CN105543362A - 一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法及分子育种方法 - Google Patents
一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法及分子育种方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，以包含PPARβ基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PPARβ基因，然后用限制性内切酶PvuⅡ消化PCR扩增产物，接着对酶切后的片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后根据电泳结果鉴定黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性。本发明还涉及利用PPARβ基因单核苷酸多态性进行黄牛分子育种指标体系的构建方法。由于PPARβ基因具有重要生物学功能，该基因单核苷酸多态性对黄牛早期体重、体高、坐骨端宽有显著影响，可用于黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因单核苷酸多态性的检测方法及分子育种方法，具体涉及一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法及分子育种方法。
背景技术
单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上的特定位点由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。SNP所表现出的多态性是由单个碱基发生转换或颠换所引起，在基因组DNA中，任何碱基均有发生变异的可能。因此，SNP既有可能存在于基因序列内，也有可能位于非编码序列上。SNP在富含CG的序列上出现的频率最高，而且多是胞嘧啶C转换为胸腺嘧啶T，原因是CG中的C在发生甲基化后会自发地脱氨成为胸腺嘧啶。
SNP作为第三代分子遗传标记，具有以下特征：(1)密度大。SNP是基因组DNA中普遍存在且频率最高的遗传标记。已有研究表明，SNP出现的频率在1/1000～10/1000之间，人类30亿个碱基中共有300万以上的SNPs，其密度高于微卫星DNA标记。(2)易实现自动化分析。组成DNA的碱基有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，因此，SNP标记为双等位标记，在检测时表现为非此即彼，在基因组筛选时不用分析片段的长度，往往只需+/-的分析，这就利于实现自动化技术筛选与检测SNPs。(3)用途广泛。SNP作为分子遗传标记的一种，在动物遗传育种中具有广泛的功能。主要用于遗传作图、疾病检测、位点标识、进化分析等研究。
目前，检测SNP的方法可以分为两大类：一类是基于凝胶电泳的传统方法，主要包括PCR-SSCP与DNA测序结合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、变性梯度凝胶电泳等。其中，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，只适合长度小于500bp的小DNA片段，如果DNA片段太长，DNA单链很难形成稳定发夹结构，且实验过程中存在假阴性问题，因此也并非理想的SNP检测手段。AS-PCR方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，但由于特异性引物的稳定性差，对扩增条件要求比较严格，操作比较繁琐，因此不适于高通量SNP的检测。变性梯度凝胶电泳也只能对突变进行较为粗略地检测，不能确定突变位置和类型。PCR-RFLP由于位点特异性高、操作较简单和成本较低等，因此，被广泛运用于植物基因分型、基因定位、分子鉴定等方面的研究。另一类是利用高通量、自动化程度较高的检测方法。高通量的检测方法包括直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱等。其中，直接测序是检测SNP最直接可靠的方法，DNA芯片可对SNP进行大规模的筛查，但是二者的检测费用都是极其昂贵；而变性高效液相色谱方法对于试剂和环境要求较高，不能检测出纯合突变，因此也不是检测SNP的首选方法。综上所述，利用PCR-RFLP法可能是当前检测SNP最理想的遗传标记方法。
黄牛是我国主要的畜种资源之一，但是现在面临着优秀黄牛品种种源不足和种群遗传品质较差的压力。传统的育种方法基于测定动物的表现型和利用其亲代、祖代及其它亲属在动物模型中的遗传信息实现遗传评估，一般情况下，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，因此认为每个基因对性状有相对较小的贡献，结果导致对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，随着基因组学新方法和新技术的不断涌现，通过对各项技术进行整合，已可从基因即分子水平上进行设计来重构畜禽新品种。基于DNA遗传标记的产生和应用，开创了分子育种的新领域，为动物育种和改良提供了新的技术支撑，给动物遗传育种带来了美好的前景。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PeroxisomeProliferatorActivatedReceptor，PPAR)属于类固醇/甲状腺/维甲酸受体超家族，对于胰岛素敏感性、体内的糖平衡以及脂肪分化和生成方面具有重要调节作用，是目前研究的热点。该家族可分为三个成员，PPARα、β和γ，PPARβ在动物体内广泛存在，在脂质代谢活跃的组织如心脏、脂肪细胞、骨骼肌等组织中高度表达。目前，有大量的研究证明PPARβ在脂肪细胞的分化和脂肪酸的代谢中发挥重要作用，而PPARβ基因的研究绝大多数是在人和小鼠等模型动物上进行，在牛上却鲜有报道。中国地方黄牛PPARβ基因遗传变异的研究目前尚无文献报道。