CN105567779B - 一种低分子量热凝胶的发酵方法 - Google Patents

一种低分子量热凝胶的发酵方法 Download PDF

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Abstract

一种高产低分子量热凝胶的发酵方法，属于微生物发酵技术领域。本发明将筛选得到的高产热凝胶菌株土壤杆菌ATCC 31749和热凝胶内切酶菌株哈茨木霉GIM 3.442分别培养，然后在高产热凝胶菌株产热凝胶的起始点，将二者按照一定比例混合，同时加入麸皮，通过过程优化实现发酵法生产高产低分子量的热凝胶。本发明以廉价的麸皮作为原料之一，在提高发酵法生产热凝胶产量的同时，降低了热凝胶的分子量，省去了复杂的热凝胶内切型分解酶的提取纯化过程，获得的低分子量热凝胶降低了以热凝胶为原料制备热凝胶寡糖的成本，同时为提高其他多糖的产量及降低其分子量提供了新的方法。

Description

一种低分子量热凝胶的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种低分子量热凝胶的发酵方法，具体涉及到土壤杆菌和产热凝胶内切酶的霉菌耦合发酵高产低分子量热凝胶的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
热凝胶是一种由葡萄糖残基通过β-D-1,3-葡萄糖苷键连接形成的水不溶性、无分支微生物胞外β-1,3-葡聚糖。土壤杆菌、根瘤菌和纤维菌素等多个属的细菌已经被发现具有合成热凝胶的能力，其中土壤杆菌ATCC 31749研究较多，可在氮源匮乏的条件下合成热凝胶。
热凝胶在生命科学、食品及医药等领域有着广泛的应用。但是热凝胶的水不溶性限制了其应用前景。随着分子量的降低，热凝胶的水溶性和生物活性均会逐渐增大。目前关于土壤杆菌ATCC 31749发酵法生产热凝胶的研究，主要集中在如何提高热凝胶产量方面，且未见关于以热凝胶的分子量为优化指标，对发酵参数进行优化的报道。
目前关于优化土壤杆菌ATCC 31749发酵法生产热凝胶的过程，主要包括对碳源、氮源、pH、溶氧及磷酸盐等方面，但是所有的报道中未能彻底解决热凝胶对土壤杆菌ATCC31749的包裹导致产量较低的问题。
目前降低热凝胶分子量过程和生产热凝胶是两个独立的过程。目前主要是以热凝胶产品为原料制备低分子量的热凝胶，且多以制备热凝胶寡糖为目的。已报道的制备低分子量热凝胶（包括热凝胶寡糖）主要有化学合成法、酸降解法、碱降解法及酶降解法。化学合成法以葡萄糖单体为原料，步骤繁琐，且多涉及到有毒试剂和有机试剂，产品分离困难且医用范围受到限制；酸降解法和碱降解法特异性低，降解效率不高，且容易引进其它的杂质；酶降解法虽然特异性高，但相应酶的获得较为困难，成本较高。上述这些方法虽然在制备低分子量热凝胶方面取得了一些成果，但这些方法都有待改进。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种成本较低的高产低分子量热凝胶的发酵方法。该方法以麸皮作为产热凝胶阶段的唯一氮源，将土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442耦合进行发酵，解除热凝胶对土壤杆菌ATCC 31749的包裹，提高热凝胶产量的同时，降低了热凝胶的分子量，简化了制备低分子量热凝胶的流程，降低了制备低分子量热凝胶的成本。
本发明的技术方案，一种高产低分子量热凝胶的发酵方法，将筛选得到的高产热凝胶菌株和热凝胶内切酶菌株分别培养，然后在高产热凝胶菌株产热凝胶的起始点，将二者按照一定比例混合，同时加入麸皮，通过过程优化实现发酵法生产高产低分子量的热凝胶；具体步骤为：
（1）从已报道的菌株中分别选择高产热凝胶菌株和热凝胶内切酶菌株；筛选得到理想的氮源；
（2）将产生热凝胶的高产热凝胶菌株划线接种于平板上，30℃培养2d，然后挑取单菌落接种于种子培养基中，进行14-18h的种子活化培养；产热凝胶内切酶的热凝胶内切酶菌株划线接种于平板上，30℃培养2d，然后挑取单菌落接种于种子培养基中，进行种子活化培养16-20h；将经过种子活化培养的高产热凝胶菌株及热凝胶内切酶菌株继续分别按照5%的接种量接种于各自的发酵培养基中，均分别发酵培养16-18h；整个发酵培养温度和转速均分别为25-32℃和180-220 rpm；
