CN105624190A - 一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；与现有技术相比，本发明通过转基因技术ipt基因用来转化植物，使得植物内源性细胞***素水平升高。在这些转基因植物，ipt基因通过多种启动子驱动，例如组成型的、天然的和诱导型启动子，驱动表达达到增产目的。目前，随着分子生物学的发展和生物技术的广泛应用，利用基因工程对植物基因组在分子水平上进行修饰，定向改变植物的某些性状，为品种的改良开辟了一条新的途径。

Description

一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法
技术领域
本发明涉及一种玉米育种方法，尤其涉及一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法。
背景技术
衰老是植物自身发育的降解或再活化的过程，在植物不断的生长与发育的过程中积累，衰老过程中，同化能力减弱或丧失，营养物质大量流失至新的组织器官中，当处在不利的环境条件下，如各种生物或非生物胁迫，可能会引起植物过早地衰老，缩短植物生命，而降低作物产量。衰老是一个受外部和内部各种因素影响的过程，也是一个植物内部精细调控的过程。影响叶片衰老的外部因素包括光照、温度、干旱、营养物质、非生物等原因，内部因素包括基因调控、内源或外源植物激素、年龄等。
作物物种提供用于人类消费或为生产生物能源和其他用途的成熟或近成熟的果实或种子，植物发育的最后阶段涉及全株衰老过程，其中从营养植物部分的矿物元素，营养物质转移到成熟果实或贮藏器官。这种类型的衰老的是一个整体植物被称为一次果衰老与树木衰老和灌木不同，农作物是这种衰老类型。多年来关于作物植物产量和衰老之间的关系的假说有很多，Thomas认为，延长最大光合活性的一段时间，即延迟衰老，应得到更高的产量。叶面积和产量之间的正相关性应该适用于对大多数农作物对于总生物量生产和块茎作物，这种关系相对于要求种子产量的作物，两者之间关系更加复杂，特别是谷类作物。谷物产量是由库(即籽粒发育)和源(即光合作用营养组织)决定的。当前的主要看法是，库容大小是产量的主要限制因素，尤其是在小麦谷物如小麦。尤其是在结实期时，是决定产量的水平是至关重要。尽管对于小麦籽粒产量只稍受籽粒灌浆过程在源活性的改变影响，而在玉米产量似乎取决于维护源的高活性，即在保持在光合组织不受影响，两中作物似乎在有关于在灌浆期源库关系与产量上有很大不同，而叶片过早的衰老都会影响两者产量。尽管源库关系是决定产量形成的基本结构，但在作物生长后期，若叶片过早衰弱，光合速率减弱，直接导致库强源不足，从而影响作物产量。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；
所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T-nos，CaMV35S启动子驱动Epsps基因作为选择标记；
A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul 10×buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37℃反应1h，65℃终止，胶回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；
B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In-Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS载体两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提取试剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT-PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带有smaI酶切位点引物PCR扩增，
引物序列为：
I-G-4-R：5’-ATTCGAGCTCGGTACCCGGGATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’
I-G-4-F：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’
20mlPCR体系：
反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30cycle，72℃延伸10min，8℃终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳；
回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序结果和原序列进行比对；
ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：
I-Q-1-R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGC
I-Q-1-F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA
C：植物表达载体构建与验证：根据上部试验克隆的目的基因片段，将目标基因片段与酶切线性载体以摩尔比2:1混合到10μL去离子水中，再加入到含有In-Fusion酶的离心管中混匀，PCR仪控制温度37℃15min，50℃15min，12℃放置10min，后转移到冰上，取2μL上述连接产物50ul大肠杆菌5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，之后37℃活化菌体1h，均匀涂在含抗生素AMP+的LB固体培养基平板培养，挑取平板上单菌落，37℃LB液体培养基培养12h，TransGen质粒提取试剂盒提取质粒，进行载体单酶切验证smaI单酶切验证，之后电泳对比构建前后载体大小变化情况，最后送至由上海生工生物工程有限公司测序；与Genebank库中的cDNA测序比对后导入农杆菌5α感受态-80℃保存；
