，均可判定为舒茶早品种。
本发明进一步提供用于筛选或鉴别舒茶早茶树品种的PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述核心引物SSR-54(SEQ ID No:4和5)和/或SSR-256(SEQ ID No:8和9)和/或SSR-285(SEQ ID No:12和13)。
本发明具有以下优点：
(一)本发明基于茶树基因组开发出SSR引物，与EST-SSR相比，具有多态性高、数量多的特点。通过大量的引物筛选，最终确定三对核心引物用于对舒茶早品种的鉴定。
(二)本发明采用SSR指纹图谱技术，该技术具有稳定性好、操作简单，准确率高的特点，对舒茶早优良品种鉴定提供一种精确、快速、简单的方法。
(三)本发明所选用的材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对舒茶早品种生长任何时期内的任意器官，或制作好储存一段时间的干茶进行DNA提取，均不会影响鉴定结果。
(四)本发明进行引物筛选优选用Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***，该***具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的SSR指纹图谱技术起到重要作用，并缩短了舒茶早优良品种鉴定的周期。
附图说明
图1为本发明实施例1中干茶或鲜叶总DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为本发明实施例3中利用核心SSR引物对32个茶树品种进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3-图5分别为本发明实施例3中32个茶树品种的SSR指纹图谱。
图6为本发明实施例3中三对核心引物的PCR扩增产物测序结果与目的片段比对图，旨在验证引物的真实性，即扩增产物序列中是否包含SSR位点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中引物序列由上海生工合成，PCR扩增产物测序工作由上海生工完成。PCR反应试剂购自Transgeng公司。
以下实施例中使用的CTAB提取液配方如下：20mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.075v/v‰β-巯基乙醇，1.0mM NaCl，4w/v％PVPP-40，CTAB/SDS 2w/v％(十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠质量比1：6)。
实施例1干茶或鲜叶总DNA的提取
实验对象：所用茶树品种见表1。
表1茶树品种
注：其中编号1、2、3、4、15、16、17、24、25、30对应的品种为国家级品种，5、6、7、8、9、10、14、19、20、21、22、23、26、27、28、29对应的品种为省级品种，12、13为黄山野生茶树。
用改良的CTAB法从干茶或鲜叶中提取总DNA，具体操作如下：
①取2ml离心管加磨碎的干茶粉末0.1g，加900mL预热至65℃的CTAB提取液，加20mLβ-巯基乙醇，65℃水浴20min，每隔10min轻轻上下摇匀几次，然后加10mL RNAase置于65℃水浴15min，每隔5min上下摇匀几次。
②13000r/min，离心10min，取上清液800mL，加400mL Tris平衡酚，加等体积的氯仿：异戊醇(氯仿和异戊醇体积比为24:1)至2mL，上下颠倒混匀，13000r/min离心10min，取上清液650mL转移到新的2ml管中，加氯仿：异戊醇650mL，颠倒混匀，13000r/min离心5min，取上清液500mL置于新的2ml管中。
③加乙醇(预先放置于-20℃冰箱中，用完及时放入冰箱中)至2ml处，上下颠倒几次(会有絮状物出现)，置于-20℃冰箱中静置5min(放置时间可以略长)，倒掉管中的乙醇，再加入乙醇至2ml处，轻轻上下混匀几次后倒掉乙醇(注意不要将DNA倒掉)，然后8000r/min离心30s，倒掉剩余的乙醇。
④加500mL ddH2O，置于37℃水浴溶解DNA约4min，放冰上预冷5min，加冷乙醇至2mL，轻轻上下颠倒混匀。13000r/min离心3min，空柱8000r/min离心2min，如果看到沉淀物不是透明色重复步骤④。
⑤将空管放在真空泵抽提15min，根据固体剩余量加200mlddH2O，测定核酸含量，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA(图1)。
实施例2SSR标记的选择和引物的初筛
在获得的10万个含有SSR位点的序列中，二碱基和三碱基是茶树基因组中比较丰富的微卫星类型，其中涉及茶树基因组中三个特异的微卫星SSR标记，分别为：①SSR-54：5′-AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3′；②SSR-256：5′-AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG-3′；③SSR-285：5′-ATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3′。(SEQ ID No:1-3)。
上述标记SSR-54、SSR-256和SSR-285的左、右侧翼保守序列分别如SEQ ID No:6和7、SEQ ID No:10和11以及SEQ ID No:14和15所示。
从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物。
SSR引物筛选的原则如下：
①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。
②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。
③退火温度在45℃-55℃，最好在50℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃。
④引物3’端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。
PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛：
PCR扩增体系：50ng/μL基因组DNA 2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，10×EasyTaq酶缓冲液2μL，EasyTaq DNA聚合酶1U，2.5mM dNTP 2μL，ddH2O加至总量20μL。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃±3℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
其中退火温度根据每个引物决定。将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，选取扩增率大于等于75％、条带清晰且单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引物的初筛。
实施例3Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***复筛引物
具体操作如下：
1、试剂的准备：
1)配胶：向200mL dsDNA 800 Separation Gel中加入10μL Inter calating Dye，充分混匀。
2)1×Inter Buffer：将5×Inter Buffer稀释5倍。
3)1×Capillary conditioning solution：将5×Capillary conditioningsolution稀释5倍，向96孔板中分别加入1mL Capillary conditioning solution，避免出现气泡。
4)Marker：向96孔板中分别加入33μL 35bp and 500bp Markers，每个孔里加入一滴Mineral oil封住，离心。
5)样品制备：向96孔板的各孔中加入20μL Dolution buffer和3μL PCR产物，最后一个孔加入23μL 35-400bp Range DNA Ladder，离心避免出现气泡。
