CN105560265B - 柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药领域,具体涉及柴胡多糖在制备防治糖尿病药物中的用途。所述柴胡多糖提取物经整体和离体实验证实,对小鼠糖尿病肾病有明显的防治作用。柴胡多糖可改善疾病动物体重,显著降低血糖和尿糖水平、明显促胰岛素分泌,降低血清肌酐水平,降低尿微量白蛋白分泌量,降低肾脏指数,改善肾脏病理症状,从而达到降血糖和肾保护的作用。柴胡多糖还可以逆转TGF‑β引起的肾小管细胞转分化。可用于制备防治糖尿病以及糖尿病引起的肾脏并发症药物。
Description
技术领域
本发明属中药领域,涉及中药柴胡多糖新的药用用途。具体涉及柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病的药物中的用途
背景技术
糖尿病是以高血糖为特征的,由于胰岛素绝对或相对分泌不足引发的一系列全身性代谢紊乱综合征。中国疾病预防控制中心2010年的统计结果显示,我国18岁及以上居民糖尿病患病率达9.65%,估计人数约为9690万人,我国已经成为世界上糖尿病人口最多的国家(康继宏,Tiao Guan等.转化医学研究,2012,2(3):1-24.)。随着我国城镇化的推进和人口老龄化的加剧,糖尿病患病率正迅速上升。糖尿病的危害主要是长期血糖过高导致的各种微血管并发症。而糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的主要并发症之一,目前l5%~25%的l型糖尿病及30%~40%的2型糖尿病患者均存在DN,DN已成为终末期肾病的首要病因。长期高血糖易破坏肾脏的滤过功能,初期表现为微量白蛋白尿,随着病程延长,尿蛋白增加,肾脏清除血中毒素的能力逐渐减退,最终发展为终末期肾病(ESRD),只能依靠血液透析或肾移植来维持生命。
目前,糖尿病肾病的发病机制尚未完全阐明,涉及多种机制。如何防治糖尿病肾病已成为当前医药界关注的焦点。目前糖尿病肾病的临床治疗主要采取对症治疗和联合用药,综合降血糖、降血脂及降血压等来治疗,一直缺乏专门用于这一疾病的药物,因而寻找更有效的治疗药物成为迫切的任务。
柴胡是一种我国常见的解表类中药,为双子叶植物伞形科柴胡属(Bupleurum)植物。柴胡始载于《神农本草经》,有解表退热、疏肝解郁、升举阳气的功效(中华人民共和国***药典委员会,中国药典,一部。北京:中国医药科技出版社,2010:263),具有抗炎、止痛、降温等功效,常作为复方治疗感冒、头痛、发热、流行性感冒、上呼吸道感染等。
动物实验研究表明,柴胡多糖可用于治疗炎症疾病(Navarro P,Giner RM等.LifeSci 68:1199-1206.)和自身免疫性疾病(Yi-wen Jiang,Hong Li等.Clinical andDevelopmental Immunology,2012)。
综观国内外的研究,均未见报道柴胡多糖防治糖尿病肾病的药效。
发明内容
本发明的目的是提供中药柴胡多糖新的药用用途;具体涉及柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病的药物中的用途
本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物。整体动物模型试验证实其具有较强的防治实验性糖尿病肾病的作用,离体实验证实其具有逆转TGF-β诱导的肾小管细胞转分化的作用。
本发明所述的中药柴胡包括北柴胡(Bupleurum chinense DC)和小叶黑柴胡(Bupleurum smithii var.parvifolium)。
本发明进行了动物实验,实验结果显示,柴胡多糖对糖尿病肾病有防治作用。动物实验结果证实,柴胡多糖可显著降低血糖和尿糖水平、明显促胰岛素分泌,降低血清肌酐水平,降低尿微量白蛋白分泌量,降低肾脏指数,改善肾脏病理损伤,表现出明显的降血糖和肾保护的作用;离体细胞实验结果也证实,柴胡多糖有直接明显的肾保护作用,在TGF-β诱导的肾小管细胞病变模型中,柴胡多糖逆转TGF-β诱导的肾小管细胞转分化。进一步,所述的柴胡多糖可用于制备防治糖尿病肾病的药物。
本发明的目的通过下述方法实现:
1.柴胡多糖用于防治糖尿病肾病试验:
1)体重测定
小鼠每两天称重一次,并更换垫料。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各组可改善糖尿病小鼠消瘦症状,增加动物体重,增强动物活动力。
2)肾脏指数测定