因此，亟需开发一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的简单、快速、低成本、精确的检测方法，再将PPARβ基因的SNP及其遗传变异与黄牛生长性状指标(如：体重、日增重、体高、坐骨端宽、胸围等)的关联进行研究，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而快速建立遗传资源优良的黄牛品种提供理论基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的简单、快速、低成本、精确的检测方法及分子育种方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种检测黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的方法，以包含PPARβ基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(包含P1和P2)为引物，PCR扩增黄牛PPARβ基因；然后用限制性内切酶PvuⅡ消化PCR扩增产物，接着对酶切后的扩增片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性；其中，所述引物对P为：
上游引物P1：5'-TCCTTCCAGCAGCTACACAGCT-3'22bp,见SEQIDNO:1；
下游引物P2：5'-GGGAGACAACTCGCCCAAGA-3'20bp，见SEQIDNO:2。
注：引物中的“_”表示为了形成酶切位点引入的错配碱基。
进一步，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；94℃变性30～50s，63℃退火30s，72℃延伸30～50s，30～40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
进一步，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为12％聚丙烯酰胺凝胶。
进一步，所述黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性为：AG(杂合型)基因型表现为167bp、147bp、28bp和20bp四条带；GG(突变型)基因型表现为147bp、28bp和20bp三条带；无AA(正常型)基因型。
本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种基于黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的分子育种方法，包括以下步骤：
(1)根据权利要求1～4所述的黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，确定黄牛PPARβ基因第71616位单核苷酸多态性的基因型；
(2)通过黄牛PPARβ基因第71616位单核苷酸多态性的基因型与黄牛生长性状进行关联分析，确定黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性能够作为提高黄牛早期生长性状的分子标记，用于黄牛的分子育种；
(3)黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性中GG基因型可作为提高黄牛早期生长性状的候选分子遗传标记。
本发明根据已公布牛PPARβ基因(NCBI:AC_000180.1)的序列设计引物，分别以5个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛PPARβ基因的部分序列与NCBI公布的序列进行对比，发现在PPARβ基因的第71616位存在SNP多态性。针对PPARβ基因SNP多态性，本发明进行PCR扩增后，用特定的限制性内切酶进行酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。PCR扩增PPARβ基因产物时，该突变没有自然酶切位点，需在引物上引入一个错配碱基使其在突变位点处形成PvuⅡ的酶切位点CAGCTG。PCR扩增片段大小为195bp，除SNP位点外还存在另一个PvuⅡ的酶切位点。因此，在切割过程中即使是正常的基因型也会被切割成两条带167bp与28bp。当第71616位发生A>G突变时，PCR扩增PPARβ基因的第71611bp～71616bp为CAGCTG时，则会被PvuⅡ酶识别；当第71616位不发生A>G突变，PCR扩增PPARβ基因的第71611bp～71616bp为CAGCTA时，则不会被PvuⅡ酶识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。
本发明通过PPARβ基因SNP的检测方法，确定黄牛PPARβ基因第71616位单核苷酸多态性的基因型；进而与黄牛部分生长性状(体高、体重和体斜长等)进行关联分析，确定该位点能够作为提高黄牛早期生长性状的分子标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
附图说明
图1为黄牛PPARβ基因包含第71616位的多态位点的195bpPCR产物电泳检测图，其中，泳道1—5为PPARβ基因包含第71616位的多态位点的195bp片段的琼脂糖电泳检测图；泳道M为MarkerDL1000(1000bp,700bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)。
图2(a)为PvuⅡPCR-RFLP方法检测黄牛PPARβ基因第71616位SNP酶切电泳图，其中，泳道1：M道：DL500(500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp)；泳道2-4：AG基因型个体(167bp，147bp，28bp，20bp)；泳道5：GG基因型个体(147bp，28bp，20bp)；无AA基因型个体。(b)为黄牛PPARβ基因第71616位点AG和GG基因型个体的反向测序图。
