CN105624161B - 一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉一种种子和棉花纤维优势表达的启动子及其应用。本发明涉及的问题是为棉花品种的改良提供一种新的选择。本发明的技术方案是一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，本发明还包括具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主。本发明还涉及该启动子的应用，本发明的启动子可以用于植物种子或棉花纤维的遗传改良。

Description

一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉一种种子和棉花纤维优势表达的启动子及其应用。

背景技术

棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上第一大天然纤维作物，作为重要的纺织原料，棉纤维具有重要的经济价值。棉花又是最重要的油料作物，据统计，棉花是我国第三大油料作物，世界第六大油料作物。近十年(2004～2013)全国的棉花产量稳定在600万吨到750万吨之间(中国统计年鉴2014)，全国每年约有1500～1800万吨的棉籽产量，棉籽中含有丰富的蛋白质和脂肪，是一个巨大的可利用资源。

棉纤维是棉花所特有的一种种子表皮细胞，是从胚珠表皮细胞分化而来的单细胞，这一特性就决定了棉花种子发育与纤维发育之间的不可分割的关系。棉花纤维是重要的纺织工业原料，我国是棉纺织品消费和出口大国，因此，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。能否迅速提高我国棉花品种的纤维品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工、纺织设备制造、外贸出口等行业的生存与发展。虽然利用传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了很大的成功，但近20年来，世界棉花品种在产量上已经达到一个平台期，利用现有的遗传资源和育种手段难以再大幅度提高棉花产量(Meredith W.R.Better Crops 2000 84(4):6～9)。单纯依靠常规育种改良棉花纤维品质相当困难。

这是因为：1)棉花纤维强力、细度等品质性状基因与皮棉产量存在负连锁，常规育种方法很难打破这种遗传上的负相关；2)我国的棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉 (纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等，这些优良性利用基因工程的方法可以打破物种间的遗传障碍，实现目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点。但是，外源基因的导入可能会对植物生长和发育产生有害作用。在这种情况下，基因表达需要被限制在期望的目标组织中。启动子是RNA聚合酶能够特异识别的一段DNA分子，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录是基因表达调控的第一步，也是关键一步(Lewi，2005基因VIII 669～705，北京：科学出版社)。启动子对外源基因在生物体中的表达时间、部位及水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。在棉花纤维品质的基因工程改良中，往往需要外源基因特异或优势地在纤维细胞中表达，从而降低外源基因对棉花正常生长的影响。如果采用棉花纤维优势启动子，则可以使目的基因的表达主要控制在纤维中。另外，棉纤维是由种子表皮细胞伸长发育而来，种子的生长状态同样会对纤维的产量和品质形成产生影响。因此，棉花纤维或种子优势启动子的克隆，对棉花纤维发育的基因功能研究和纤维品质的基因工程改良，都具有十分重要的价值。

前人通过利用纤维特异启动子，尝试通过生物工程技术改良棉花纤维的品质，已有成功的报道。John等(John M E,Keller G.Metabolic Proc.Natl.Acad.Sci., USA1996，93：12768-12773)将乙酰CoA还原酶基因(phaB)和PHB合成酶基因(phaC)分别置于纤维特异性启动子E6和FbL2A的控制下并转入陆地棉中，成功获得同时表达phaB和phaC基因的转基因棉花。转基因棉花分析发现棉株纤维中不仅有phaB和phaC的特异表达，而且含有PHB颗粒。HPLC分析结果表明：PHB的合成始于开花后10d，每克纤维干重含约30-3440μg的PHB 并维持到纤维成熟，而且PHB的存在的确提高了纤维的热绝缘性能。