小鼠处死当天称重,为小鼠体重;小鼠处死后,取两侧肾脏,用滤纸吸干表面血液,称重,得左肾重和右肾重,取其平均数为肾脏重;器官指数=器官重量(g)/体重(g)*1000。结果显示:与模型组相比,柴胡多糖各剂量可降低肾脏指数,高剂量具有显著性差异(P<0.05)。
3)血糖测定
取小鼠血液,离心得血清。按照葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖水平。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各剂量可显著降低小鼠血糖水平(P<0.05)。
4)血清胰岛素含量测定
取小鼠血液,离心得血清。按照胰岛素ELISA试剂盒说明书测定胰岛素水平。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各剂量可增加胰岛素水平,改善胰岛素分泌,高剂量具有显著性差异(P<0.01)。
5)血清肌酐含量测定
取小鼠血液,离心得血清。按照肌酐试剂盒说明书测定肌酐含量。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各剂量可显著降低小鼠肌酐水平(P<0.01)。
6)尿糖含量测定
收集小鼠5h尿液样本,离心后,取上清,1:20稀释。尿糖按照葡萄糖氧化酶法测定。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各剂量可降低尿糖水平,高剂量具有显著性差异(P<0.01)。
7)尿微量白蛋白测定
收集小鼠5h尿液样本,离心后,取上清,1:10稀释。尿样按照微量白蛋白ELISA试剂盒说明书测定。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各剂量可降低尿微量白蛋白分泌量,高剂量具有显著性差异(P<0.01)。
8)肾脏病理
小鼠处死后,取左侧肾脏和胰腺,放入10%***固定,4μm石蜡切片,苏木精-伊红染色。结果显示,与模型组相比,柴胡多糖各剂量可明显减轻肾脏肥大,肾小球基质增生,肾小管空泡化等DN肾脏病理症状。
2.柴胡多糖用于TGF-β诱导的肾小管细胞转分化试验
当机体处于糖尿病肾病时,高糖诱导肾脏TGF-β(转化生长因子β)表达增高,进而引起肾小管细胞转分化成成纤维细胞,形成肾脏纤维化。在离体实验中,建立TGF-β诱导的肾小管细胞转分化模型,模拟体内糖尿病肾病环境。结果显示,正常肾小管上皮细胞形态呈椭圆形铺路石状或多边形;模型组肾小管上皮细胞失去固有形态,呈成纤维细胞样的长梭形;与模型组相比,柴胡多糖各剂量可明显逆转TGF-β诱导的细胞形态变化。
表1 糖尿病肾病小鼠体重及肾脏指数(X±SD)
表2 糖尿病肾病小鼠血清及尿液指标(X±SD)
其中,*与模型组比较P<0.05;**与模型组比较P<0.01;***与模型组比较P<0.001;
附图说明
图1糖尿病肾病小鼠体重变化结果。
图2糖尿病肾病小鼠肾脏指数结果。
图3糖尿病肾病小鼠血糖水平测定结果。
图4糖尿病肾病小鼠血清胰岛素含量测定结果。
图5糖尿病肾病小鼠血清肌酐水平测定结果。
图6糖尿病肾病小鼠尿糖水平测定结果。
图7糖尿病肾病小鼠尿微量白蛋白分泌量测定结果。
图8正常组小鼠肾脏HE染色图。
图9柴胡单给药组小鼠肾脏HE染色图。
图10模型组小鼠肾脏HE染色图。
图11 30mg/kg柴胡多糖给药组小鼠肾脏HE染色图。
图12 60mg/kg柴胡多糖给药组小鼠肾脏HE染色图。
图13 7.2mg/kg格列苯脲给药组小鼠肾脏HE染色图。
图14 TGF-β诱导的转分化实验-肾小管细胞形态变化图(苯胺蓝染色)。
具体实施方式
实施例1
取柴胡药材100g,以95%乙醇冷浸提取,药渣于室温下置通风处晾干,然后用热水提取3次,滤过,合并提取液,浓缩,离心,上清液以三氯醋酸去游离蛋白,离心,上清液用水透析3天,透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80%,离心,沉淀冷冻干燥即得总多糖,产物收率达3%以上,多糖含量超过65%。
所述的柴胡药材可选自北柴胡(Bupleurum chinense DC),或小叶黑柴胡(Bupleurum smithii var.parvifolium)。
实施例2