图3为PvuⅡPCR-RFLP方法检测黄牛PPARβ基因第二内含子SNP(AC_000180.1_g.71616A>G)序列分析图(其中，带框分别表示上下游引物序列，单个字母加蓝色背景的位点表示SNP位点)。
图4为PPARβ基因第71594bp～71788bp的195bp的基因片段图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步加以说明。
1、生化试剂与生物学试剂：GoldenDNA聚合酶(购自北京天根生化科技有限公司)；2×ReactionMix内含Mg2+、dNTPs等(购自北京天根生化科技有限公司Mix)；限制性内切酶PvuⅡ(购自TAKARA公司)；蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；Marker(DL500、DL1000)，购自大连宝生物工程有限公司。
2、普通试剂：从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
3、溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制，高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)，25min；试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。
(1)样品采集所用溶液
抗凝剂ACD：柠檬酸2.4g；柠檬酸三钠6.6g；葡萄糖7.35g，定容至50mLddH2O中，高压灭菌。每10mL新鲜血液中加入0.2mL的ACD液。这一抗凝剂优于肝素，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-80℃长期保存。
(2)血样基因组DNA分离所用溶液
①PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌。
②10％SDS：10gSDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL。
③0.5mol/LEDTA：EDTA186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。
④1mol/LTris·Cl：121.14gTris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存。
⑤5mol/LNaCl：NaCl292.2g溶于1000mL超纯水中。
⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mmol/LEDTA40mL，1mmol/LTris·Cl10mL。
⑦5mmol/LNaCl4mL，10％SDS10mL定容至100mL。实际浓度为200mmol/LEDTA，pH8.0：100mmol/LTris·HCl，pH8.0，200mmol/LNaCl，2％SDS。RNase20μg/mL。
⑧NaAc缓冲液：NaAc·3H2O20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL。
⑨TE缓冲液：Tris·Cl缓冲液(pH8.0)10mmol/L，EDTA缓冲液(pH8.0)0.1mmol/L，高压灭菌，4℃保存。
⑩蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所用溶液
①1×TBE缓冲液：取10×TBE100mL，定容至1000mL。
②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。
实施例1：黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法
一、黄牛PPARβ基因PCR引物的设计
以NCBI所公布的牛PPARβ(AC_000180.1)序列为参考，PPARβ基因第71594bp～71788bp的195bp的基因片段见图4及SEQIDNO:5。利用Primer5.0设计能够扩增包含黄牛PPARβ基因第71616位区域的PCR引物，其引物序列如下：
P3(上游引物)：5'-TCCTGTCTTCCCTTTCGTCC-3'20bp，见SEQIDNO:3；
P4(下游引物)：5'-GGAGACAACTCGCCCAAGAT-3'20bp，见SEQIDNO:4；
采用P3和P4引物对黄牛基因组进行PCR扩增，能够扩增包含黄牛PPARβ基因(AC_000180.1序列)第71616位在内的427bp的基因片段，对扩增的片段进行测序鉴定后，经过分析，发现PPARβ基因第71616位存在SNP多态性。
由于在该处突变位置无自然酶切位点，故需要重新设计酶切引物，在引物上引入一个错配碱基，使其在突变位置可形成限制性内切酶PvuⅡ的酶切位点。重新设计的引物对P序列如下：
P1(上游引物)：5'-TCCTTCCAGCAGCTACACAGCT-3'22bp
P2(下游引物)：5'-GGGAGACAACTCGCCCAAGA-3'20bp
注：引物中的“_”表示为了形成酶切位点引入的错配碱基。
PCR扩增PPARβ基因产物时，该突变没有自然酶切位点，需在引物上引入一个错配碱基使其在突变位点处形成PvuⅡ的酶切位点CAGCTG。PCR扩增片段大小为195bp，除SNP位点外还存在另一个PvuⅡ的酶切位点。因此，在切割过程中即使是正常的基因型也会被切割成两条带167bp与28bp。当第71616位发生A>G突变时，PCR扩增PPARβ基因的第71611bp～71616bp为CAGCTG时，则会被PvuⅡ酶识别。当第71616位不发生A>G突变，PCR扩增PPARβ基因的第71611bp～71616bp为CAGCTA时，则不会被PvuⅡ酶识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。
二、以引物对P进行PCR扩增待测黄牛PPARβ基因片段