在基因工程改良棉纤维方面颇为人们关注的另一个焦点是美国Auburn大学Daniell的研究工作。Daniell(Henry Daniell，Beltwide Cotton Conferences，1998， 595～598)试图将编码含Val-Pro-Gly-Val-Gly重复单元的蛋白聚体(protein-basedpolymers,PBPs)基因遗传转化棉花，使棉花细胞能特异表达出PBPs蛋白。PBPs 蛋白广泛存在于自然界中，如哺乳动物***中的弹性蛋白，分子内含有由多个氨基酸组成的重复顺序，PBPs分子常表现出较强的弹性(弹性系数10.6～ 10.9Pa)。Daniell(Henry Daniell，Beltwide Cotton Conferences，1998，595～598) 认为将PHBs引进棉纤维，一方面有望提高纤维的弹性和强度，另一方面纤维中蛋白质含量的提高，纤维吸水能力增强，与染料的亲和力亦相应增强，这是目前常规育种方法所做不到的。

特异启动子在棉花基因工程育种中的重要性，在Zhang等人的工作中表现的更为突出(Zhang,et al,Nature Biotechnology，2011，29:453-458)。Zhang 等利用单克隆抗体原位杂交技术对IAA进行细胞定位，发现IAA在开花当天的棉花纤维起始细胞中高浓度积累；而无纤维突变体则没有明显的IAA信号，表明IAA对棉花纤维细胞的起始具有十分重要的作用。棉花纤维细胞是由胚珠外珠被表层细胞经分化突起、伸长而形成的。研究表明，只有开花后5天之内突起的表皮细胞(约占10％左右)可以发育成为具有纺纱价值的长纤维。他们根据“生长素在棉花纤维突起细胞中极性分布”这一发现，分析了前人利用生长素改良棉花纤维失败的原因。认为必须把生长素的极性分布与棉花纤维细胞发育的特点结合起来，利用特异启动子对生长素合成酶基因进行特定部位、时间和强度上的精确调控，方能达到改良纤维产量和品质的目的。于是他们将来自矮牵牛而且表达活性区在胚珠外表皮，控制基因表达的时间在开花前2天到开花后8天的FBP7启动子，与生长素生物合成基因iaaM融合并导入棉花中。转基因棉花表型分析结果表明，不仅胚珠表面纤维数目增加、衣分得到提高，而且纤维细度也得到改良，即转基因棉花纤维的产量和品质得到同步改良。先锋公司部门副总裁Michael Lassner认为，该研究“清楚地证明了启动子的选择在性状改良上的重要性”(《Faculty of 1000》，2011年9月14日)。“展现了新一代转基因作物的光明前景”(Jeffrey Chen，Nature Biotechnology，2011,29(5): 407-409)。

棉花种子或纤维特异启动子在棉花基因工程改良中的巨大价值，使这类启动子得到克隆。然而，目前能用于棉花基因改良的启动子仍然非常有限，因此，获得更多棉花种子或纤维优势表达启动子，不仅对今后棉花纤维的基因工程改良和纤维发育基因功能研究，而且对利用异源基因的生物反应器均具有重要的利用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d，所述启动子具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供了含有所述PSDP_d启动子的表达载体。其中所述表达载体优选植物表达载体，更优选如图6所示结构的载体。

进一步地，本发明还提供上述表达载体的转化体，其中所述转化体为根癌农杆菌。

本发明的另一个目的是提供上述PSDP_d启动子在制备转基因植物中的应用。

本发明的另一个目的是提供上述表达载体在制备转基因植物中的应用，其中所述转基因植物为转基因棉花和番茄。

本发明的又一个目的是提供一种利用PSDP_d启动子制备转基因植物的方法，包括下述步骤：

(1)构建具有如SEQ ID No.1所示序列的启动子；

(2)将所述启动子可操作地***表达载体中，构建植物表达载体；

(3)将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(4)将所述转化体转化植物，获得转基因植物。

本发明的又一个目的是提供一种利用PSDP_d启动子制备转基因棉花的方法，包括下述步骤：

(1)构建具有如SEQ ID No.1所示序列的启动子；

(2)将所述启动子可操作地***表达载体中，构建植物表达载体；

(3)将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(4)将所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