D：农杆菌感受态制备与转化：挑取农杆菌菌落于2ml YEP液体(rif20mg/ml)培养基中，150rpm/min温度28℃摇床过夜活化，取2ml过夜活化菌液接种于50ml YEP液体培养基中150rpm/min，28℃培养生长至OD600≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm离心5分钟，在2ml0.2mmol预冷的CaCl2溶液涡旋感受态细胞；按200ul分装到1.5mlEp管中，储存于-80℃待用，将5ul目的基因质粒(约1ug)加于200ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻5min,后迅速置37℃水浴中热激5min感受态细胞；在无菌工作台上加入1ml YEP培养基活化菌体，之后150rpm/min，28℃摇床培养4h，将活化后的菌体4000rpm/min离心1min，去掉上清液，无菌工作台中加入100ul YEP液体培养基涡旋细胞；涂上含Kan(50mg/ml)的YEP固体培养基平板上，28℃恒温培养2-3天；
所述ZmIPT2基因对玉米的遗传转化：实验材料：玉米杂交种HiII，具体方法如下：
(1)工程菌液制备：活化的农杆菌平板，挑取单克隆，300ulYEP液体培养基稀释后，农杆菌在含卡那霉素(Kan)50mg/L、利福平(rif)50mg/L的YEP培养基上19℃培养3天；
(2)农杆菌侵染玉米幼胚：农杆菌液5ml的液体侵染培养基中加入AS终浓度100uM；幼胚放入侵染培养基，AS终浓度100uM；另从平板中挑取单菌落EHA105(携带质粒pCAMBIA-5300)接种到5mL YEB液体培养基中，28℃，220r/min振荡培养至对数生长期成为农杆菌悬浮液(OD550＝0.6-0.7)，加入幼胚在悬浊液中，静止5min；侵染后吸出菌液，将幼胚转移到共培养基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培养皿，20℃暗培养三天；经过三天共培养，胚转移到恢复培养基上，在28℃的暗培养7天；转移从共培养基到恢复培养基；幼胚28℃暗培养7天，转移至筛选培养基I，含1.5mg/L草甘膦培养2周；两个星期以后，移至筛选培养基II，草甘膦增加到3mg/L，侵染五周后，产生II型愈伤，将II型胚性抗性愈伤组织在再生培养基I上暗培养三个星期完成成熟出苗，植株长至4-6厘米，根系充分发育，转移至土壤基质中，放在培养室中26摄氏度/22摄氏度(白天/晚上)16小时光照，8小时黑暗，二周后，挑选生长状态较好的幼苗，移栽入含有营养土：蛭石：大田土＝1：1：1的大花盆中，定期浇水直至结实；
(3)PCR检测
Epsps基因引物：
Epsps-6-R：5’-ACATCGAAGTCATCAACCCG-3’
Epsps-6-F：5’-GAATTCGAGCTCATCAGGCA-3’
ZmIPT2基因引物:
I-T-1-R:5'AGATGGTGAGGGCTTTCC 3'
I-T-1-F:5'GCGCGCTATATTTTGTTT 3'
20mlPCR体系：
PCR反应条件：94℃，5min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃1min；33个循环；72℃，10min；8℃终止反应；反应完取3ml与2ul Loading buffer琼脂糖凝胶电泳检测；
RT-PCR检测：
(1)植物RNA的提取
取转基因玉米植株新鲜片叶期的幼嫩叶片，置于干净研钵研磨成细粉，操作步骤按照北京全试金试剂公司RNA提取试剂盒说明书进行；采用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度；之后-80℃保存；
(2)cDNA的合成
取2μL RNA为模板，用公司反转录试剂盒；
冰板上操作，在200mlPCR管中加入检测质量好的200ng玉米总RNA、1ul Anchoredoligo(dT)18、11.5ul RNase-free Water，轻轻混回65℃孵育5min，冰上放置2min；
加入1ul 10mM dNTPs，4ul 5×ES RT Buffer，0.5ul Ribonuclease Inhibitor(50units/ul)，1ulRT，轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃5s使RT酶失活；合成第一条cDNA；
(3)PCR扩增
根据基因序列设计引物，扩增片段长度为522bp，以总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
Epsps基因引物：
E-r-1-R：5’-GGCGACAGCGAGAATC-3’
E-r-1-F：5’-GGTGAAATCGGAAGACG-3’
20mlPCR体系：
PCR反应程序：
94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10min，4℃终止反应，30个循环，PCR反应结束后，取5μL混合液加入1ul Loading buffer，在1％琼脂糖凝胶电泳；
所述转ZmIPT2基因后代的功能检测：实验材料：转ZmIPT2基因T2代3个株系I143、I146、I150，方法如下：
叶绿素含量检测：
(1)玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，剪碎加入丙酮与无水乙醇2:1的混合溶液中，浸泡至叶片完全脱色为止；
(2)将提取液倒入石英比色皿中，在分光光度计663nm和645nm处分别测定叶绿素a和叶绿素b值；计算公式如下：
叶绿素a的含量＝(12.7A663-2.69A645)V/1000*W
叶绿素B的含量＝(22.7A663-4.68A645)V/1000*W
叶绿素总含量＝(20.2A663+8.02A645)V/1000*W
A663：、A645分别为相应波长时的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重；所测叶绿素单位为mg/g FW；
CTK含量检测：液氮取玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，准确称重0.5g；浴加入80％甲醇1ml溶液研磨叶片成匀浆装入10ml离心管；4℃提取4小时，8000r/15min离心，吸取上清至新10ml离心管中，再原管中加入1ml 80％甲醇ml，混合均匀，继续4℃提取1小时；4℃8000r/15min离心；再浸提1次；合并三次提取上清液，4℃8000r/10min离心除去底部残渣，加入等体积石油醚，混合均匀，待分层后去除绿色的石油醚相；甲醇相样品氮气吹干浓缩加入50ul样品稀释液；测定方法见试剂盒：
