CN105548097B - 一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法，属分析化学领域。以喹哪啶衍生物(E)‑2‑(2,4‑二羟基苯基)乙烯基‑8‑羟基喹啉，简称探针，为活性细胞中检测pH的荧光成像探针。先用乙腈和缓冲溶液分别配制pH为2~4、10~12的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光倒置显微镜检测，分别呈现绿色荧光、红色荧光的细胞图像，随pH值的变化，细胞的荧光颜色和强度都发生变化；而探针在pH为5~9范围，则观察不到细胞的荧光图像。探针的化学结构式为：

Description

一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法

技术领域

本发明属分析化学领域，具体地说是一种利用荧光探针检测活性细胞中pH的方法。

背景技术

荧光探针与荧光显微技术的结合，使荧光探针在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用。对生物活性物质而言，检出的灵敏度极限是单个分子而对测试技术有更高的灵敏度要求，同时也有更苛刻的测试条件要求。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。活细胞成像技术是生命科学技术领域中重要的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。细胞生物学中量度细胞内的pH值、细胞的增殖和凋亡、细胞内吞作用、离子运输和动态平衡、多药抗药性，生物分析化学和医学健康血液中pH值等均与pH密切相关。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机荧光染料分子。在实际应用中，这些分子存在荧光寿命较短、容易猝灭及稳定性差的缺点。特别是大多数的质子化荧光探针的荧光随pH值的增大呈单一减弱变化，表现为酸性为“On”碱性为“Off”，极少数随pH值的增大呈单一增强变化，表现为酸性“Off”碱性“On”，很少有在能在强酸、强碱极端介质条件下实现细胞成像。已报道的有些类荧光探针荧光强度随pH变化会不同程度地受到共存于体系中的生物相关金属离子、阴离子及氨基酸、糖类等生物小分子的干扰。在极端pH下实现长时间的实时动态连续测定，提高细胞的可视化分析的选择性和精度是迫切需要解决的问题。具有良好的光稳定性、合适的水溶性及细胞膜通透性且对细胞无毒，而且能在不同酸、碱介质中能在细胞内发射不同波长强荧光的探针极为罕见。

发明内容

本发明的目的在于研究一种在极端pH值下对活性细胞成像的荧光探针新方法。是一种对pH高灵敏、高选择性检测识别的荧光探针，并能实现对活体细胞中氢离子的荧光染色和成像。

本发明一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是以喹哪啶衍生物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉，简称探针，作为极端pH值下的活性细胞荧光成像探针，其结构式为：

方法是：（1）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在2~4范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的绿色荧光减弱；（2）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在10~12范围的探针溶液，再将探针溶液与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的红色荧光增强；（3）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在5~9范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，荧光显微镜检测不到细胞的荧光图像；上述所指极端pH值是指pH2~4、pH10~12。

所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是用乙腈和缓冲溶液配制探针溶液的方法为：（1）用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷Tris和50mM的HCl溶液，用pH计调节，配成pH=2~9的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加Tris-HCl缓冲溶液900μL，配制成pH=2~9的不同pH值的探针溶液；（2）用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES和50mM的NaOH溶液，用pH计调节，配成pH=10~12的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加HEPES-NaOH缓冲溶液900μL，配制成pH=10~12的不同pH值的探针溶液。

所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是探针与活性细胞孵化的方法，是用人体***癌细胞PC3，经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基中，培养基改良型RPMI-1640，在温度为37℃，5%CO₂以及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞分别浸入含不同pH值的探针培养液中，在培养箱中孵育，使不同pH值的缓冲溶液配制的探针对细胞染色，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞，然后用荧光显微镜检测。

所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是探针与细胞的孵化过程中，控制探针的浓度在10~100μM范围，探针能很好渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆润饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，探针与细胞的孵化时间在20~30min内未见细胞凋亡，探针对细胞无毒性；荧光显微镜检测时，在pH为2~4的范围，用荧光显微镜的绿色通道，激发波长为450~490 nm检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像；在pH为10~12的范围，用荧光显微镜的红色通道，激发波长为510~550nm检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像；在pH为5~9的范围，用荧光显微镜的红色或绿色通道检测，不显现细胞图像。