本发明的种子和棉花纤维优势启动子序列，其至少含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列为根据棉花GhSDP基因序列设计引物，采用PCR方法，得到的长度为2822bp的PSDP_d启动子序列。序列中含有多种植物激素如赤霉素响应元件GARE(TCTGTTG 577-583)、生长素响应元件 TGA-box(TGACGTAA 1768-1775)，脱落酸响应元件ABRE(CACGTG 645-650)茉莉酸响应元件TGACG-motif(TGACG 1768-1772)和胚乳特异相关的 GCN4(TGTGTCA 1441-1447)特异表达元件，逆境胁迫反应如低温 LTR(CCGAAA 587-593)、伤害WUN(TCATTACGAA1777-1786)、压力TC-富集重复区(GTTTTCTTAC 813-822 587-596)等相关元件。该序列中还包含多个厌氧诱导元件ARE(TGGTTT 2226-2231、2299-2304、2397-2404、2482-2487)，与MYB转录因子结合位点有关的MBS(TAACTG 108-114)，细胞周期和昼夜节律相关的circadian(CAANNNNATC 626-632 752-758)，多个GATA-box、 CATA-box、AAGAA-motif等大量顺式调控元件及与TFII结合的核心序列 TATAA。通过在转基因番茄和转基因棉花中GUS组织化学染色检测，证实该启动子驱动GUS基因在转基因番茄种子以及陆地棉纤维细胞中优势表达。

本发明中，采用基因工程方法，将PSDP_d启动子***到适宜的表达载体中即可获得含有该启动子的植物表达载体。

本发明将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。具体的，采用电击法将含有PSDP_d启动子的植物表达载体转化到根癌农杆菌 LBA4404中获得转化体。

将本发明的PSDP_d启动子与报告基因构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化宿主获得含PSDP_d启动子的转化体，以及用所述转化体转化植物获得转基因植物。所述转基因植物优选为番茄或陆地棉。

本发明的有益效果：获得了棉花纤维和种子优势表达的启动子PSDP_d，该启动子在番茄中具有种子特异表达活性，在陆地棉中具有纤维和种子优势表达特性，为基因工程改良番茄、棉花种子和纤维以及种子作为生物反应器提供了新选择和有效的途径。

附图说明

图1表示GhSDP基因在陆地棉不同组织中的表达量(Relative Expression)；

以陆地棉根、幼茎、叶、子叶、下胚轴、花萼、花瓣、开花当天胚珠、开花后9d的胚珠和开花后9d的纤维中的cDNA为模板，经实时定量PCR扩增的结果；该基因在开花当天胚珠、开花后9d胚珠及纤维和叶中的表达量很低，在下胚轴、子叶、幼茎、花瓣及根中表达量较高较低，而在花萼中的表达最高。

图2表示GhSDP基因在陆地棉纤维不同发育时期的表达量(RelativeExpression)；

以开花当天胚珠、开花后5d、9d、13d、15d、17d、19d和21d的纤维中的 cDNA为模板，经实时定量PCR扩增，该基因在纤维整个发育过程中，中后期的表达高于前期，其中开花后15d达到最高，然后持续高表达。该基因的表达属于纤维中、后期优势表达基因。

图3表示PSDP_d启动子的核苷酸序列图；

该序列中含有多个顺式调控元件。

图4表示PSDP_d启动子克隆到pEASY-Blunt载体上的质粒图谱；

其中载体主要元件标示，pUC origin质粒复制起点；Ampicillin resistanceORF：氨苄青霉素抗性基因；Kanamycin resistance ORF：卡那霉素抗性基因；其余为限制性内切酶位点。

图5陆地棉PSDP_d启动子表达载体的构建流程图；

图6 PSDP_d启动子表达载体pBI101-PSDP_d的结构图；

图5和图6中载体主要元件标示，rep origin质粒复制起点；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；GUS：β-葡萄糖酸苷酶基因；NOS terminator：NOS基因终止子；NOS Promoter：NOS组成性启动子；LB、RB：T-DNA***左、右边界。