(1)标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品稀释5个梯度48μg/L、24μg/L、12μg/L、6ug/L、3μg/L和空白孔；
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干；
(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
(7)温育：操作同3；
(8)洗涤：操作同5；
(9)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
(11)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)；测定应在加终止液后15分钟以内进行；
计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，与现有技术相比，本发明通过转基因技术ipt基因用来转化植物，使得植物内源性细胞***素水平升高。在这些转基因植物，ipt基因通过多种启动子驱动，例如组成型的、天然的和诱导型启动子，驱动表达达到增产目的。目前，随着分子生物学的发展和生物技术的广泛应用，利用基因工程对植物基因组在分子水平上进行修饰，定向改变植物的某些性状，为品种的改良开辟了一条新的途径。
附图说明
图1是本发明的Pcambla5300-ubi-Epsps载体酶切电泳图；
图2是本发明的植物表达载体目的片段PCR；
图3是本发明的Pcambla5300-ubi-Epsps-ZmIPT2载体单酶切验证；
图4是本发明的载体构建前后比较电泳图；
图5是本发明的农杆菌侵染玉米幼胚；
图6是本发明的T1代转基因材料ZmIPT2基因PCR检测；
图7是本发明的T1代转基因材料Epsps基因PCR检测；
图8是本发明的T2代转基因材料RT-PCR检测；
图9是本发明的不同时期转基因株系及受体自交系的叶绿素含量对比图；
图10是本发明的不同时期转基因株系及受体自交系的细胞***素含量对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
本发明包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；
所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T-nos，CaMV35S启动子驱动Epsps基因作为选择标记；
A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul 10×buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37℃反应1h，65℃终止，胶回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；
B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In-Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS载体两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提取试剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT-PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带有smaI酶切位点引物PCR扩增，
引物序列为：
I-G-4-R：5’-ATTCGAGCTCGGTACCCGGGATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’
I-G-4-F：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’
20mlPCR体系：
反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30cycle，72℃延伸10min，8℃终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳；
回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序结果和原序列进行比对；
ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：
I-Q-1-R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGC
I-Q-1-F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA
C：植物表达载体构建与验证：根据上部试验克隆的目的基因片段，将目标基因片段与酶切线性载体以摩尔比2:1混合到10μL去离子水中，再加入到含有In-Fusion酶的离心管中混匀，PCR仪控制温度37℃15min，50℃15min，12℃放置10min，后转移到冰上，取2μL上述连接产物50ul大肠杆菌5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，之后37℃活化菌体1h，均匀涂在含抗生素AMP+的LB固体培养基平板培养，挑取平板上单菌落，37℃LB液体培养基培养12h，TransGen质粒提取试剂盒提取质粒，进行载体单酶切验证smaI单酶切验证，之后电泳对比构建前后载体大小变化情况，最后送至由上海生工生物工程有限公司测序；与Genebank库中的cDNA测序比对后导入农杆菌5α感受态-80℃保存；