所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活性PC3细胞为人体***癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是利用所述探针的荧光成像方法对活性细胞内pH检测：活性PC3细胞经复苏、接种、传代、培养、清洗后，将细胞分别浸入pH为3.6或pH为10.6的50mM缓冲溶液中，在37℃，5%CO₂以及饱和湿度为100%的培养箱中孵育5~10min，吸出含不同pH值的缓冲溶液，用新鲜培养基清洗细胞3次；用荧光显微镜检测；再将上述细胞浸入含10mM探针的培养液中孵化1h，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞3次，用荧光显微镜检测；经pH为3.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到绿色荧光细胞图像；经pH为10.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到红色荧光细胞图像。

本发明一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法的新颖性主要体现在（1）本发明在pH为 2~4及10~12的极端pH值范围进行活性癌细胞的荧光成像，有别于大多数探针的活细胞荧光成像只能在中性条件下进行，在强酸、强碱性下探针不发荧光，且细胞很难存活；（2）本发明在酸性和碱性条件下，探针对细胞的成像发射的荧光波长不同，可以分别在绿色通道和红色通道获得绿色、红色荧光的清晰细胞图像，可视性强、稳定性好；（3）本发明细胞成像时的荧光波长及强度均与pH有灵敏的响应性，可用于活细胞的定性、定量检测；（3）本发明所用探针对细胞有良好的膜穿透性，并且对细胞无毒。

附图说明

图1 探针在不同pH值下对活性PC3细胞的荧光显微镜拍摄照片。

A：在pH=2.0的Tris-HCl缓冲溶液中，探针（10 μM）对PC3细胞染色后的暗场荧光显微照片，用荧光显微镜的绿色通道（激发波长为450~490nm）检测，观测到亮绿色荧光的细胞分布图，证明探针在该pH值实现了细胞内染色，呈现细胞染色荧光成像。

B：在pH=4.0的Tris-HCl介质中，探针（10 μM）对PC3细胞染色后的暗场荧光显微照片，用荧光显微镜的绿色通道（激发波长为450~490nm）检测，观测到暗绿色荧光的细胞分布，证明探针在该pH值实现了细胞内染色，呈现细胞染色荧光成像。

C：在pH=2.0的Tris-HCl介质中，探针（浓度为10 μM）对PC3细胞染色后的眀场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

D：在pH=4.0的Tris-HCl介质中，探针（10 μM）对PC3细胞染色的眀场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

E：在pH=10.0的HEPES-NaOH介质中，探针（10 μM）对PC3细胞染色的暗场荧光显微照片，用荧光显微镜的红色通道（激发波长为510~550nm）检测，观测到暗红色荧光的细胞分布，证明探针在该pH值实现了细胞内染色，呈现细胞染色荧光成像。

F：在pH=11.4的HEPES-NaOH介质中，探针（10 μM）对PC3细胞染色的暗场荧光显微照片，用荧光显微镜的红色通道（激发波长为510~550nm）检测，观测到亮红色荧光的细胞分布，证明探针在该pH值实现了细胞内染色，呈现细胞染色荧光成像。

G：在pH=10.0 的HEPES-NaOH介质中，探针（浓度为10 μmol·L^-1）对PC3染色的眀场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

H：在pH=11.4的HEPES-NaOH介质中，探针（浓度为10 μmol·L^-1）对PC3细胞染色的眀场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

I：在pH=7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，探针（10 μM）对PC3细胞染色的暗场荧光显微照片，用荧光显微镜的红色和绿色通道检测，均显示无细胞荧光图像。

J：在pH=7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，探针（10 μM）对PC3细胞染色的眀场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

