CN105596330B - 虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的应用和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的应用和药物，该虚拟筛选化合物为具有式I、式II、式III或式IV所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物。通过体外激酶活性验证，上述化合物对于VEGFR2、FGFR1、HER2、SRC或Braf激酶具有优异的抑制活性。可用于激酶介导的疾病的诊断和治疗。

Description

虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的应用和药物
技术领域
本发明涉及药物领域，更具体地，涉及一种虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的应用，以及以该虚拟筛选化合物作为活性组分的药物，该药物能够预防和/或治疗激酶介导的疾病。
背景技术
与人类重大疾病相关的药物靶标的发现及其药物的研发是靶向治疗研究中的重要环节。蛋白激酶(protein kinase，PK)是细胞内最大的蛋白家族之一，参与细胞生长、***和凋亡等多种生理过程。在真核细胞信号转导中蛋白激酶扮演重要的角色。蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP分子的γ磷酸基转移到底物蛋白特定的氨基酸残基上，使底物蛋白磷酸化。人类基因组内共含有518个蛋白激酶基因，约占真核生物基因的1.7％。蛋白激酶活性异常通常会引发包括癌症、糖尿病、炎症在内的许多重大疾病。超过400种人类疾病与蛋白激酶有直接或间接的关系。因此蛋白激酶己成为继G蛋白偶联受体之后的第二大药物治疗靶标。据统计，目前全世界药物在研或开发项目中约三分之一均与蛋白激酶相关。
蛋白激酶抑制剂(protein kinase inhibitor，PKI)可用于多种疾病的治疗，其中ATP-竞争性蛋白激酶抑制剂研究得最多，这类抑制剂已被研究和开发成为治疗多种复杂性疾病的新药。目前ATP-竞争性蛋白激酶抑制的研究主要集中在新骨架类型先导化合物的设计和发现，以及选择性抑制剂和多靶点抑制剂开发等方面。目前，计算机辅助药物设计(computer-aided drug design，CADD)作为药物研发中的重要技术和工具，被应用于蛋白激酶抑制剂的研究中，推动了这一研究领域的长足发展。定量构效关系、分子对接、药效团、同源模建和分子动力学模拟等多种分子模拟方法，以及量子化学等多种CADD方法均被应用于蛋白激酶抑制剂的设计和发现。
因此，通过运用计算机辅助的药物设计技术，对蛋白激酶结构与功能进行模拟研究，在充分了解靶标活性口袋三维结构的基础上，对小分子抑制剂提出合理的结构修饰，研发出高效专一的蛋白激酶抑制剂具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的新用途，以及提供一种药物。
具体地，本发明提供一种虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的应用，该虚拟筛选化合物为具有式I、式II、式III或式IV所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物；
其中，R1和R2不同，且为R4、R5和R6各自独立地为H、C1-C3的烷基、或芳基；R3和R7各自独立地为H、C1-C3的烷基、或共同形成饱和或不饱和的五元烃环或六元烃环；
优选地，式I中，R4、R5和R6各自独立地为H或C1-C3的烷基；或者，R4和R6之一为芳基，其余两个基团为H。
进一步优选地，式I所示的化合物为以下式V、式VI、式VII或式VIII所示的化合物；
本发明中所述虚拟筛选是从Molport(5*109)和Vitas-M(1.2*109)化合物库进行SVM筛选，筛选具有以下确定靶点的化合物：HER2、VEGFR2、FGFR1、B-raf或SRC。因此，本发明中所述激酶优选为HER2、VEGFR2、FGFR1、B-raf或SRC。
本发明还提供一种药物，该药物能够预防和/或治疗激酶介导的疾病，该药物的活性组分为具有式I、式II、式III或式IV所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物。所述具有式I、式II、式III或式IV所示结构的化合物的限定与上述相同，在此不再赘述。
本发明中，所述激酶介导的疾病选自以下疾病中的至少一种：心血管疾病、炎症、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌、膀胱癌和直肠癌。优选为乳腺癌、肝癌、肺癌和膀胱癌中的至少一种。
根据本发明，所述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图1为50μM ATP/ADP转化率标准曲线。
图2为FGFR1激酶滴定曲线(50μM ATP)。
具体实施方式