D：农杆菌感受态制备与转化：挑取农杆菌菌落于2ml YEP液体(rif 20mg/ml)培养基中，150rpm/min温度28℃摇床过夜活化，取2ml过夜活化菌液接种于50ml YEP液体培养基中150rpm/min，28℃培养生长至OD600≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm离心5分钟，在2ml0.2mmol预冷的CaCl2溶液涡旋感受态细胞；按200ul分装到1.5mlEp管中，储存于-80℃待用，将5ul目的基因质粒(约1ug)加于200ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻5min,后迅速置37℃水浴中热激5min感受态细胞；在无菌工作台上加入1ml YEP培养基活化菌体，之后150rpm/min，28℃摇床培养4h，将活化后的菌体4000rpm/min离心1min，去掉上清液，无菌工作台中加入100ul YEP液体培养基涡旋细胞；涂上含Kan(50mg/ml)的YEP固体培养基平板上，28℃恒温培养2-3天；
结果与分析：
基础植物表达载体的线性化
根据上述方法构建单子叶植物表达载体，酶切基础表达载体Pcambla5300-ubi-Epsps，酶切1h，smaI单酶切线性化载体，电泳检测结果(如图1)基础表达载体被切位线性。
ZmIPT2基因片段克隆
经与载体同源15个碱基引物RT-PCR从玉米基因组中克隆ZmIPT2基因cDNA全长(如图2)，在Infusion酶作用下，与上部试验酶切线性载体片段混合、重新拼接完整的重组载体，之后冷融法将重组质粒转入大肠杆菌感受态中，筛选阳性菌落，PCR检测目的基因全长cDNA，测序比对cDNA全长，测序检测正确。
植物表达载体构建与验证：
用质粒提取试剂盒从上部试验大肠杆菌中提取重组质粒Pcambla5300-ubi-ZmIPT2载体，单酶切验证。酶切方法同上，SmaI单酶切1h后，0.1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图3所示比较基础载体酶切前后表明ZmIPT2基因被重新切下，由于目的基因内有smaI酶切位点，所以目的基因被切为605bp和363bp两部分。同时电泳检测构建前后载体(如图4)，原载体分子量为12658bp，重组载体分子量约13627bp。两部验证试验ZmIPT2基因被构建到指定载体部分上，且载体分子量大小确实增加。载体构建完成后，根据设计的ZmIPT2基因cDNA测序引物测序。测序结果用DNAMAN软件与Genebank数据库中查到的玉米的ZmIPT2基因cDNA序列进行比对，相似度为100％。经这三部验证试验证明该基因已经被正确的都构建到基础载体目的位置上，而且目的基因没有发生基因突变。
所述ZmIPT2基因对玉米的遗传转化：实验材料：玉米杂交种HiII，具体方法如下：
(1)工程菌液制备：活化的农杆菌平板，挑取单克隆，300ulYEP液体培养基稀释后，农杆菌在含卡那霉素(Kan)50mg/L、利福平(rif)50mg/L的YEP培养基上19℃培养3天；
(2)农杆菌侵染玉米幼胚：农杆菌液5ml的液体侵染培养基中加入AS终浓度100uM；幼胚放入侵染培养基，AS终浓度100uM；另从平板中挑取单菌落EHA105(携带质粒pCAMBIA-5300)接种到5mL YEB液体培养基中，28℃，220r/min振荡培养至对数生长期成为农杆菌悬浮液(OD550＝0.6-0.7)，加入幼胚在悬浊液中，静止5min；侵染后吸出菌液，将幼胚转移到共培养基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培养皿，20℃暗培养三天；经过三天共培养，胚转移到恢复培养基上，在28℃的暗培养7天；转移从共培养基到恢复培养基；幼胚28℃暗培养7天，转移至筛选培养基I，含1.5mg/L草甘膦培养2周；两个星期以后，移至筛选培养基II，草甘膦增加到3mg/L，侵染五周后，产生II型愈伤，将II型胚性抗性愈伤组织在再生培养基I上暗培养三个星期完成成熟出苗，植株长至4-6厘米，根系充分发育，转移至土壤基质中，放在培养室中26摄氏度/22摄氏度(白天/晚上)16小时光照，8小时黑暗，二周后，挑选生长状态较好的幼苗，移栽入含有营养土：蛭石：大田土＝1：1：1的大花盆中，定期浇水直至结实；
(3)PCR检测
Epsps基因引物：
Epsps-6-R：5’-ACATCGAAGTCATCAACCCG-3’
Epsps-6-F：5’-GAATTCGAGCTCATCAGGCA-3’
ZmIPT2基因引物:
I-T-1-R:5'AGATGGTGAGGGCTTTCC 3'
I-T-1-F:5'GCGCGCTATATTTTGTTT 3'
20mlPCR体系：
PCR反应条件：94℃，5min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃1min；33个循环；72℃，10min；8℃终止反应；反应完取3ml与2ul Loading buffer琼脂糖凝胶电泳检测；
RT-PCR检测：
(1)植物RNA的提取
取转基因玉米植株新鲜片叶期的幼嫩叶片，置于干净研钵研磨成细粉，操作步骤按照北京全试金试剂公司RNA提取试剂盒说明书进行；采用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度；之后-80℃保存；
(2)cDNA的合成
取2μL RNA为模板，用公司反转录试剂盒；
冰板上操作，在200mlPCR管中加入检测质量好的200ng玉米总RNA、1ul Anchoredoligo(dT)18、11.5ul RNase-free Water，轻轻混回65℃孵育5min，冰上放置2min；
加入1ul 10mM dNTPs，4ul 5×ES RT Buffer，0.5ul Ribonuclease Inhibitor(50units/ul)，1ulRT，轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃5s使RT酶失活；合成第一条cDNA；
(3)PCR扩增
根据基因序列设计引物，扩增片段长度为522bp，以总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
Epsps基因引物：
E-r-1-R：5’-GGCGACAGCGAGAATC-3’
E-r-1-F：5’-GGTGAAATCGGAAGACG-3’
20mlPCR体系：
PCR反应程序：
94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10min，4℃终止反应，30个循环，PCR反应结束后，取5μL混合液加入1ul Loading buffer，在1％琼脂糖凝胶电泳；
结果与分析
遗传转化结果