图2 探针的荧光成像方法对活性细胞内pH检测的荧光显微镜拍摄照片。

A：经pH为3.6的缓冲溶液孵化的细胞暗场显微照片，观察不到细胞的荧光图像。

B：经pH为3.6的缓冲溶液孵化的细胞，再经探针孵化后的暗场显微照片，用荧光显微镜的绿色通道检测，观测到绿色荧光的细胞分布图，证明探针对pH为3.6的活细胞实现了细胞内染色，呈现酸性介质细胞的特征绿色荧光图像。

C：经pH为3.6的缓冲溶液和探针孵化的细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

D：经pH为10.6的缓冲溶液孵化的细胞暗场显微照片，观察不到细胞的荧光图像。

E：经pH为10.6的缓冲溶液孵化的细胞，再经探针孵化后的暗场显微照片，用荧光显微镜的红色通道检测，观测到红色荧光的细胞分布图，证明探针对pH为10.6的活细胞实现了细胞内染色，呈现碱性介质细胞的特征红色荧光图像。

F：经pH为10.6的缓冲溶液和探针孵化的细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，探针在该pH值对PC3细胞毒性很小。

具体实施方式

实施例一：本发明中各溶液、试剂的配制方法。

（1）探针溶液的配制方法：称取探针2.8mg（分子式：C₁₇H₁₃NO₃分子量：279.09），用乙腈/水（v/v，1/20）溶解，配制成100mL溶液，浓度为100mM。

（2）不同pH值探针溶液的配制方法：称取探针2.8mg（分子式：C₁₇H₁₃NO₃分子量：279.09），用乙腈/水（v/v，1/20）溶解，分别用Tris-HCl和HEPES-NaOH（50mM）调节pH为2.0、4.0和10.0、11.4，配制成100mL溶液，浓度为100mM。

（3）Tris-HCl缓冲溶液：用浓度为50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris）和50 mM的HCl配制，调pH至所需；

（4）HEPES缓冲溶液：用浓度为50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5mM的NaOH配制，调pH至所需；

（5）75%的乙醇溶液：无水乙醇75mL加蒸馏水至100mL，混匀，室温保存备用。

（6）磷酸盐缓冲溶液（D-hanks平衡盐溶液）：0.4g KCl、0.06g KH₂PO₄、8.0g NaCl、1.0g葡萄糖、0.35g NaHCO₃、0.152g Na₂HPO₄·12H₂O、10万IU双抗，调整pH为7.2~7.4，去离子水定容至1000mL，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装备用。

（7）1万单位（IU）/mL双抗溶液：将青霉素钠（80万单位）溶于40mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将硫酸链霉素（160万单位）溶于80mL D-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的终浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

（8）0.25%胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

（9）0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）：将0.02g EDTA，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22mm进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

（10）培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL培养基（改良型RPMI-1640）以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2~8℃保存备用。

本发明所用荧光分光光度计型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；ThermoFisher 8000储水型CO₂细胞培养箱；IX-71型荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AR1530/C电子天平；25cm²细胞培养瓶，美国Corning公司立式压力蒸汽灭菌器（LS-B75）；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

实施例二：探针化合物的制备。

以8-羟基喹哪啶，2,4-二羟基苯甲醛为原料，分别以乙酸酐，吡啶/水为溶剂，首先合成中间体，再由中间体在吡啶/水的混合溶剂中水解得，合成路线如下：

三口烧瓶中，在溶有8-羟基喹哪啶的乙酸酐溶液中，加入2,4-二羟基苯甲醛，按摩尔比8-羟基喹哪啶:2,4-二羟基苯甲醛等于1:2，氮气保护下，回流，反应结束，浓缩除去溶剂乙酸酐，经硅胶柱层析洗脱，得到中间体。反应温度：139℃（回流），反应时间：5h，反应溶剂：乙酸酐，洗脱剂：体积比氯仿:乙酸乙酯（3:1）。

N₂保护下，三口烧瓶中加入中间体，吡啶为溶剂，加热回流反应，冷却，加入水使吡啶和水的体积比为3:1，继续回流，反应结束，加入水萃取，干燥，过滤，硅胶柱层析分离和洗脱，得探针化合物。反应温度：100℃，反应时间：12h，反应溶剂：吡啶:水（3:1），洗脱剂：体积比氯仿:甲醇（9:1）。

