CN105602936A - 一种双barcode二代测序文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双barcode二代测序文库的构建方法：在DNA样本片段两侧接头靠近DNA样本待测序部分的位置上加入第二barcode序列，第一barcode序列位于测序引物中。本发明提出的双barcode测序文库构建方法，不需要改变现有单barcode文库的测序流程，可以与单barcode文库混入同一条lane中进行测序。测序结果自带第二条barcode，可以用于进一步确认read来源。同时，实验结果表明，该方法与以往的双barcode测序文库一样，可以大大降低混合样本捕获产物测序结果的低频异质性位点和假阳性位点，提高了相关研究结果的准确性。

Description

一种双barcode二代测序文库的构建方法

技术领域

本发明涉及二代测序文库构建及基因捕获，具体涉及一种双barcode(条码)二代测序文库的构建方法。

背景技术

传统桑格测序利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的不同颜色荧光标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过毛细管电泳分离大小不同的片段，观察不同大小片度的荧光标记来推断序列。

第二代测序技术主要采用边合成边测序的方法，首先利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。这些文库中的接头附着在固相表面，并在表面进行桥式PCR扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都在各自位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。测序反应过程中，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP(如同Sanger测序法)。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并由光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

自2005年诞生以来，第二代测序技术展示了广阔的应用前景。通过测序，科学家可以看到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。在进化领域，科学家通过群体多态性分析探索物种之间的进化模式；在微生物领域，DNA测序分型已被证明快捷而准确；而在医学领域，基因组重测序在发现SNP与重大疾病的关系方面有着重要的意义。

由于往往只对基因组特定区域(比如外显子组)而不是全基因组感兴趣，因此会利用基因捕获探针对特定的区域进行捕获，对捕获出的DNA序列进行测序。传统建库方法仅使用一个barcode区分样本，以往研究发现，当多个样本的测序文库混合在一起捕获时，样本间会发生交叉污染现象。当需要检测低频突变(MAF<10％)时，交叉污染会造成大量假阳性结果，严重干扰了真实低频异质性位点的检出。为尽可能降低样本间交叉污染的影响，现有技术中又提出了使用双barcode的建库方法，在建库过程中，引入两条独立的barcode用于区分样本，可以降低样本间交叉污染程度。

以往报道的双barcode文库构建方法中，第二条barcode需要单独测序，这就造成了双barcode文库与单barcode文库测序流程不兼容的问题，同一个run，要么全部测单barcode文库，要么全部测双barcode文库，严重影响了测序安排的灵活性。如果使用双barcode文库构建方法的单位没有自己的测序仪，而要第三方公司测序，那么测序安排将给第三方公司带来极大困扰，甚至无法安排解决。

发明内容

本发明的目的在于消除基因捕获测序过程中由于样本交叉污染造成的假阳性，并且与现有单barcode文库测序流程相兼容，提供一种双barcode二代测序文库的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

在DNA样本片段两侧接头靠近DNA样本待测序部分的位置上加入第二barcode序列，第一barcode序列仍位于文库扩增引物中。

所述构建方法具体包括以下步骤：

1)根据测序要求将DNA样本打断为片段；

2)将所述片段末端修复为平末端；

3)经过步骤2)后，利用DNA聚合酶在所述片段的两个互补单链的3`末端加上碱基A(即腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)；

4)经过步骤3)后，利用DNA连接酶在所述片段的两侧末端连接接头，第二barcode序列位于接头靠近所述片段两侧末端的位置上。

所述第一以及第二barcode序列的长度为6～8bp。

本发明的有益的效果体现在：

本发明提出的双barcode测序文库构建方法，不需要改变现有单barcode文库的测序流程，可以与单barcode文库混入同一条lane中进行测序。测序结果自带第二条barcode，可以用于进一步确认read来源。同时，实验结果表明，该方法与以往的双barcode测序文库一样，可以大大降低混合样本捕获产物测序结果的假阳性位点数量，提高了相关研究结果的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例中接头序列示意图；

图2为基于本发明的双barcode测序与传统单barcode测序异质性位点个数比较；

图3为基于本发明的双barcode测序样本中，两条barcode不一致reads的比例。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

(一)本发明所述双barcode二代测序文库的构建方法具有两大要点：

①通过增加一条barcode的方法，进一步确认read来源，基本消除样本交叉污染带来的假阳性位点；

②保持了与现有建库方法构建的文库测序流程的兼容性，不需要特别的测序流程，灵活方便。

(二)采用的方案

在传统单barcode文库构建方法的基础上，改造现有adapter(接头)：在现有adapter靠近DNAfragment(待测序部分)位置上，加入第二barcode序列。当对样本DNA进行测序时，第二条barcode会出现在read的5’端。改造后的adapter参见图1，图1中下划线部分为第二barcode位置(序列长度为6bp)，具体构建方法如下：

1)根据测序要求将DNA样本打断为片段；

2)将所述片段末端修复为平末端；

3)经过步骤2)后，利用DNA聚合酶在所述片段的两个互补单链的3`末端加上碱基A；

4)经过步骤3)后，利用DNA连接酶在所述片段的两侧末端连接上述接头(adapter)，图1中方框内的T与步骤3)加上的碱基A配对。

该方法虽然减少了read的有效读长(7bp)，然而就现有illumina测序读长(≥125bp)来说，这点损失微不足道，却带来了巨大的益处。

本发明比较了18个样本单barcode和双barcode测序结果。在单barcode测序样本中，检出大量低频异质性位点，显示存在样本间交叉污染现象；而在双barcode文库中，只有少数几个异质性位点，符合目前对线粒体DNA的认识(图2)。

通过分析双barcode文库中两条barcode匹配情况，确实发现大量reads的两条barcode匹配情况与预期不符，显示存在样本间交叉污染。通过双barcode比较方法，可以有效识别和去除由于样本间交叉污染产生的嵌合read(图3)。

Claims (3)

1.一种双barcode二代测序文库的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

在DNA样本片段两侧接头靠近DNA样本待测序部分的位置上加入第二barcode序列，第一barcode序列仍位于文库扩增引物中。

2.根据权利要求1所述一种双barcode二代测序文库的构建方法，其特征在于：所述构建方法具体包括以下步骤：

1)根据测序要求将DNA样本打断为片段；

2)将所述片段末端修复为平末端；

3)经过步骤2)后，利用DNA聚合酶在所述片段的两个互补单链的3`末端加上碱基A；

4)经过步骤3)后，利用DNA连接酶在所述片段的两侧末端连接接头，第二barcode序列位于接头靠近所述片段两侧末端的位置上。

3.根据权利要求1所述一种双barcode二代测序文库的构建方法，其特征在于：所述第一以及第二barcode序列的长度为6～8bp。