用农杆菌侵染玉米HiII自交系萌动胚，通过侵染，共生、筛选和再生培养，共转化玉米HiII幼胚7832个，获得愈伤组织2457个，其中II型愈伤组织1623个，结合抗性愈伤形态观察结果，可看到抗性愈伤呈现白色，而非抗性愈伤组织为褐色，说明筛选培养效果良好。经筛选后的愈伤组织在再生培养基，选取分化率高，长势良好的抗性愈伤组织分化中分化成植株、生根，整个过程大约经过45d，共获得草甘膦抗性的64个转基因植株。整个过程(如图5，a：农杆菌侵染玉米幼胚共生培养；b：玉米幼胚恢复培养(可见愈伤组织)；c：玉米愈伤组织筛选培养(可见II型愈伤组织)；d：玉米愈伤组织再生；
e：分化植株；f：幼苗移栽)。
PCR检测结果
将上述两种方法获得的抗性幼苗，取叶片PCR检测目标基因和筛选标记基因，检测结果：其中农杆菌侵染萌动胚方法获得了48株PCR检测呈阳性幼苗，遗传转化率(阳性苗数/外植体数)为0.93％；农杆菌侵染幼胚方法获得了PCR检测呈阳性幼苗12株，遗传转化率为0.18％。两种转化方法所得T0代转基因植株经PCR检测T0代转基因幼苗共得到62株PCR阳性植株，总遗传转化率为0.48％、总幼苗阳性率(阳性苗数/抗性苗数)为3.54％。
将上部试验得到T0幼苗种植于东北农业大学转基因基地，自交授粉，成熟后单株收获，即为T1代。T1代种子种种植于东北农业大学转基因基地，待植株长至3叶期，CTAB法提取T1代叶片总DNA，PCR检测Epsps基因和ZmIPT2基因(如图6；图7)。通过PCR检测结果转基因植株和阳性对照扩增出367bp目的基因片段和522bp的片段筛选标记基因片段，阴性对照和空白对照未扩增出条带。(图6中Figure3-12ZmIPT2gene PCR analysis resultoftransgenic T1 plants
M：DNA marker 2000bp；O：Pcambla5300-ubi-ZmIPT2质粒对照；N：非转基因对照W:无菌水对照1-12对应着转基因株系I139、I141、I143、I144、I146、I148、I149、I150、I151、I153、I157、I162
M:DL2000DNA marker；O:plasmid of Pcambla5300-ubi-ZmIPT2；N:DNA fromnon-transgenic plant；1–12:transgenic lines)(图7中Figure3-12Gene of Epsps PCRanalysis oftransgenic T1plants
M：DNA marker 2000bp；P：Pcambla5300-ubi-ZmIPT2质粒对照；W:无菌水对照N：非转基因对照；1-12：对应着转基因株系I139、I141、I143、I144、I146、I148、I149、I150、I151、I153、I157、I162
M:DL2000DNA marker；P:Pcambla5300-ubi-ZmIPT2；N:DNA from non-transgenicplant；W:Sterile water control；1–9:transgenic lines.)
根据T1代分子检测结果，选取遗传稳定性好的株系，种到东北农业大学转基因试验基地，得到T2代植株。待长至大约3叶期时选取T2代新鲜叶片，CTAB法提取总DNA，PCR检测，转基因植株和阳性对照扩增出367bp目的基因片段和522bp的片段筛选标记基因片段，阴性对照和空白对照未扩增出条带。计算阳性粒数(目的基因和标记基因都PCR阳性)、阳性率(阳性粒数/检测总粒数×100％，PCR结果如。T2代几个株系阳性率接近3:1分离比，说明ZmIPT2基因符合3:1的孟德尔遗传规律。
表3-1T2代部分转基因材料统计
Table 3-1the T2generation part genetically modified materialstatisticsv
RT-PCR检测
以PCR鉴定为阳性的T2代转基因阳性植株为材料，对T2代转基因植株进行RT-PCR检测。提取稳定遗传且长势良好的三叶期转基因植株叶片提取叶片总RNA。用检测质量完好浓度适当的阳性植株总RNA在逆转录酶作用下得到cDNA，后经RT-PCR检测，检测目的片段大小为1269bp。电泳结果检测结果显示(如图8)阳性质粒与转基因株系在目标大小位置有条带，非转基因对照没有条带，说明ZmIPT2基因导入玉米基因组，且在转基因玉米中转录水平上表达。
所述转ZmIPT2基因后代的功能检测：实验材料：转ZmIPT2基因T2代3个株系I143、I146、I150，方法如下：
叶绿素含量检测：
(1)玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，剪碎加入丙酮与无水乙醇2:1的混合溶液中，浸泡至叶片完全脱色为止；
(2)将提取液倒入石英比色皿中，在分光光度计663nm和645nm处分别测定叶绿素a和叶绿素b值；计算公式如下：
叶绿素a的含量＝(12.7A663-2.69A645)V/1000*W
叶绿素B的含量＝(22.7A663-4.68A645)V/1000*W
叶绿素总含量＝(20.2A663+8.02A645)V/1000*W
A663：、A645分别为相应波长时的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重；所测叶绿素单位为mg/g FW；
CTK含量检测：液氮取玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，准确称重0.5g；浴加入80％甲醇1ml溶液研磨叶片成匀浆装入10ml离心管；4℃提取4小时，8000r/15min离心，吸取上清至新10ml离心管中，再原管中加入1ml 80％甲醇ml，混合均匀，继续4℃提取1小时；4℃8000r/15min离心；再浸提1次；合并三次提取上清液，4℃8000r/10min离心除去底部残渣，加入等体积石油醚，混合均匀，待分层后去除绿色的石油醚相；甲醇相样品氮气吹干浓缩加入50ul样品稀释液；测定方法见试剂盒：
(1)标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品稀释5个梯度48μg/L、24μg/L、12μg/L、6ug/L、3μg/L和空白孔；
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干；
(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
(7)温育：操作同3；
(8)洗涤：操作同5；