通过ADP-GloTM激酶实验进行体外激酶抑制剂实验，ADP-GloTM激酶实验原理：在激酶反应过程中形成的ADP能通过荧光检测，从而知道其激酶活性。首先，ADP-GloTM试剂会终止激酶反应，残留的ATP被废除。反应过程中产生的ADP随即被转化为ATP并且在Ultra-GloTM双荧光素酶存在的条件下显示荧光，通过荧光分光光度计即可检测。荧光信号代表激酶反应过程中产生的ADP浓度及其对应的激酶活性。
ADP-GloTM激酶实验由于能够检测化合物对大范围激酶的作用，同时还能检测高信号背景下低浓度的ADP，因此适用于体外激酶抑制剂实验。
实施例中所用的ADP-GloTM激酶购自Promega公司。
1、样品准备
冻干样品用一定体积的二甲基亚砜(DMSO)溶解，终浓度为10mmol/L，冰箱保存备用。
2、ATP转化ADP标准曲线制作
参照Promega的说明，检测各种激酶反应中的ATP浓度，用于制作各个激酶的标准曲线。这些曲线代表ATP/ADP的转化率，并且能直观显示ADP对应的浓度。因此，根据标准曲线，可以检测激酶反应过程中产生的ADP。ATP在各个激酶反应中的浓度分别为：10μM(HER2)和50μM(VEGFR2、FGFR1、B-raf和SRC)。10mM ATP和ADP母液加入一定体积的去离子水得到10×ATP(ADP)溶液。不同体积的10×ATP和10×ADP配成不同浓度的10×ATP-ADP混合液。表1表明配备100μL所需不同浓度的10×ATP-ADP混合液。5×反应缓冲液A，0.01M DTT(终浓度200μM)，4×辅助因子(参照特定激酶反应方案)和去离子水，配成4×激酶缓冲液。4×激酶缓冲液用去离子水进一步稀释成1×激酶缓冲液。10×ATP-ADP混合液用1×激酶缓冲液稀释成1×ATP-ADP混合液。将10μL显色液加到96孔板，每个ATP-ADP浓度两个复孔。荧光检测用Perkin ElmerMultimode Plate Reader检测。检测两个复孔平均荧光读数计算ATP/ADP平均转化率，得到相应的图表。图1是50μM时ATP/ADP转化率标准曲线。
表1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
10×ATP(μL) 0 20 40 60 80 90 95 96 97 98 99 100
10×ADP(μL) 100 80 60 40 20 10 5 4 3 2 1 0
3、激酶滴定和SB10检测
用检测最高数量激酶所需的ATP浓度来滴定激酶，所滴定的激酶用于化合物筛选和IC50测定。这就是激酶滴定曲线线性范围内产生荧光所需要的激酶浓度，并产生足够的信号/背景比(10-20)。10×ATP溶液用上述方法配制，4×激酶缓冲液D用4×激酶缓冲液加4％DMSO配制。4×激酶缓冲液D，10×ATP，1mg/mL底物按照1:1:2的比例配制底物混合液。激酶用1×激酶缓冲液D，2倍梯度稀释成不同浓度。4μL底物混合物和6μL激酶加入96孔板进行ADP-GloTM激酶实验。激酶缓冲液D作为空白孔，每个实验组两个复孔。根据激酶滴定读数与空白组比值，得到滴定对数曲线，图2是以FGFR1激酶为例的滴定曲线。
4、检测药物的激酶抑制活性
药物母液用1×激酶缓冲液稀释成各个浓度，取2μL加入96孔板，阴性对照和空白对照组加入2μL激酶缓冲液D。对照孔和不同浓度的给药组加入4μL激酶溶液分别加入各个浓度给药组和阴性对照组，4μL空白溶液加入空白对照组，最后所有孔都加入4μL ATP/底物混合液。ADP-GloTM激酶实验重复2-3次。
每个药物的酶活力计算方程：
抑制剂活力计算：
抑制活力(％)＝100％-酶活力(％)
药物抑制率≥50％或复孔数据不一致时重复实验，通过滴定实验绘制化合物剂量曲线和计算IC50。
表2显示这些化合物对VEGFR2、FGFR1、HER2、Braf和SRC各个激酶的抑制活性。其中，十字孢碱为对照组。
表2
由表2可见，所述药物对VEGFR2、FGFR1、HER2、Braf和SRC各个激酶的抑制活性均具有较好的抑制效果。比如，化合物k22f(式V)对VEGFR2、FGFR1、HER2、Braf和SRC的激酶抑制活性值分别为1.5μM、6.24μM、7.98μM、15.2μM和9.32μM。此结果说明化合物k22f是一种具有前景的多靶点VEGFR2、FGFR1、HER2、SRC、Braf激酶抑制剂。从表2中同样可以看出，化合物k23f(式VI)是一种VEGFR2抑制剂；化合物k24f(式VII)是一种VEGFR2抑制剂；化合物k26f(式VIII)是一种多靶点SRC、VEGFR2激酶抑制剂；化合物K30(式II)是一种多靶点SRC、HER2激酶抑制剂；k32g(式III)是一种多靶点SRC、HER2激酶抑制剂；k62(式IV)是一种多靶点SRC、VEGFR2、Braf激酶抑制剂。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。

Claims (1)

1.一种虚拟筛选化合物在制备激酶抑制剂中的应用，其特征在于，该虚拟筛选化合物为具有式V所示结构的化合物或其药学上可接受的盐；所述激酶为HER2、VEGFR2、FGFR1、B-raf或SRC；
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