1、黄牛样本的采集：以5个牛品种共计454个个体作为检测对象，具体采集样本见表1：陕西秦川牛(QC,30头)，河南平顶山市郏县红牛(JX,141头)，河南南阳牛(NY,139头)，山东省鲁西牛(LX，114头)，山东省渤海黑牛(BH，30头)。
表1-黄牛样本的采集
2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化
(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；
(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；
(3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；
(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；
(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
(6)加氯仿、异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
(7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；
(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
(9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；
(10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测其质量，-80℃保存。
(11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；
(12)5℃保温10h左右；
(13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次；
(14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；
(15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；
(16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，紫外分光光度计测其浓度，然后稀释成50ng/μL的工作液。
3、PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1.5mL离心管中，混匀后瞬时离心，分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。PCR反应体系见表2。
表2-PCR反应体系
| 成份Reaction components | 使用量Volume |
| 2×Reaction Mix | 7.5 |
| Sense Primer(10μM) | 0.1 |
| Anti-sense Primer(10μM) | 0.1 |
| Golden DNA聚合酶 | 0.1 |
| DNA模板 | 0.5 |
| ddH2O | 6.7 |
| Total | 15 |
15μL反应体系包括GoldenDNA聚合酶0.1μL(北京天根科技有限公司)，2×ReactionMix7.5μL(内含Mg2+、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含PPARβ基因的黄牛基因组DNA0.5μL，10pmol/μL上、下游引物各0.1μL。
PCR扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30～50s，63℃退火30s，72℃延伸30～50s，30～40个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。
对5个黄牛品种共计454个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得454个个体的黄牛PPARβ基因中包含该SNP位点的195bp的DNA片段。
三、PvuⅡ酶切消化PCR扩增的PPARβ基因片段
1、PvuⅡ酶切反应消化体系(20μL)：8μLPCR产物，10×M缓冲液2.0μL，PvuⅡ(10U/μL)0.3μL，灭菌超纯水(H2O)9.7μL。
2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化10～12h。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
1、制作12.0％的聚丙烯酰胺凝胶，250V预电泳10min，点样后200V电压电泳2h，电泳结束后硝酸银染色；
2、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性
根据银染结果判断SNP的多态性，见图3。PCR扩增基因产物时，当第71616位发生A>G突变时，则会被PvuⅡ酶识别进行切割；当上述该位点不发生A>G突变时，此时不能被限制性内切酶PvuⅡ所识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。
PvuⅡPCR-RFLP方法检测黄牛PPARβ基因第71616位SNP酶切电泳图，见图2(a)。由图2(a)可知，黄牛基因组的PPARβ基因第71616位的SNP多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为：AG(杂合型)基因型表现为167bp、147bp、28bp和20bp四条带；GG(突变型)基因型表现为147bp、28bp和20bp三条带；无AA(正常型)基因型。
3、不同基因型个体PCR产物的测序验证