图7表示转PSDP_d∷GUS融合基因番茄的PCR验证结果；

DL2K为标准分子量DNA(Mark2000)，K-2～K-21为不同的转基因株系， CK^-为非转基因对照。结果显示K2、K8、K18、K9和K14为转基因阳性植株，其余株系为转基因阴性植株。

图8表示转PSDP_d∷GUS融合基因番茄中的GUS染色结果；

GUS基因在转基因番茄种子以及种皮毛中优势表达在茎、叶中不表达。其中，A：萌发后5天的幼苗；B：真叶；C：横切幼茎；D：横切花蕾；G：D中胚珠部分的放大；E：横切幼果期(IMG)的番茄果实；H：E中种子部分的放大图；F：横切绿熟期(MG)的番茄果实；I：F中种子部分的放大图；J：横切破色期(Br)的番茄果实；K：J中种子部分的放大图；L：横切成熟期(Ri)的番茄果实。

图9表示转PSDP_d∷GUS融合基因棉花的PCR验证结果；

DL2K为标准分子量DNA(Mark2000)，C1～C13为不同的转基因株系， CK^-为非转基因对照。结果显示C1、C2、C5和C11为转基因阳性植株，其余株系为转基因阴性植株。

图10表示转PSDP_d∷GUS融合基因陆地棉的GUS染色结果；

GUS基因在果柄、幼茎的表皮毛、开花前一天的花瓣、萼片以及在开花当天的胚珠、纤维发育四个不同时期的胚珠和纤维中均观察到GUS染色的蓝色信号，表明GUS基因在这些组织中有表达。但是在叶片中未发现有GUS基因的表达。从开花当天的棉花胚珠表面开始出现GUS的蓝色信号，特别在纤维发育的快速伸长期，次生壁合成期纤维特异细胞中有强烈的GUS阳性信号存在，表明该启动子在陆地棉中具有纤维中、后期优势表达特性。其中A：叶片；B：茎的横切；C：茎的放大；D：萼片；E：花瓣；F：果柄；G：开花当天棉铃的纵切；H：开花当天的胚珠；I：开花后5d棉铃横切；J：开花后10d的胚珠纤维； K：开花后15d棉铃横切；L：开花后25d棉铃横切；M：开花后40d棉铃横切； N：开花后45d棉铃横切。

图11表示转PSDP_d∷GUS融合基因陆地棉的GUS酶活检测结果；

检测转PSDP_d∷GUS融合基因陆地棉不同组织的GUS酶活性，结果可见转基因棉花花瓣、萼片、花蕊和果柄中，GUS酶活性较低在1.2～7.3nmol/mg/min 之间。检测开花当天到开花后40d的胚珠，GUS酶活同样很低在1.78～2.13 nmol/mg/min之间。检测开花后5d到开花后40d的纤维，其GUS酶活非常高在 73.00～412.1nmol/mg/min之间，可见该启动子主要在纤维发育的中后期优势表达。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定,任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

实施例1陆地棉各个组织RNA的提取及定量PCR分析

利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取棉花各个组织的 RNA。参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)说明书进行cDNA 一链的逆转录，用作定量RT-PCR分析模板。采用iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD)试剂分析目的基因的相对表达量。内标基因选择陆地棉的Ghhis3基因(AF024716)，引物为Ghhis1和Ghhis2分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9 所示；GhSDP基因定量PCR引物为GhSDP-RTup和GhSDP-RTdn分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s， 56℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。