(9)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
(11)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)；测定应在加终止液后15分钟以内进行；
计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
农艺性状鉴定
试验地点在东北农业大学转基因实验基地，所有试验严格遵守转基因试验安全规章制度。方法来自于石云素主编《玉米种质资源描述规范和数据标准》相关设计方法，统一分子检测阳性同一编号T2转基因材料，根据分子检测结果，选定3个株系分别为I143、I146、I150，设相应的非转基因材料K10自交系做对照，共三次重复，每个株系2个小区，每个小区5行，行长2m，株距11cm，行距0.7m，单株种植，同常规大田管理试验地点为东北农业大学转基因实验基地。田间调查农艺性状项目具体见(表3-2)。之后，所有无用材料全部焚烧无害化处理。用统计分析软件EXC、SPSS 22统计计算。
表3-2调查性状及方法
Table 3-2 Traits andmethods in investigation
叶面积持续期鉴定
根据刘开昌评价玉米保绿性指标评价的方法，调查单株数和绿叶数，计算单株叶面积(LA)、叶面积持续期(LAD)、相对绿叶面积(RGLA)[119]。
单株叶面积＝L×W×0.75×N(L表示叶片中脉长度，W表示叶片最大宽度，N表示单株绿叶片数)；
相对绿叶面积＝抽丝后某时刻绿叶面积/抽丝期最大绿叶面积×100％(以玉米抽丝期绿叶面积为100％)；以生理成熟期的相对绿叶面积(％)表示保绿性(stay-greendegree)。
叶面积持续期＝(LA2+LA1)×(T2-T1)/2(LA1和T1分别表示前一次的叶面积、取样时间，LA2和T2分别表示后一次的叶面积、取样时间)；
数据分析方法
试验Excel统计试验数据，用统计分析软件SPSS 22.0、处理农艺性状、持绿性状数据，计算算术平均数、标准误差，T测验检验试验数据差异显著性。
结果与分析
叶绿素含量检测
根据计算试验结果数据(图9)，随叶片衰老，无论转基因株系还是非转基因株系的叶绿素含量均呈先升高到最大值再逐渐降低的趋势。当达到开花期时，无论转基因材料还是对照玉米叶绿素含量达到最大值，后一直下降。转基因株系的叶绿素含量下降速度慢于对照材料。除转基因株系I146与对照无明显变化外，其他转基因株系的叶绿素含量在每个时期都比对照高，特别在玉米衰老后期。转基因株系I143在拔节期相对于对照高0.49mg.g- 1FW有显著水平差异，在乳熟期、成熟期比对照有极显著差距高分别较对照高出0.71mg.g- 1FW、0.55mg.g-1FW；转基因株系I150在乳熟期、成熟期相对于对照有显著水平差异分别较对照高0.36mg.g-1FW、0.35mg.g-1FW。以上结果说明ZmIPT2基因表达，尤其是生长后期可能该基因的表达至叶绿素含量下降速度减缓，因而ZmIPT2基因过表达起到稳定延缓叶绿素含量下降作用。
CTK含量检测
试验结果如(如图10)，细胞***素含量和叶绿素含量的变化趋势一致，随着玉米生长抽雄期开始，随叶片的衰老，大体上试验间整体时期玉米材料的CTK含量整体呈现先上升后降低的趋势；当达到开花期时所有株系材料CTK含量都达到最大值，之后所有株系CTK含量开始下降。转基因株系I143与对照在乳熟期、成熟期有显著差异，比对照分别高2.11ug.g-1FW、5.77ug.g-1FW；转基因株系I150与对照在开花期、乳熟期有显著差异，分别比对照高7.13ug.g-1FW、7.59ug.g-1FW，在成熟期有极显著差异，高于对照3.94ug.g-1FW。整体测定数据转基因株系(I146除外)都高于对照。
农艺性状测定
依据分子检测结果，选取检测阳性同一编号T2转基因材料。选取3个转基因玉米株系分别为I143、I146、I150，统一收获后，测定各项农艺性状。测定试验数据，计算统计结果如(表3-3)，与叶片细胞***素、叶绿素含量测定结果相似，转基因株系农艺性状、产量上也高于对照(I146株系除外)，转基因株系I143与对照相比在行粒数、穗粗、株高、百粒重有显著差异，分别比对照高出7.94％、5.19％、2.41％、7.03％，在穗长上有极显著差异高出对照6.75％，其他性状均无明显差异；转基因株系I150与对照相比在穗长、粒厚、株高、百粒重有显著差异分别比对照高出4.57％、4.27％、5.16％、9.01％，在其他农艺性状无显著差异。另外，在整个玉米生育期中，转基因材料在形态学特征上与对照无明显变化，说明转ZmIPT2基因玉米不引起除抗衰老性状以外的其他玉米生理变化。从上述结果可以推断转ZmIPT2基因玉米材料能最终影响到玉米产量，证明了该基因的确能通过延缓叶片衰老达到增产的目的。
表3-3T2代转基因株系和受体对照自交系的农艺性状计算结果
Table 3-3 The Planttestoftransgenic plants and acceptorinbred line
注：“*”表示在0.05水平上显著；“**”表示在0.01水平上显著。
叶片持绿性鉴定
依据分子检测结果，对3个T2代转基因玉米株系分别为I143、I146、I150，统一收获后，根据刘开昌方法测定影响玉米持绿性相关性状。
表3-4比较T2代转基因株系和受体对照自交系成熟期持绿性
Table 3-4 T2 transgenic lines and control receptor inbred relativelymature Stay Green
注：“*”表示在0.05水平上显著；“**”表示在0.01水平上显著。
如表3-4说明，持绿性方面转基因株系好于对照。玉米成熟期时，转基因株系(I146除外)在绿叶数、叶面积持续期与对照相比有显著差异。在相对绿叶面积上比对照有极显著差异转基因株系在相对绿叶面积上与对照有极显著差异，分别高于对照23.4％、38.8％；在叶面积持续期有显著差异分别高于对照15.0％、22.6％。另外，转基因株系比非转基因对照有明显滞绿现象，与叶绿素含量测量结果相似，说明转ZmIPT2基因在玉米基因组中的整合与表达，推迟叶片衰老进程；相对绿叶面积的延长，客观上延长了玉米叶片的功能期，使转基因玉米材料有了更长的光合作用时间，增加积累生物量的能力，这不仅对提高了玉米抗衰老性。而且产量的提高有显著的促进作用，上部分试验小区产量增加证明玉米能通过转ZmIPT2基因达到延长绿叶时间，推迟衰老进而增加产量的目的。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，其特征在于：包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；
