CN105572352B - 一组结核潜伏感染诊断标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组结核潜伏感染诊断标志物及其用途,该组结核潜伏感染诊断标志物的序列对应SEQ:ID:NO:1‑SEQ:ID:NO:8。该技术检测结核分枝杆菌潜伏感染的新型生物标记物,从而尽早发现潜伏感染者,加强结核潜伏感染者的管理,最终达到控制结核病流行和传播的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及一组结核潜伏感染诊断标志物及其用途。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,被列为我国重大传染病之一。目前结核分枝杆菌感染人群基数大,发病率高,至今尚无有效的快速血清学诊断方法,给结核病防治工作带来了严峻挑战。因此,在结核病疫情控制面临严峻挑战的今天,筛选结核病新型生物标志候选物,寻求一种新的诊断技术、新药和新疫苗的开发已迫在眉睫。
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的严重危害人类健康的传染性疾病。人类对结核分枝杆菌普遍易感,据WHO统计全球有三分之一的人感染过结核分枝杆菌,每年约有200万患者死于结核病。但感染结核分枝杆菌的人群只有10%左右的人发展成为活动性结核病,绝大多数的人体内的细菌以一种潜伏感染的状态存在,人体的免疫机制使细菌处于生长抑制或停止状态,保护机体免于发病。对于那些没有临床表现的感染者,有相当数量的一部分人体内存在潜伏感染的结核分枝杆菌,即结核分枝杆菌感染后的一种亚临床状态,无临床症状、无细菌学依据、无放射检查征象、PPD皮试和/或T-Spot阳性。机体的免疫***能够控制结核分枝杆菌的复制而不表现出临床症状但又不能彻底清除感染的结核分枝杆菌。结核分枝杆菌在不利于其生长的情况下停止复制但保持活力,在机体免疫力低下等情况下能重新复制并导致临床症状。因此,寻找结核分枝杆菌潜伏感染的新型生物标记物对于早期发现潜伏感染者,采取相应措施使潜伏感染者不发病或在其发展为活动性结核病前期进行干预具有积极意义。
目前诊断结核潜伏感染常用的方法有:1.结核菌素皮肤试验:长期以来结核分枝杆菌潜伏感染的诊断依靠结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST),它是使用PPD和OT为主的结核菌素作为包被抗原进行皮内注射的诊断方法,此法简单易行,应用于结核病的诊断、筛查以及流行病学研究已超过100年,目前仍然作为发现潜伏感染者的主要检测手段,但其最大的缺点在于PPD及OT中的大多数蛋白质与其他分枝杆菌和无关细菌相同。因此,在卡介苗接种率和非结核分枝杆菌感染率较高的地区,TST方法的特异度较低。该方法以某数值为界来判断某人是否存在结核分枝杆菌潜伏感染。不同的界值可能会对个体的划分产生错误,影响方法的灵敏度和特异度。而且病人必须在注射后48~72h观察结果,可能导致门诊病人的失访。此外,急性感染性疾病、疫苗注射、免疫抑制剂的使用或免疫抑制性疾病、营养不良、结节病、肿瘤、其他难治性疾病和老年人等因素,可非特异性地影响试验结果而出现假阴性,影响诊断的准确性。2.干扰素-γ释放实验(GIRAs):鉴于TST检测方法的局限性,近年来发展的以T细胞为基础的干扰素-γ释放实验为诊断结核分枝杆菌的潜伏感染带来新的希望。该方法原理是:被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再遇到同类抗原时能产生干扰素-γ,产生高水平的干扰素-γ意味着结核分枝杆菌的感染。目前检测用抗原选自结核分枝杆菌基因组差异区1(RD1)基因编码的特异性蛋白,如早期分泌的抗原靶蛋白(ESAT6)和培养滤液蛋白10(CFP10),避免了与卡介苗和大多数非结核分枝杆菌抗原的交叉反应。GIRAs大大提高了反应的特异性。