利用Bio-Rad CFX 3.0软件，通过计算各材料中目的基因和内标的比值，可得目的基因在不同器官组织中的相对表达量。结果如图1所示，该基因在野生型陆地棉的叶片、胚珠(开花后0d和9d)、纤维(开花后9d)中表达较低，在花萼和下胚轴中的表达较高；进一步比较该基因在纤维发育的不同阶段的表达发现：在开花后15d以后的纤维中表达较高，表明该基因属于纤维发育中后期优势表达基因。

实施例2陆地棉PSDP_d启动子的克隆

采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取陆地棉冀棉14(该陆地棉品种由河北农业大学马峙英教授惠赠)的基因组DNA，用设计合成的该启动子的特异引物PSDP_d-up和PSDP_d-dn(SEQ ID NO.4和5)，以上述的DNA为模板，扩增该启动子序列。扩增体系如下： 10×PCR buffer for KOD Plus 5μL，25mmolMgSO₄ 5μL，2mmol/L dNTPs 2μL，引物PSDP_d-up(5μmol/L)2μL，引物PSDP_d-dn(5μmol/L)2μL，KODPlus聚合酶1U/μL，陆地棉DNA约60ng，双蒸水补足至50μL。扩增程序为：94℃，2min； 94℃，15sec，53℃，30sec，68℃，2min，35个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带，按照说明书的方法克隆至pEASY_Blunt平端载体上，阳性克隆寄至上海英俊公司测序验证，得到pEASY-PSDP_d载体(见图4)及 PSDP_d启动子序列如SEQ ID NO.1所示。利用分析软件(Plant CARE， http://intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/)，从植物启动子数据库中对该序列进行启动子调控元件分析，发现该序列中含有多种植物激素如赤霉素响应元件GARE(TCTGTTG 577-583)、生长素响应元件TGA-box(TGACGTAA 1768-1775)，脱落酸响应元件ABRE(CACGTG 645-650)茉莉酸响应元件 TGACG-motif(TGACG 1768-1772)和胚乳特异相关的GCN4(TGTGTCA 1441-1447)特异表达元件，逆境胁迫反应如低温LTR(CCGAAA 587-593)、伤害 WUN(TCATTACGAA 1777-1786)、压力TC-富集重复区(GTTTTCTTAC 813-822 587-596)等相关元件。该序列中还包含多个厌氧诱导元件ARE(TGGTTT 2226-2231、2299-2304、2397-2404、2482-2487)，与MYB转录因子结合位点有关的MBS(TAACTG 108-114)，细胞周期和昼夜节律相关的circadian (CAANNNNATC 626-632 752-758)，多个GATA-box、CATA-box、AAGAA-motif 等大量顺式调控元件及与TFII结合的核心序列TATAA(图3)。

实施例3DNA片段回收、表达载体构建并大肠杆菌转化

DNA的琼脂糖电泳结束后，在紫外灯下用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照试剂盒(Roche公司)的方法回收相应的DNA片段，构建到 pBI101上。载体构建的具体流程见图5，首先从该启动子的克隆载体 pEASY-PSDP_d中利用限制性内切酶SpeⅠ和EcoRV将启动子片段切出，然后克隆到表达载体pBI101的XbaⅠ和SmaⅠ位点中并置于GUS报告基因上游，从而构建pBI101-PSDP_d的正向表达载体(图6)。所有限制性内切酶均购自Roche公司,按照使用说明书操作。

回收的片段与载体片段的连接体系为:10×T4DNA连接缓冲液1μL，载体 DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL。其中，载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1︰3，16℃连接12h。之后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中。

实施例4农杆菌及番茄和棉花的遗传转化

用电击法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

按照OMEGA公司质粒提取试剂盒(D6943-01)说明书的步骤，提取 pBI101-PSDP_d植物表达载体质粒，参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，通过电激转化法将该质粒转入农杆菌LBA4404中。