所述热凝胶内切酶菌株种子培养基，按g/L计如下：葡萄糖，15-25；酵母膏10-20；(NH4)2SO4，1.0-3.0；KH2PO4，4.0-8.0；MgSO4·7H2O，0.6-1.0；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述热凝胶内切酶菌株发酵培养基，按g/L计如下：茯苓多糖，10-30；麸皮，5-25；KH2PO4，2.5-7.5；MgSO4·7H2O, 0.25-0.75；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述高产热凝胶菌株种子培养基，按g/L计如下：葡萄糖，15-25；酵母膏8-15；KH2PO4，1.5-2.5；MgSO4·7H2O，0.03-0.1；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述高产热凝胶菌株发酵培养基，按g/L计如下：葡萄糖，60-100；酵母膏0.5-1.5；KH2PO4，2.0-4.0；(NH4)2SO4，1.0-3.0；MgSO4·7H2O，0.5-1.5；CaCO3，8-15；用纯净水配制；pH6.5-7.5；
（3）将已发酵培养16-18h的热凝胶内切酶菌株，按照高产热凝胶菌株:热凝胶内切酶菌株菌体干重比1:0.4-9.8加入到高产热凝胶菌株中进行耦合发酵，并加入麸皮10-30g/L，耦合发酵72-192h，整个发酵培养温度和转速均分别为25-32℃和180-220rpm，得到低分子量热凝胶。
优选的，步骤（1）中，选择的产热凝胶的菌株包括土壤杆菌属，根瘤菌属；选择的产热凝胶内切酶的菌株包括木霉属，毛霉属。
优选的，步骤（1）中，所述的获得理想氮源是麸皮，其成本较低且在为哈茨木霉GIM3.442产热凝胶内切酶提供氮源的同时，不影响土壤杆菌ATCC 31749产热凝胶。
优选的，步骤（3）中，所述的加入麸皮及已发酵培养16-18h的哈茨木霉GIM 3.442的时间是土壤杆菌ATCC 31749开始产热凝胶时。
步骤（3）中，当高产热凝胶菌株发酵培养16-18h后，将已发酵培养16-18h的热凝胶内切酶菌株按照高产热凝胶菌株:热凝胶内切酶菌株菌体干重比1:1.4-4.2进行耦合，并加入麸皮10-30g/L，耦合发酵至128-160h，耦合发酵过程的pH范围是6.5-8.0，得到低分子量热凝胶。
所述低分子量热凝胶的分子量为10-93kDa，产量为15-52g/L。
本发明的有益效果：本发明以廉价的麸皮作为原料之一，在提高发酵法生产热凝胶产量的同时，降低了热凝胶的分子量，省去了复杂的热凝胶内切型分解酶的提取纯化过程，获得的低分子量热凝胶降低了以热凝胶为原料制备热凝胶寡糖的成本，同时为提高其他多糖的产量及降低其分子量提供了新的方法。
本发明采用的菌株土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442均已公开。参考文件1、［“产胶期溶氧水平对土壤杆菌ATCC 31749发酵产热凝胶流变性质的影响”李晶，徐敏，朱莉，郑志永，詹晓北，食品与生物技术学报 2013年第32卷第12期］；参考文件2：［“两阶段pH 和搅拌控制策略提高哈茨木霉产β-1，3-葡聚糖内切酶”李珊，詹晓北，郑志永，朱莉，李晶，徐敏，食品与生物技术学报 2015年第34卷第1149页］。
附图说明
图1 高产低分子量热凝胶的发酵工艺流程。
具体实施方式
土壤杆菌ATCC 31749保存于江南大学糖化学与生物技术***重点实验室，哈茨木霉GIM 3.442购自广东菌种保藏中心；Silica gel 60 F254薄层层析板购自Merck KGaA；标准分子量葡聚糖和茯苓多糖购自Sigma公司，其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；Sigma 2K5S离心机购自Sigma公司，SHpH-6恒温摇床购自上海国强生物工程设备有限公司。
下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将保存的土壤杆菌ATCC 31749及哈茨木霉GIM 3.442划线接种于平板上，30℃分别培养2d及4d，然后挑取单菌落接种于种子培养基中，30℃、200 rpm分别培养16h及18h，最后按照5%接种量接种于发酵培养基中，均在30℃、200 rpm培养16h。
所述热凝胶内切酶菌株种子培养基，按g/L计如下：葡萄糖，15-25；酵母膏10-20；(NH4)2SO4，1.0-3.0；KH2PO4，4.0-8.0；MgSO4·7H2O，0.6-1.0；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述热凝胶内切酶菌株发酵培养基，按g/L计如下：茯苓多糖，10-30；麸皮，5-25；KH2PO4，2.5-7.5；MgSO4·7H2O, 0.25-0.75；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述高产热凝胶菌株种子培养基，按g/L计如下：葡萄糖，15-25；酵母膏8-15；KH2PO4，1.5-2.5；MgSO4·7H2O，0.03-0.1；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述高产热凝胶菌株发酵培养基，按g/L计如下：葡萄糖，60-100；酵母膏0.5-1.5；KH2PO4，2.0-4.0；(NH4)2SO4，1.0-3.0；MgSO4·7H2O，0.5-1.5；CaCO3，8-15；用纯净水配制；pH6.5-7.5；