2、操作步骤：将所配制好的试剂放入仪器指定位置，点击仪器的运行程序。
3、数据记录和结果分析：每条带中选取峰值最高的条带，记录具体数值大小。对引物复筛的要求包括以下几点：(1)主带清晰，没有多余杂带；(2)多态性值高，等位位点多；(3)在两个相近的等位位点之间条带相差大小应大于4bp；(4)对符合上述三点的引物进行三次重复性扩增，选择重复性、稳定性好的引物，最终筛选出三对用于鉴定舒茶早品种的核心SSR引物，分别为SSR-54(SEQ ID No:4和5)、SSR-256(SEQ ID No:8和9)和SSR-285(SEQID No:12和13)。
三对引物组合能够有效的将32个茶树品种区分开来，引物256和引物285各能区分11个茶树品种，引物54能区分10个品种，其中引物54对舒茶早品种扩增出两个特异性等位位点，分别是193bp和221bp，能够准确、快速的鉴定出舒茶早品种，结果见表2和图2，三对核心引物的毛细管电泳指纹图谱见图3-图5，由于Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***最低分辨为2bp，因此该核心引物对舒茶早品种扩增出的两条带所允许范围分别是193±3bp、221±3bp。
表2 3对核心引物在32个茶树品种中扩增出的基因型
三对核心SSR引物的PCR产物测序结果与目的片段比对图见图6。
实施例4舒茶早茶树品种真实性的鉴定
供试材料：待测茶品种干茶样A，确定为舒茶早品种的干茶样B。
试验方法：①分别对干茶样A、B提取DNA，②利用实施例3的三对核心引物对上述两份DNA样品进行PCR扩增，③用Fragment Analyzer TM全自动毛细管电泳***对PCR产物分析。
结果与讨论：通过与舒茶早品种的毛细管电泳指纹图谱比对，如果茶样A扩增出与茶样B相同的多态性条带(即大小分别为193bp和221bp)，或者扩增条带与茶样B在一定误差范围内一致(分别为193±3bp、221±3bp)，则可以确定茶样A为舒茶早品种，不符合上述原则的不是舒茶早品种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 1
agagagagag agagagagag agagag 26
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 2
aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag 30
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 3
atgatgatga tgatgatgat gatgatg 27
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agacacgaaa taggtagg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agacacgaaa taggtagg 18
<210> 6
<211> 150
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 6
tcaacacaca attctcataa ttatgtataa cttgctaaca ggaaaagaat aagcacatta 60
actttgataa accagcttct ttacaaactt atttgatgat ctatagttta tttacaagac 120
acgaaatagg taggacaatc tactcgagct 150
<210> 7
<211> 150
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 7
cataggaatg tagttgagaa aatcatggac aaaaatttaa aggaaattgt aaatgttgaa 60
agaaaataac atagaataat ataaatgaag tagcactagg agaagaggca tttaaagtaa 120
ttaatgcaca ccgaatagga tttaatgatc 150
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actggtaggc gacaaact 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgacccaaa tcacttag 18
<210> 10
<211> 150
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 10
atcatctatg agaagaaaca aaaattcata gaacttttaa ttacctaatg aaatatttga 60
ctggtaggcg acaaacttac attggcatta tctctgaaag tgggaaaaaa aaatataact 120
taaaattaca taaaatttaa cgtagaaagt 150
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 11
gcaatcatat aaatcacctt ggttggtttt gctgatgaca actagtcctg atatgccttg 60
tttgcttaca aatgctatat tttctctttt tgcccacatg attctcttta ggatgttttt 120
gtctaagtga tttgggtcgc ccctttgaag 150
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccataaaga gcaacaag 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctcaccata acaacacc 18
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 14
atggttccaa ttctgagggc cataaagagc aacaagttct ctaagtttag aatcctcagc 60
tggcctccaa tgccctcttc cacaaacctt tgaatccatt tcctcttcca tactagtatc 120
tgtttcatta ggtttcattt cttcagaccc 150
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> 茶树
<400> 15
atcacctctc tcactttcac agctggtagt agtagtatta gcagcacagt tttccattaa 60
tggaggagag ttgttgttgt tgttgttgtt gttgttgttg gtgttgttat ggtgaggagt 120
taagaaacta tgaagagaac ccattgatga 150
Claims (3)
1.利用SSR指纹图谱鉴别霍山金鸡种茶树品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提取待测植株的基因组DNA；
2）以待测植株的基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增反应；
3）检测PCR扩增产物，如果能够扩增出273bp和281bp大小的特征条带，则待测植株为霍山金鸡种茶树品种；
其中，步骤1）所述待测植株选自霍山金鸡种、仙寓早、大叶云峰、黄山特早芽、凫早2号、黄山野茶18号、赣茶1号、上梅州、黔辐4号、黄金茶2号、君山银针1号；
步骤2）所述引物的序列为：
上游引物：5′- ACTGGTAGGCGACAAACT -3′
下游引物：5′- GCGACCCAAATCACTTAG -3′ 。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中通过毛细管电泳检测PCR扩增产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1）用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组DNA。
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