番茄的遗传转化：利用农杆菌介导的子叶转化法(J.S.C.Van Roekel,B. Damm,L.S.Melchers,A.Hoekema Factors influencing transformation frequency of tomato(Lycopersicon esculentum)Plant Cell Rep.,12(1993),pp.644–647)，对番茄进行遗传转化，番茄材料为购自当地农贸市场的品种红丹。将获得的转基因番茄植株通过PCR扩增的方法进行筛选，采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取转基因番茄的DNA，然后将 PCR呈阳性的植株种植于温室中，常规管理。

陆地棉的遗传转化：采用农杆菌介导的方法对陆地棉冀棉14进行遗传转化 (Luoet al.，2007)，将获得的转基因棉花植株通过PCR扩增的方法进行筛选，采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取转基因棉花的DNA，然后进行PCR扩增鉴定，将阳性的幼苗置于清水中，22℃培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。

实施例5转基因植株的PCR验证

采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取转基因番茄和棉花的DNA。根据GUS报告基因的序列设计特异引物 GUS-1:AGCGTAATGCTCTACACCACG(SEQ ID NO.6)和GUS-2:GTAATGCG AGGTACGGTAGG(SEQ ID NO.7)用于特异PCR扩增。转基因植株DNA进行PCR体外扩增验证的条件：反应总体积为25μL，包括10×LA Taq buffer 2.5μL、每种dNTP 100μmol/L、1.5mmol/L MgCl₂、模板DNA 10ng、上下游引物各 400nmol/L、1单位LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)。

扩增条件：94℃变性4min，继以94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸 1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

扩增产物在含溴乙锭的1％琼脂糖凝胶上以5V/cm的电压电泳后,紫外灯下观察照像。

转基因番茄的PCR验证结果见图7，结果表明K2、K8、K18、K9和K14 为转基因阳性植株，其余株系为转基因阴性植株。

转基因棉花的PCR验证结果见图9，结果表明转基因株系均为阳性株系。

实施例6GUS的组织化学染色及观察

取新鲜的转基因番茄、陆地棉材料，切成小块后置1.5mL离心管中，加入GUS染色液(10mmol/LEDTA，100mmol/L磷酸钠缓冲液pH7.0，0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.1mol/L K₄[Fe(CN)₆],0.1％(V/V)Triton X-100,5mg/ml X-Glue)。将含有植物材料和GUS染液的离心管，放入37.0℃恒温温箱中，染色3h。最后倾去染色液，通过70％乙醇脱色后，观察照相。

转pBI101-PSDP_d基因番茄中的GUS染色结果见图8，结果显示GUS基因在转基因番茄种子以及种皮毛中优势表达在茎、叶中不表达。即该启动子具有番茄种子优势表达特异性。

转pBI101-PSDP_d基因陆地棉的GUS染色结果见图10，结果发现在果柄、幼茎的表皮毛、开花前一天的花瓣、萼片以及在开花当天的胚珠、纤维发育四个不同时期的胚珠和纤维中均观察到GUS染色的蓝色信号，表明GUS基因在这些组织中有表达。但是在叶片中未发现有GUS基因的表达。从开花当天的棉花胚珠表面开始出现GUS的蓝色信号，特别在纤维发育的快速伸长期，次生壁合成期纤维特异细胞中有强烈的GUS阳性信号存在，表明该启动子在陆地棉中具有纤维中、后期优势表达特性，在纤维细胞的基因工程改良中，可以用于驱动目的基因在纤维细胞发育的中后期表达，具有重要的应用价值。

实施例7转基因棉花中GUS的酶活检测

GUS基因编码β-葡萄糖苷酶，该酶是一种水解酶。以4-甲基伞形酮酰-β-D 葡萄糖醛酸苷(4-MUG)为底物，GUS催化其水解为4-甲基伞形酮(4-MU)及β-D 葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。

a、GUS粗酶液的提取

选择已开花的转基因棉花，于开花当天挂牌标记开花时间。取开花后0d、 5d、15d、25d、40d的胚珠以及开花后5d、15d、25d、40d的纤维样品。常规方法对萼片、花瓣、花蕊和果柄取样。将待测的植物样品置液氮中研磨成粉，加入2倍体积的GUS酶提取缓冲液制成匀浆，冰上放置1h。于13000rpm/min离心10min，收集上清夜，Bradford法测定GUS粗酶液中总蛋白的含量。