实施例三：活体PC3细胞的荧光显微成像。

（1）复苏细胞

从-80℃冰箱内取出PC3细胞，置于37℃的水中快速晃动细胞冻存管，于1-2分钟内完全解冻，在无菌操作台内，将其吸入离心管内，加约11ml培养液（含10%胎牛血清，1%双抗液）混均，并将此细胞悬液于1000r/min离心机上离心5min，去除上层清液，将底部沉淀的细胞加培养液轻吹打散混均转移到培养瓶内，使培养瓶中培养液体积在5-7mL内，并置入37℃，含5% CO₂的培养箱内进行培养。

（2）观察、传代、接板

每日更换一次培养液，并在显微镜下观察细胞生长情况，直至PC3细胞贴壁长满于整个培养瓶壁上，即可传代，在无菌操作台内倒掉旧培养液，加入1mL的EDTA液侵入细胞30s后倒掉，再加入1mL的胰蛋白酶液进行消化，在显微镜下观察直至细胞缩小变圆后，拍打培养瓶使细胞脱落并立即加入适量培养液阻止消化，将它一分为二培养于2个培养瓶中，待传代后的细胞贴壁铺满于整个培养瓶壁上时，与传代操作相同，加入EDTA和胰蛋白酶后使细胞消化脱落并立即加入3mL的培养液阻止消化，准备接种于12孔板内。在每个孔板内加入200mL的已阻止消化的细胞液，再加适量新培养液混均后将孔板置入37 ℃，含5% CO₂的培养箱内进行培养。

（3）细胞染色

次日观察孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁生成，弃去旧培养液，用新培养液洗涤2次，备用。

pH为2、4、7的浓度为100μM的探针溶液用乙腈和三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl缓冲溶液（v/v，1/9）配制；pH为10、11.4的浓度为100μM的探针溶液用乙腈和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）-NaOH缓冲溶液（v/v，1/9）配制；缓冲溶液的浓度为10~50mM；

孵化细胞所用的浓度为10 μM的探针溶液配制：取100μL上述不同pH值的100μM的探针溶液，分别用900μL培养液稀释，得到不同pH值的10 μM的探针溶液。

A组：往细胞培养孔板的4个孔内分别加入pH 2.0的10mM探针溶液，在37 ℃，含5%CO₂的培养箱内孵育30分钟后，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光显微镜下进行明场和暗场拍照，细胞呈现清晰明亮的绿色荧光图像。（附图1中A、C）

B组：往细胞培养孔板的4个孔内分别加入pH 4.0的10mM探针溶液，在37 ℃，含5%CO₂的培养箱内孵育30分钟后，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光显微镜下进行明场和暗场拍照，细胞呈现清晰的绿色荧光图像。（附图1中B、D）

C组：往细胞培养孔板的4个孔内分别加入pH 10.0的10mM探针溶液，在37 ℃，含5%CO₂的培养箱内孵育30分钟后，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光显微镜下进行明场和暗场拍照，细胞呈现清晰的红色荧光图像。（附图1中E、G）

D组：往细胞培养孔板的4个孔内分别加入pH 11.4的10mM探针溶液，在37 ℃，含5%CO₂的培养箱内孵育30分钟后，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光显微镜下进行明场和暗场拍照，细胞呈现清晰明亮的红色荧光图像。（附图1中F、H）

E组：往细胞培养孔板的4个孔内分别加入pH 7.0的10mM探针溶，在37 ℃，含5%CO₂的培养箱内孵育30分钟后，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光显微镜下进行明场和暗场拍照，细胞显示无荧光。（附图1中I、J）

实施例四：探针的荧光成像方法对活性细胞内pH检测。

活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗的培养基（改良型RPMI-1640）中，在温度为37℃，5% CO₂以及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次。将细胞分别浸入pH值为3.6或pH为10.6的50mM缓冲溶液中，在37℃，5%CO₂以及饱和湿度为100%的培养箱中孵育5~10min，吸出含不同pH值的缓冲溶液，用新鲜培养基清洗细胞3次。