目前美国FDA已批准的QuantiFERON-TB和欧洲使用的T-SPOT-TB试验,都是以ESAT-6和CFP-10为抗原的GIRAs,可应用于结核杆菌感染,包括结核分枝潜伏感染和结核病的诊断。但是,IGRAs法具有费用高、需计数淋巴细胞等缺点,只能在具备相应条件的实验室进行。为了解决结核分枝杆菌潜伏感染的诊断和预防问题,许多学者努力从结核杆菌中分离和鉴定特异性抗原用作为结核分枝杆菌潜伏感染的筛查指标。经过国内外研究人员的大量研究,结核分枝杆菌感染的特异性抗原主要有免疫性蛋白MPT64;分泌性蛋白抗原:抗原85复合体抗原,即Ag 85A(也称P32、MPB44)、Ag 85B(也称a-Ag、MPB59)和Ag 85C,以及ESAT-6和CFP-10蛋白等;脂蛋白类抗原:38k Da,27k Da,16k Da抗原等;糖脂类抗原:脂***甘露聚糖抗原,结核菌糖类脂抗原等。所发现在这些抗原中,除分泌性蛋白ESAT-6和CFP-10蛋白已在T-SPOT-TB试验中用于诊断结核病潜伏感染之外,目前未查阅到关于结核分枝杆菌潜伏感染的生物标志的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷,提供一组结核潜伏感染诊断标志物及其用途,该技术检测结核分枝杆菌潜伏感染的新型生物标记物,从而尽早发现潜伏感染者,加强结核潜伏感染者的管理,最终达到控制结核病流行和传播的目的。
其具体技术方案为:
一组结核潜伏感染诊断标志物,包括抗Rv0494-IgG抗体、抗Rv3301c-IgM抗体、抗Rv1860-IgG抗体、抗Rv1821-IgG抗体、抗Rv0280-IgM抗体、抗Rv0351-IgM抗体、抗Rv2031c-IgG抗体和抗Rv1441c-IgM抗体,其序列对应SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:8。
本发明所述结核潜伏感染诊断标志物在筛选结核潜伏感染诊断产品中的用途。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明通过商品化MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片筛选结核分技杆菌潜伏感染诊断分子标志物,该芯片涵盖>95%的编码基因,包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白。临床血清样本包括正常对照组、潜伏感染组以及活动性结核病组,分别独立地与芯片反应,以检测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白,具有普遍性的特异性的抗结核抗体(IgG或IgM)。基于初筛结果,选择差异较为明显的94个结核分枝杆菌蛋白质及本研究团队既通过双向凝胶电泳技术分离获得的6个结核分枝杆菌差异表达蛋白质,自制含100个差异表达蛋白质小芯片,送公司点片,每个蛋白重复两点点制,进行200余份血清样本的临床验证,最终获得8个诊断结核潜伏感染的候选标志物(Rv0494-IgG,Rv3301c-IgM,Rv1860-IgG,Rv1821-IgG,Rv0280-IgM,Rv0351-IgM,Rv2031c-IgG和Rv1441c-IgM)。联合分析这8个蛋白质相应抗体的检测结果,判断被检人是否为结核分技杆菌潜伏感染,结果表明,本发明提供小芯片辅助诊断结核潜伏感染的最佳工作点的特异性为90.9%,灵敏度为83.1%,均高于现有技术中结核潜伏感染诊断的指标。
附图说明
图1为基于MtbProtTM蛋白质芯片的结核潜伏感染诊断标志物的发现与筛选流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一、血清诊断标志物的发现与验证
(一)基于MtbProtTM蛋白质芯片的结核病诊断标志物的发现与筛选:
1.检测原理:购买博翀生物公司MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片,该芯片包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白,涵盖>95%的编码基因。临床血清样本包括正常对照组、结核潜伏感染组、以及活动性结核病组,分别独立地与芯片反应,以检测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白,具有普遍性的特异性的抗结核抗体(IgG或IgM),这些抗原蛋白可以作为诊断标志物来表征疾病状态。
2.实验操作人:由芯片服务组生产人员执行操作。
3.流程图如图1所示。
4.实验操作步骤:
1)预封闭:使用芯片孵育盒(广州翀博公司自制),加入5ml封闭液,将待质控芯片从-80℃取出,正面朝上置于孵育盒中;再横向放在侧摆摇床(国产)上,50-60rpm,室温,10min。
2)封闭:倒弃封闭液,迅速加入5ml新的封闭液,侧摆摇床20-30rpm,室温1h。
3)血清样本孵育:倒弃封闭液,迅速加入预先准备好的蛋白样本孵育液3ml,侧摆摇床20-30rpm,室温3h。蛋白样本孵育液:3ml孵育液加入30μl血清(新鲜制备或冻存于-80度,由专利申请人提供)。
4)清洗:将芯片取出,置于加入有40ml清洗液的芯片清洗盒,剧烈晃动10-15次,并更换清洗液,再次剧烈晃动10-15次,充分去除游离一抗;再次更换清洗液,至于水平摇床上,60-70rpm,5min每次,清洗3次。
5)二抗孵育:倒弃清洗液,迅速加入预先准备好的二抗孵育液3ml,侧摆摇床20-30rpm,避光,室温45min。二抗孵育液:使用anti-human IgG荧光二抗(549anti-人IgG,激发光532nm,或635anti-人IgM,激发光635nm,Jackson ImmunoResearch),孵育液稀释抗体至其工作液浓度,总体积为3ml。二抗孵育时避光。
6)清洗:同步骤“4”。注意该过程应避光操作。
7)完成后用ddH20清洗5min x 2次,并冲洗10s。注意该过程应避光操作。
8)干燥。将芯片置于芯片干燥机(博奥生物,Slidewasher),离心干燥。
9)扫描。按照扫描仪(博奥生物,Luxscan 10K)操作规范和使用说明操作,设置参数为:532nm(或对应荧光波长),Power 100%,PMT value 500
10)数据提取:将对应GAL文件打开,将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐,按下自动对齐按钮,提取数据并保存LPR文件。
(二)基于自行设计(自制)蛋白质小芯片的结核潜伏感染诊断标志物的验证
基于第一步的初筛结果,选择差异较为明显的94个结核分枝杆菌蛋白质及本研究团队既通过双向凝胶电泳技术分离获得的6个差异表达蛋白质,第二步自行设计(自制)含100个差异表达蛋白质小芯片,送公司点片,每个蛋白重复两点点制,进行200余份血清样本的临床验证。
1.检测原理:特异性的抗体(包括IgG、IgM或其它类型抗体)与固定于芯片上的蛋白进行结合,清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质,再用抗人IgM荧光标记二抗(cy5标记,呈现红色)和抗人IgG荧光二抗(cy3标记,呈现绿色)检测,通过荧光扫描仪读取信号,信号的强弱与抗体的亲和力和数量呈正相关。
2.样品要求:患者血清,冻存于-80度(由专利申请人提供)。
3.准备以下溶液:
1)封闭液:1ml 10%BSAm,加入9ml 1x PBSml溶液,混匀。
2)孵育液:1x PBST 1x PBST1溶液。
3)清洗液:1x PBST。
4.操作步骤:
1)预封闭:使用芯片孵育盒,加入5ml封闭液,将芯片从-80℃取出,正面朝上置于孵育盒中;再横向放在侧摆摇床上,50-60rpm,室温,10min。
2)封闭:倒弃封闭液,迅速加入5ml新的封闭液,侧摆摇床20-30rpm,室温2h。