按照土壤杆菌ATCC 31749及哈茨木霉GIM 3.442初始菌体干重比为1:2.8，将均已培养16h的土壤杆菌ATCC 31749及哈茨木霉GIM 3.442耦合，同时加入15g/L麸皮，在30℃、200 rpm、pH 5.6条件下发酵120h。
利用干重法测得热凝胶的产量为33.94g/L，利用HPLC法测得热凝胶的分子量为75.47kDa。
实施例2
使用的菌种、试剂及仪器同实施例1。
土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442的活化与耦合前的发酵培养同实施例1。
按照土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442初始菌体干重比为1:2.8，将均已培养16h的土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442耦合，同时加入20g/L麸皮，在30℃、200rpm、pH 7.0条件下发酵120h。
利用干重法测得热凝胶的产量为40.67g/L，利用HPLC法测得热凝胶的分子量为69.38 kDa。
实施例3
使用的菌种、试剂及仪器同实施例1。
土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442的活化与耦合前的发酵培养同实施例1。
按照土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442初始菌体干重比为1:2.8，将均已培养16h的土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442耦合，同时加入20g/L麸皮，在30℃、200 rpm、pH 7.5条件下发酵144h。
利用干重法测得热凝胶的产量为51.12g/L，利用HPLC法测得热凝胶的分子量为69.27 kDa。
实施例4
使用的菌种、试剂及仪器同实施例1。
土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442的活化与耦合前的发酵培养同实施例1。
按照土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442初始菌体干重比为1:9.8，将均已培养16 h的土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442耦合，同时加入20 g/L麸皮，在30℃、200 rpm、pH 5.6条件下发酵72h。
利用干重法测得热凝胶的产量为15.2g/L，利用HPLC法测得热凝胶的分子量为8.93kDa。
实施例5
使用的菌种、试剂及仪器同实施例1。
土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442的活化与耦合前的发酵培养同实施例1。
按照土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442初始菌体干重比为1:1.4，将已培养均16 h的土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442耦合，同时加入20 g/L麸皮，在30℃、200rpm、pH 5.6条件下发酵72 h。
利用干重法测得热凝胶的产量为30.58g/L，利用HPLC法测得热凝胶的分子量为90.01kDa。
实施例6
使用的菌种、试剂及仪器同实施例1。
土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442的活化与耦合前的发酵培养同实施例1。
按照土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442初始菌体干重比为1:2.8，将均已培养16h的土壤杆菌ATCC 31749和哈茨木霉GIM 3.442耦合，同时加入20g/L麸皮，在30℃、200rpm、pH7.0条件下发酵192h。利用干重法测得热凝胶的产量为50.66g/L，利用HPLC法测得热凝胶的分子量为10.20kDa。