C57BL/6小鼠56只(8周龄),按体重随机分为6组(A、B、C、D、E、F组):A组为正常对照组,B组为柴胡多糖单给药组(正常小鼠给予柴胡多糖,给药剂量60mg·kg-1),C组为模型组,D组为模型组+柴胡多糖30mg·kg-1剂量组,E组为模型组+柴胡多糖60mg·kg-1剂量组,F组为模型组+格列苯脲阳性组(7.2mg·kg-1),每组8-12只不等。以造模前一天为Day-1,小鼠隔夜禁食15小时后,C、D、E、F组造模,以STZ(Streptozotocin,链脲佐菌素)100mg/kg的剂量,连续两天腹腔注射(0.1mL·10g-1)。A、B组小鼠注射等量生理盐水模拟造模步骤。造模后小鼠正常饲料喂养,72h内观察小鼠存活率。Day9上午8点割尾取血,用血糖仪测动物晨起血糖,选取血糖≥16.8mmol/L小鼠,作为糖尿病模型小鼠,按血糖随机分组,给药组开始每天一次灌胃给药,持续35天(Day9-Day44)。于Day37-38,利用小鼠代谢笼收集5小时尿样,800g离心15min,取上清,称重,-20℃冷冻、待测。尿样用于检测尿糖、尿微量白蛋白等指标。Day44小鼠摘眼球取血,血液800g离心10分钟后,收集,分装,-20℃保存、待测。血样用于检测血糖、血清胰岛素等指标。同时取出小鼠肾脏,于精密天平上称量,记录,计算器官指数,器官指数=器官重量(g)/体重(g)*1000。左肾用刀沿肾盂弯口切开,置于10%***溶液中保存,用于制备石蜡切片。右肾用锡纸包裹后置于-80℃冰箱中存放。
实施例3
肾小管细胞种板,贴壁过夜,饥饿24h后,将实验分为10组。分别为:Normal组(正常对照组);TGF-β组(模型组);SB组(单加TGF-β抑制剂);BPs20组(单加柴胡20μg/mL组);BPs40组(单加柴胡40μg/mL组);BPs80组(单加柴胡80μg/mL组);SB-TGF组;BPs20-TGF组;BPs40-TGF组;BPs80-TGF组。各组干预48h后,细胞用4%多聚甲醛固定,倒置显微镜下观察细胞形态,拍照。
动物实验研究结果表明,柴胡多糖可改善糖尿病模型动物体重,显著降低血糖和尿糖水平、明显改善胰岛素分泌,降低血清肌酐水平,降低尿微量白蛋白分泌量,降低肾脏指数。病理检查结果表明,模型组动物肾小球系膜细胞明显增多,系膜基质增生,肾小球截面积明显增大,大量肾小管上皮细胞空泡化,部分上皮细胞细胞核脱落。与模型组相比,柴胡多糖各剂量可明显减轻肾小球基质增生,肾小管空泡化的病理症状,延缓糖尿病肾病的进展。离体细胞实验研究表明,柴胡多糖可以逆转TGF-β引起的肾小管细胞转分化,提示可预防糖尿病引起的肾小管病变。动物实验和离体细胞实验共同提示柴胡多糖对小鼠糖尿病肾病具有降血糖和肾保护两方面的作用。
Claims (2)
1.柴胡多糖在制备治疗糖尿病药物中的用途;
所述的柴胡多糖通过下述方法制备:
取柴胡药材100g,以95%乙醇冷浸提取,药渣于室温下置通风处晾干,然后用热水提取3次,滤过,合并提取液,浓缩,离心,上清液以三氯醋酸去游离蛋白,离心,上清液用水透析3天,透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80%,离心,沉淀冷冻干燥即得总多糖,产物收率达3%以上,多糖含量超过65%;
所述的柴胡药材选自北柴胡(Bupleurum chinense DC),或小叶黑柴胡(Bupleurumsmithii var.parvifolium)。
2.柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病药物中的用途;
所述的柴胡多糖通过下述方法制备:
取柴胡药材100g,以95%乙醇冷浸提取,药渣于室温下置通风处晾干,然后用热水提取3次,滤过,合并提取液,浓缩,离心,上清液以三氯醋酸去游离蛋白,离心,上清液用水透析3天,透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80%,离心,沉淀冷冻干燥即得总多糖,产物收率达3%以上,多糖含量超过65%;
所述的柴胡药材选自北柴胡(Bupleurum chinense DC),或小叶黑柴胡(Bupleurumsmithii var.parvifolium)。
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"柴胡、黄芩组方合剂对糖尿病肾病大鼠尿蛋白、脂质代谢的影响";董晓蕾等;《中国临床康复》;20060420;第10卷(第15期);摘要 * |
"柴胡疏肝散加味治疗2型糖尿病80例";宋代波等;《实用中医药杂志》;20040630;第20卷(第6期);第298页左栏第1段和2治疗方法 * |
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