3)样本孵育:倒弃封闭液,分别使用1XPBS,0.2XPBS ddH 20q清洗1次,5min/次;然后离心干燥。将专用围栏安装加入样本:孵育液稀释然后离心干燥。将专用围栏安装加入样本:孵育液稀释然后离心干燥。将专用围栏安装加入样本:孵育液稀释1:200,并加入芯片200ul体积,侧摆摇床20-30rpm,4度过夜。
4)清洗:将芯片取出(注意不能触及或划破的上表面)摘除围栏,置于加入有40ml清洗液的芯片盒,剧烈晃动10-15次,并更换清洗液,再剧烈晃动10-15次,充分去除游离一抗;再次更换清洗液,至于水平摇床上充分去60-70,5min每次,清洗3次。
5)荧光标记IgG/IgM二抗孵育:倒弃清洗液,迅速加入预先准备好的二抗孵育液3ml(1∶1000稀释),侧摆摇床20-30rpm,避光,室温45min。注意需要避光。
6)清洗:同步骤“4”。注意该过程应避光操作。7)完成后用ddH 20清洗5min x 2次,并冲洗10s。注意该过程应避光操作。
8)干燥。将芯片置于芯片机,离心干燥。
9)扫描。按照扫描仪的操作规范和使用说明,设置参数为:635nm,Power 100%Power,PMTvalue 400;532nm,Power 100%,PMT value 400。
10)数据提取:将对应GALGAL文件打开,将芯片图像GAL文件每个阵列整体对齐,按下自动对齐按钮,提取数据并保存GPR文件。
二、数据分析与文献资料查阅
1.为了消除不同样品、不同芯片之间的***性差异带来的误差,需要对芯片数据进行归一化处理。归一化过程中,每个蛋白对应的两个点取平均值作为该蛋白响应的信号值。
2.数据分析:按结核病诊断意义,将样本组分为3组:正常对照组、结核潜伏感染组、以及活动性结核病组,进行统计分析以发现结核潜伏感染诊断性血清分子标志物。
3.首先较独立筛选出候选标志物:根据每个蛋白对每个样本的响应信号值,假设该蛋白在所对比的两组样本中具有显著性差异且在TB组样本中呈更强的响应(免疫响应较强),并计算其可信程度,以T test的P值来表征,当P value<0.05时,表示具有显著差异;同时计算两组样本的信号均值差异比,以fold change(fc,fc=log2(TB组/对照组))来表示,fc越大,表示响应程度越高;另外,对于候选标志物的组合,根据已知分组样本的响应值,基于SPSS统计分析软件,构建判别函数,并最终绘制ROC曲线,给出临床诊断评价指标:特异性和灵敏度。
4.进一步通过SPSS统计软件,优化出最优组合,并生成判别函数(DiscriminationFunction),参数具体为:采用步进式方法,以均值为描述参数,基于fisher函数系数的统计分析,从标志物优选出血清分子标志物。
5.针对结核分枝杆菌潜伏感染诊断的实际问题,从大量样本中,优先进行正常对照组、潜伏感染组以及活动性肺结核组进行诊断,最终获得8个标志物组合,分别为Rv0494-IgG,Rv3301c-IgM,Rv1860-IgG,Rv1821-IgG,Rv0280-IgM,Rv0351-IgM,Rv2031c-IgG和Rv1441c-IgM。这些标志物组合,可较为准确地区分对照组和活动性结核病组,可作为诊断结核分枝杆菌潜伏感染的候选标志物,诊断特异性为90.9%,灵敏度为83.1%。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一组结核潜伏感染诊断标志物,其特征在于,包括Rv0494-IgG、Rv3301c-IgM、Rv1860-IgG、Rv1821-IgG、Rv0280-IgM、Rv0351-IgM、Rv2031c-IgG和Rv1441c-IgM,Rv0494、Rv3301c、Rv1860、Rv1821、Rv0280、Rv0351、Rv2031c和Rv1441c的核苷酸序列对应SEQ:ID:NO:1- SEQ:ID:NO:8。
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