由于引入的错配碱基位于正向引物内，因此，对不同基因型个体的PCR产物进行了反向测序；同时，进行SNP位置分析。结果表明包含167bp、147bp、28bp和20bp条带的杂合子AG基因型个体其71616位的测序图的确表示为A或G，如图2(b)所示，而GG基因型为G，测序峰图为单一峰。
五、黄牛PPARβ基因SNP位点的频率统计分析
1、基因和基因型频率
基因型频率在群体遗传学中，是指在一个种群中某种基因型所占的百分比。
PAA＝NAA/N
式中，PAA表示一个SNP位点的为AA基因型的频率；NAA表示拥有AA基因型的个体数；N为整个群体的总个数。
基因频率是某种基因在某个种群中出现的比例，是某基因个体数占全部基因数的比例。
PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+……NAai+……+NAan)/2N
式中，PA表示等位基因A的频率，NAA表示群体中拥有AA基因型的数目，NAai表示拥有Aai基因型的个体数目；a1-an表示等位基因A的n个不同的复等位基因。
本发明所涉及的等位基因为G和A，因此具体的基因频率计算公式为：
PG＝(2NGG+NAG)/2N
PA＝(2NAA+NAG)/2N
式中，PG，PA分别表示等位基因G和A等位基因的频率，NGG、NAG和NAA分别表示GG、AG和AA基因型的个体数量，N表示总群体数目。
基因频率分布见表3所示，由表3可知，在不同黄牛品种PPARβ基因SNP中的G等位基因频率变化幅度在65％～84.2％，A等位基因频率变化幅度在15.8％～35％之间。符合等位基因频率大于1.0％的SNP的定义，故本位点为单核苷酸多态位点。
表3-黄牛PPARβ基因第71616位SNP位点的PvuⅡPCR-RFLP的频率分布表
实施例2：基于黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的分子育种方法
基因型数据：PvuⅡ识别的基因型(AG和GG)
生产数据：南阳和郏县红牛牛初生重，以及6月龄、12月龄、18月龄和24月龄的体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽、日增重。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(17.0)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
Yijkl＝μ+BFi+Monthj+Gk+eijkl
其中：Yijkl为性状观察值，μ为总体均值，BFi为第i个品种和农场的固定效，Monthj为第j个月观测的固定效应，Gk为第k个单SNP标记基因型的固定效应，eijkl为随机误差。
PPARβ基因第71616位多态位点与南阳牛、郏县牛不同月龄生产指标间的方差分析结果见表4。由表4可知，在0日龄、6月龄与24月龄中GG基因型的个体体重极显著高于AG基因型(P<0.01)；在6月龄与24月龄中GG基因型的个体体高显著高于AG基因型(P<0.05)；在18月龄GG基因型的个体体高极显著高于AG基因型(P<0.01)。在0日龄、6月龄、12月龄、18月龄及24月龄中GG基因型个体的坐骨端宽均极显著高于AG基因型个体(P<0.01)。
关联分析结果说明GG基因型可以作为一个提高黄牛早期体重、体高及坐骨端宽的候选分子遗传标记。
表4PPARβ基因第71616位多态位点与南阳牛、郏县牛不同月龄生产指标间的方差分析
注：数字肩部具有不同字母者(如a和b，A，B等)表示差异异显著(P<0.05)，或差异极显著(P<0.01)。
Claims (5)
1.一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，以包含PPARβ基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PPARβ基因；然后用限制性内切酶PvuⅡ消化PCR扩增产物，接着对酶切后的片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性；其中，所述引物对P为：
上游引物P1：5'-TCCTTCCAGCAGCTACACAGCT-3'22bp；
下游引物P2：5'-GGGAGACAACTCGCCCAAGA-3'20bp。
2.根据权利要求1所述的黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为95℃预变性10min；94℃变性30～50s，63℃退火30s，72℃延伸30～50s，30～40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
3.根据权利要求1所述的黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳选用质量浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶。
4.根据权利要求1所述的黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性为：AG基因型表现为167bp、147bp、28bp和20bp四条带；GG基因型表现为147bp、28bp和20bp三条带；无AA基因型。
5.一种基于黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据权利要求1～4所述的黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法，确定黄牛PPARβ基因第71616位单核苷酸多态性的基因型；
(2)通过黄牛PPARβ基因第71616位单核苷酸多态性的基因型与黄牛生长性状进行关联分析，确定黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性能够作为提高黄牛早期生长性状的分子标记，用于黄牛的分子育种；
(3)黄牛PPARβ基因第71616位的单核苷酸多态性中GG基因型可作为提高黄牛早期生长性状的候选分子遗传标记。
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