（1） 经pH=3.6或pH=10.6的缓冲溶液孵化的细胞置于荧光显微镜下进行暗场拍照，荧光显微镜的绿色或红色通道均观察不到细胞的荧光图像（附图2中A、D）。

（2） 再将分别经过pH=3.6或pH=10.6的缓冲溶液孵化过的细胞浸入含10mM探针的培养液（10mM探针培养液配制：900mL的培养液+100mL用生理盐水配制的100mM探针储备液）中孵化1h，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞3次，置于荧光显微镜下进行拍照。的细胞照片如附图2中C、F。

（3）将经pH为3.6的缓冲溶液孵化过的细胞，再经探针孵化后，用荧光显微镜明场下观察的细胞照片（附图2中C）；绿色通道检测，观测到绿色荧光的细胞分布图（附图2中B），证明探针对pH为3.6的活细胞实现了细胞内染色，呈现酸性介质细胞的特征绿色荧光图像。

（4）将经pH为10.6的缓冲溶液孵化过的细胞，再经探针孵化后，用荧光显微镜明场下观察的细胞照片（附图2中F）；用荧光显微镜的红色通道检测，观测到红色荧光的细胞分布图（附图2中E），证明探针对pH为10.6的活细胞实现了细胞内染色，呈现碱性介质细胞的特征红色荧光图像。

Claims (6)

1.一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是以喹哪啶衍生物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉，简称探针，作为极端pH值下的活性细胞荧光成像探针，其结构式为：

方法是：(1)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在2～4范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的绿色荧光减弱；(2)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在10～12范围的探针溶液，再将探针溶液与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的红色荧光增强；(3)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在5～9范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，荧光显微镜检测不到细胞的荧光图像；上述所指极端pH值是指pH2～4、pH10～12。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是用乙腈和缓冲溶液配制探针溶液的方法为：(1)用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷和50mM的HCl溶液，用pH计调节，配成pH＝2～9的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加三羟甲基氨基甲烷HCl缓冲溶液900μL，配制成pH＝2～9的不同pH值的探针溶液；(2)用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和50mM的NaOH溶液，用pH计调节，配成pH＝10～12的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加4-羟乙基哌嗪乙磺酸NaOH缓冲溶液900μL，配制成pH＝10～12的不同pH值的探针溶液。

3.根据权利要求1所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是探针与活性细胞孵化的方法，是用人体***癌细胞PC3，经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗的培养基中，培养基为改良型RPMI-1640，在温度为37℃，5％CO₂以及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞分别浸入含不同pH值的探针培养液中，在培养箱中孵育，使不同pH值的缓冲溶液配制的探针对细胞染色，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞，然后用荧光显微镜检测。

4.根据权利要求1所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是探针与细胞的孵化过程中，控制探针的浓度在10～100μM范围，探针能很好渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆润饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，探针与细胞的孵化时间在20～30min内未见细胞凋亡，探针对细胞无毒性；荧光显微镜检测时，在pH为2～4的范围，用荧光显微镜的绿色通道，激发波长为450～490nm检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像；在pH为10～12的范围，用荧光显微镜的红色通道，激发波长为510～550nm检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像；在pH为5～9的范围，用荧光显微镜的红色或绿色通道检测，不显现细胞图像。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活性PC3细胞为人体***癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是利用所述探针的荧光成像方法对活性细胞内pH检测：活性PC3细胞经复苏、传代、接种、培养、清洗后，将细胞分别浸入pH为3.6或pH为10.6的50mM缓冲溶液中，在37℃，5％CO₂以及饱和湿度为100％的培养箱中孵育5～10min，吸出含不同pH值的缓冲溶液，用新鲜培养基清洗细胞3次；用荧光显微镜检测；再将上述细胞浸入含10μM探针的培养液中孵化1h，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞3次，用荧光显微镜检测；经pH为3.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到绿色荧光细胞图像；经pH为10.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到红色荧光细胞图像。