Claims (4)

1.一种低分子量热凝胶的发酵方法，其特征是将筛选得到的产热凝胶菌株和热凝胶内切酶菌株分别培养，然后将二者按照一定比例混合，同时加入麸皮，通过过程优化实现发酵法生产分子量范围为8.93kDa～90.01 kDa的低分子量热凝胶；具体步骤为：
（1）从已报道的菌株中分别选择产热凝胶菌株土壤杆菌ATCC 31749和热凝胶内切酶菌株哈茨木霉GIM 3.442；筛选得到理想的氮源；
（2）将产热凝胶的菌株土壤杆菌ATCC 31749划线接种于平板上，30℃培养2d，然后挑取单菌落接种于种子培养基中，进行14-18h的种子活化培养；产热凝胶内切酶的菌株哈茨木霉GIM 3.442划线接种于平板上，30℃培养4d，然后挑取单菌落接种于种子培养基中，进行种子活化培养16-20h；将经过种子活化培养的产热凝胶菌株及热凝胶内切酶菌株继续分别按照5%的接种量接种于各自的发酵培养基中，均分别发酵培养16-18h；整个发酵培养温度和转速均分别为25-32℃和180-220 rpm；
（3）将已发酵培养16-18h的热凝胶内切酶菌株，按照产热凝胶菌株:热凝胶内切酶菌株菌体干重比1:1.4-1:9.8加入到产热凝胶菌株中进行耦合发酵，并加入麸皮10-30g/L，耦合发酵72-192h，得到8.93kDa～90.01 kDa的低分子量热凝胶；整个发酵培养温度和转速均分别为25-32℃和180-220 rpm。
2.根据权利要求1所述低分子量热凝胶的发酵方法，其特征是：步骤（1）所述氮源为麸皮。
3.根据权利要求1所述低分子量热凝胶的发酵方法，其特征是：步骤（2）中，
所述热凝胶内切酶菌株种子培养基，按g/L计如下：葡萄糖，15-25；酵母膏10-20；(NH4)2SO4，1.0-3.0；KH2PO4，4.0-8.0；MgSO4·7H2O，0.6-1.0；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述热凝胶内切酶菌株发酵培养基，按g/L计如下：茯苓多糖，10-30；麸皮，5-25；KH2PO4，2.5-7.5；MgSO4·7H2O, 0.25-0.75；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述产热凝胶菌株种子培养基，按g/L计如下：葡萄糖，15-25；酵母膏8-15；KH2PO4，1.5-2.5；MgSO4·7H2O，0.03-0.1；用纯净水配制；pH 6.5-7.5；
所述产热凝胶菌株发酵培养基，按g/L计如下：葡萄糖，60-100；酵母膏0.5-1.5；KH2PO4，2.0-4.0；(NH4)2SO4，1.0-3.0；MgSO4·7H2O，0.5-1.5；CaCO3，8-15；用纯净水配制；pH 6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述低分子量热凝胶的发酵方法，其特征是：步骤（3）中，当产热凝胶菌株发酵培养16-18h后，将已发酵培养16-18h的热凝胶内切酶菌株按照产热凝胶菌株:热凝胶内切酶菌株菌体干重比1:1.4-4.2进行耦合，并加入麸皮10-30g/L，耦合发酵至128-160h，耦合发酵过程的pH范围是6.5-8.0，得到低分子量热凝胶。
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