b、4-MU标准曲线的制作

首先，用少量的N,N-二甲基甲酰胺溶解4-MU固体，然后用双蒸水稀释成 1mmol/L的母液。其次，用反应终止液将4-MU母液稀释成100μmol/L、80μmol/L、 60μmol/L、40μmol/L和20μmol/L的高浓度梯度样品，以及10μmol/L、8μmol/L、 6μmol/L、4μmol/L和2μmol/L的低浓度梯度样品。在激发光360nm，发射光460nm 的条件下测定各样品的荧光强度，以反应终止液为空白对照，每种浓度样品各设置3个重复，通过计算平均值绘制标准曲线。

c、GUS酶活的荧光测定

于37℃水浴中预热反应缓冲液，同时在6个96微孔酶联板中，以180μl/ 孔加入反应终止液。在样品离心管中加入195μl预热的反应缓冲液和5μlGUS粗酶液，混匀，立即取出20μl加入到1号板中，此为反应0时的样品(荧光测定时以此为空白)，并严格记时。将反应板放入37℃水浴中进行酶反应20min时各取20μl反应液加入到2号板中。

样品荧光测定以1号板为空白，在酶标仪上以激发光360nm，发射光460nm 的条件下测定2号板各样品的荧光强度。根据得到的荧光强度值选择相应的标准曲线，由回归方程计算出2号板中4-MU含量。酶活力单位定义为：每分钟水解4-MUG生成1nmol 4-MU的酶量为一个单位。GUS基因的表达活性以每毫克总蛋白的酶活力表示，即4-MU nmol/mg/min。

对转基因棉花不同组织GUS酶活性的检测结果可知：花瓣、萼片、花蕊和果柄中，GUS酶活性较低在1.2～7.3nmol/mg/min之间。开花当天到开花后40d 胚珠的GUS酶活同样很低在1.78～2.13nmol/mg/min之间。但是开花后5d到开花后40d纤维的GUS酶活非常高在73.00～412.1nmol/mg/min之间，最高点在 15d到25d之间，再次证明该启动子主要在纤维发育的中后期优势表达。

上述实施例表明，本发明克隆的PSDP_d启动子核苷酸长度为2822bp，当该启动子与报告基因融合后，在番茄中能指导报告基因在种子及种皮毛中表达；在陆地棉中能指导报告基因在纤维细胞发育中后期优势表达。以上对本发明的详细描述并不限制本发明,本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (9)

1.一种分离自陆地棉的种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d，其特征在于，所述PSDP_d启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述PSDP_d启动子的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体。

4.如权利要求2所述的载体，其特征在于：所述的表达载体是将所述PSDP_d启动子的核苷酸片段克隆到表达载体pBI101的XbaⅠ和SmaⅠ位点中并置于GUS报告基因上游，从而构建pBI101-PSDP_d的正向表达载体。

5.权利要求1所述的PSDP_d启动子在制备转基因植物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为棉花或番茄。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于将所述PSDP_d启动子下游连接目的基因，构建植物表达载体，转化宿主植物。

8.一种利用有权利要求1所述PSDP_d启动子制备转基因植物的方法，包括下述步骤：

(1)构建具有如SEQ ID No.1所示序列的启动子；

(2)将所述启动子可操作地***表达载体中，构建植物表达载体；

(3)将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(4)将所述转化体转化植物，获得转基因植物。

9.一种利用权利要求1所述PSDP_d启动子制备转基因棉花的方法，包括下述步骤：

(1)构建具有如SEQ ID No.1所示序列的启动子；

(2)将所述启动子可操作地***表达载体中，构建植物表达载体；

(3)将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(4)将所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。