所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T-nos，CaMV35S启动子驱动Epsps基因作为选择标记；
A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul 10×buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37°C反应1h，65°C终止，胶回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；
B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In-Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS载体两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提取试剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT-PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带有smaI酶切位点引物PCR扩增，
引物序列为：
I-G-4-R：5’-attcgagctcggtacccgggATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’
I-G-4-F：5’ -GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’
20mlPCR体系：
无菌水 13.5ul
10×tran taq Buffer I (Mg2+) 2ul2.5mM/L
I-Q-1-R 0.5ul(10pM)
I-Q-1-F 0.5ul(10pM)
dNTP 2ul(200uM/L)
质粒 1ul约1ug
高保真Tad酶 0.5ul(2U)
反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30 cycle，72℃延伸10 min，8℃终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳；
回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序结果和原序列进行比对；
ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：
I-Q-1-R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGC
I-Q-1-F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA
C：植物表达载体构建与验证：根据上部试验克隆的目的基因片段，将目标基因片段与酶切线性载体以摩尔比2:1混合到10 μL去离子水中，再加入到含有In-Fusion酶的离心管中混匀，PCR仪控制温度37℃ 15min，50℃ 15min，12℃放置10min，后转移到冰上，取2 μL上述连接产物50ul大肠杆菌5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，之后37℃活化菌体1h，均匀涂在含抗生素AMP+的LB固体培养基平板培养，挑取平板上单菌落，37 ℃ LB液体培养基培养12h，TransGen质粒提取试剂盒提取质粒，进行载体单酶切验证smaI单酶切验证，之后电泳对比构建前后载体大小变化情况，最后送至由上海生工生物工程有限公司测序；与Genebank库中的cDNA测序比对后导入农杆菌5α感受态-80°C保存；
D：农杆菌感受态制备与转化：挑取农杆菌菌落于2ml YEP液体（rif 20mg/ml）培养基中，150rpm/min温度28℃摇床过夜活化，取2ml过夜活化菌液接种于50ml YEP液体培养基中150rpm/min，28℃培养生长至OD600≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm离心5分钟，在2ml 0.2mmol预冷的CaCl2溶液涡旋感受态细胞；按200ul分装到1.5mlEp管中，储存于-80℃待用，将5ul目的基因质粒(约1ug)加于200ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻5min, 后迅速置37℃水浴中热激5min感受态细胞；在无菌工作台上加入1ml YEP培养基活化菌体，之后150rpm/min，28℃摇床培养4h，将活化后的菌体4000rpm/min离心1min，去掉上清液，无菌工作台中加入100ul YEP液体培养基涡旋细胞；涂上含Kan（50mg/ml）的YEP固体培养基平板上，28℃恒温培养2-3天；
所述ZmIPT2基因对玉米的遗传转化：实验材料：玉米杂交种HiII，具体方法如下：
（1）工程菌液制备：活化的农杆菌平板，挑取单克隆，300ulYEP液体培养基稀释后，农杆菌在含卡那霉素（Kan）50 mg/L、利福平（rif）50 mg/L的YEP培养基上19℃培养3天；
（2）农杆菌侵染玉米幼胚：农杆菌液5ml的液体侵染培养基中加入AS终浓度100uM；幼胚放入侵染培养基，AS终浓度100uM；另从平板中挑取单菌落EHA105(携带质粒pCAMBIA-5300)接种到5 mL YEB液体培养基中，28°C，220r/ min 振荡培养至对数生长期成为农杆菌悬浮液（OD550=0.6-0.7），加入幼胚在悬浊液中，静止5min；侵染后吸出菌液，将幼胚转移到共培养基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培养皿，20℃暗培养三天；经过三天共培养，胚转移到恢复培养基上，在28ºC的暗培养7天；转移从共培养基到恢复培养基；幼胚28ºC暗培养7天，转移至筛选培养基I，含1.5 mg/L草甘膦培养2周；两个星期以后，移至筛选培养基II，草甘膦增加到3 mg/L，侵染五周后，产生II型愈伤，将 II型胚性抗性愈伤组织在再生培养基I上暗培养三个星期完成成熟出苗，植株长至4-6厘米，根系充分发育，转移至土壤基质中，放在培养室中26摄氏度/22摄氏度（白天/晚上）16小时光照，8小时黑暗，二周后，挑选生长状态较好的幼苗，移栽入含有营养土：蛭石：大田土=1：1：1的大花盆中，定期浇水直至结实；
（3）PCR检测
Epsps基因引物：
Epsps-6-R：5’-ACATCGAAGTCATCAACCCG-3’
Epsps-6-F：5’-GAATTCGAGCTCATCAGGCA-3’
ZmIPT2基因引物:
I-T-1-R: 5' AGATGGTGAGGGCTTTCC 3'
I-T-1-F: 5' GCGCGCTATATTTTGTTT 3'
20mlPCR体系：
无菌水 13.5ul
10×tran taq Buffer I (Mg2+) 2ul2.5mM/L
上游引物 0.5ul(10pM)
下游引物 0.5ul(10pM)
dNTP 2ul(200uM/L)
质粒 1ul约1ug
Tad酶 0.5ul（2U）
PCR 反应条件：94℃，5 min；94℃，30sec；56℃，30 sec；72℃ 1min；33个循环；72℃，10min；8 ℃终止反应；反应完取3ml与2 ul Loading buffer琼脂糖凝胶电泳检测；
RT-PCR 检测：
（1）植物RNA的提取
取转基因玉米植株新鲜片叶期的幼嫩叶片，置于干净研钵研磨成细粉，操作步骤按照北京全试金试剂公司RNA提取试剂盒说明书进行；采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度；之后-80°C保存；
（2）cDNA的合成
取2μL RNA为模板，用Fermentas®公司反转录试剂盒；
冰板上操作，在200mlPCR管中加入检测质量好的200ng玉米总RNA、1ul Anchoredoligo(dT)18 、11.5ul RNase-free Water，轻轻混回65°C孵育5min，冰上放置2min；
加入1ul 10mM dNTPs，4ul 5×ES RT Buffer，0.5ul Ribonuclease Inhibitor(50units/ul)，1ul EasyScript® RT，轻轻混匀，42°C孵育30min，85°C 5s使EasyScript® RT酶失活；合成第一条cDNA；
（3）PCR扩增
根据基因序列设计引物，扩增片段长度为522bp，以总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
Epsps基因引物：
E-r-1-R：5’-GGCGACAGCGAGAATC-3’
E-r-1-F：5’-GGTGAAATCGGAAGACG-3’
20mlPCR体系：
无菌水 13.5ul
10×tran taq Buffer I (Mg2+) 2ul2.5mM/L
E-r-1-R 0.5ul(10pM)
E-r-1-F 0.5ul(10pM)
dNTP 2ul2ul(200uM/L)
质粒 1ul约1ug
高保真Tad酶 0.5ul(2U)
PCR反应程序：
94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10min，4 ℃终止反应，30个循环，PCR反应结束后，取5 μL混合液加入1 ul Loading buffer，在1%琼脂糖凝胶电泳；
所述转ZmIPT2基因后代的功能检测：实验材料：转ZmIPT2基因T2代3个株系I143、I146、I150，方法如下：
叶绿素含量检测：
（1）玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，剪碎加入丙酮与无水乙醇2:1的混合溶液中，浸泡至叶片完全脱色为止；
（2）将提取液倒入石英比色皿中，在分光光度计663nm和645nm处分别测定叶绿素a和叶绿素b值；计算公式如下：
叶绿素a的含量=（12.7A663-2.69A645）V/1000*W
叶绿素B的含量=（22.7A663-4.68A645）V/1000*W
叶绿素总含量=（20.2A663+8.02A645）V/1000*W
A663：、A645分别为相应波长时的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重；所测叶绿素单位为mg/g FW；
CTK含量检测：液氮取玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，准确称重0.5g；浴加入80%甲醇1ml溶液研磨叶片成匀浆装入10ml离心管；4°C提取4小时，8000r/15min离心，吸取上清至新10ml离心管中，再原管中加入1ml 80%甲醇ml，混合均匀，继续4°C提取1小时；4°C 8000r/15min离心；再浸提1次；合并三次提取上清液，4°C 8000r/10min离心除去底部残渣，加入等体积石油醚，混合均匀，待分层后去除绿色的石油醚相；甲醇相样品氮气吹干浓缩加入50ul样品稀释液；测定方法见试剂盒：
（1）标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品稀释5个梯度48μg/L、24μg/L、12μg/L、6ug/L、3μg/L 和空白孔；
（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
（5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干；
（6）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
（7）温育：操作同3；
（8）洗涤：操作同5；
（9）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
（10）终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）；
（11）测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）； 测定应在加终止液后15 分钟以内进行；计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
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