CN105543208A - 一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法 - Google Patents

一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105543208A
CN105543208A CN201510971138.0A CN201510971138A CN105543208A CN 105543208 A CN105543208 A CN 105543208A CN 201510971138 A CN201510971138 A CN 201510971138A CN 105543208 A CN105543208 A CN 105543208A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sphere
chitosan
immobilized
magnetic micro
xanthine oxidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510971138.0A
Other languages
English (en)
Inventor
任娇艳
康小燕
刘丹
郑亚美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201510971138.0A priority Critical patent/CN105543208A/zh
Publication of CN105543208A publication Critical patent/CN105543208A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0093—Oxidoreductases (1.) acting on CH or CH2 groups (1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y117/00—Oxidoreductases acting on CH or CH2 groups (1.17)
    • C12Y117/03—Oxidoreductases acting on CH or CH2 groups (1.17) with oxygen as acceptor (1.17.3)
    • C12Y117/03002—Xanthine oxidase (1.17.3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法。该方法利用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒，并以此为磁核通过乳化交联法制备磁性壳聚糖微球，用环氧氯丙烷对微球表面进行活化，通过化学键作用将黄嘌呤氧化酶固定在微球上。本发明制备的固定化黄嘌呤氧化酶具有机械强度高，热稳定性好，pH稳定性及操作稳定性高，酶活回收率高等优点。本发明的制备工艺简单合理，成本低廉，原料可重复使用，在医药、化学、食品与发酵等领域有广阔的应用前景。

Description

一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法
技术领域
本发明涉及固定化酶领域，具体涉及一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法。
背景技术
磁性材料是一种用途广泛，历史悠久的功能材料。早在3000年以前，古人便将天然磁铁作为指南针使用，在现代，磁性材料被用作永磁马达、磁软盘、变压器中的铁心材料，作为存储器使用的磁光盘，计算机用磁记录软盘等等。磁性壳聚糖微球作为高分子材料与磁性材料的复合物，一方面有着优良的超顺磁性，使其很容易在外加磁场下实现对靶向物质的富集、分离和回收利用；另一方面，又可通过活化修饰引入如醛基、羧基、环氧基等的功能性基团而使其具有更多的功能特性。这些性质使磁性壳聚糖微球具有标记、固定、引导和磁分离的功能，从而在酶工程、细胞生物学、分离工程、分子生物学等领域有着良好的发展前景。
近年来，关于磁性壳聚糖微球制备及其应用的研究越来越广泛，尤其是在固定化酶方面。例如研究发现利用磁性壳聚糖磁性微球，用于固定化血红密孔菌漆酶(BiochemicalEngineeringJournal,2005,25(1):15-23)、脂肪酶(BiomassandBioenergy,2012,36:373-80)及纤维素酶(华南理工大学2012年硕士学位论文)，可使酶的热稳定性、pH稳定性、操作稳定性、储存稳定性以及酶的工作效率等得到很大程度的改善。
黄嘌呤氧化酶/脱氢酶广泛存在于植物(小麦、豌豆苗、拟南芥等)、动物(牛奶、小鼠乳腺及肝脏等)及微生物(节杆菌、链霉菌、光合细菌等)中，是一种含钼、无机硫化物、非血红素铁的黄素酶，能够催化次黄嘌呤、黄嘌呤生成尿酸，直接调控着体内尿酸水平的高低，是体内嘌呤代谢的关键酶。黄嘌呤氧化酶作为一种重要的代谢调控酶，在医学诊断及工业应用中具有远大前景，但游离酶较差的稳定性直接影响其应用。
国内外关于黄嘌呤氧化酶稳定性的研究主要集中于改变溶液环境提高其稳定性，对固定化方法的研究较少。张玉然等用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶，发现以谷氨酸为连接臂的琼脂糖介质(Sepharose-Glu)固定化效果最佳，酶活回收率达到15.5％(食品与生物技术学报,2014,33(1):16-21)。陈国南等研究以黄嘌呤氧化酶修饰的电加热碳糊电极，发现电极的电化学发光强度与次黄嘌呤的浓度呈线性关系，另外，不同于一般的温敏电极，该电极的温度是可控的(AnalyticalChemistry,2008,80(8):2826-2831)。RafaelRadi等将黄嘌呤氧化酶固定在由锂皂石纳米颗粒构成的玻碳电极上进行电化学研究，所制备的固定化酶不仅保留其生物活性，而且显示良好的电化学性能(BiosensorsandBioelectronics,2009,24(12):3556-3561)。
专利公开号为CN1368552A的专利公开了“一种可见光交联复合树脂固定黄嘌呤氧化酶活性细胞的方法”，公开日期为2002年9月11日，申请人为武汉大学。该方法以可见光交联复合树脂作为载体，将黄嘌呤氧化酶活性细胞包埋于其中，经可见光照射，制备了固定化细胞。制备的固定化细胞具有抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定，重复反应稳定性高，酶活保留高等方面的优点。
专利公开号为CN1834241A的专利公开了“一种固定化黄嘌呤氧化酶及其制备方法和用途”，公开日期为2006年9月20日，申请人为武汉大学。方法如下：将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘干，将烘干后的碳纳米管和双十六烷基磷酸加入蒸馏水中，超声分散得分散液；将分散液涂附在基体上，烘干，得到混合膜；将混合膜放入黄嘌呤氧化酶溶液吸附，得到固定化黄嘌呤氧化酶。该专利的突出特点是能同时得到黄嘌呤氧化酶三对氧化还原中心的电化学信号，并且黄嘌呤氧化酶保持其生物活性，能催化其底物-硝酸根的还原，有较好的稳定性和重现性。
专利公开号为CN103558306A的专利公开了“一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法”，公开日期为2014年2月5日，申请人为中南大学。该专利通过戊二醛作为交联剂，将黄嘌呤氧化酶固定在氨基化的四氧化三铁纳米粒子表面，得到黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子，用于快速筛选中草药中抑制黄嘌呤氧化酶的活性物质。
综上所述，关于固定化方法的研究，大多数是将黄嘌呤氧化酶固定成酶电极，用作电化学研究。目前关于磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的报道尚无，而本发明提供了一种新的固定化黄嘌呤氧化酶的方法，且该方法得到的固定化酶机械强度高，稳定性好，生物活性高，可用于后续的蛋白分离与纯化研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，该方法得到的固定化酶不仅保留其高效的生物活性，还具有良好的稳定性和重复利用性，而且该方法本身具有操作简单，条件易于控制等优点。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，该方法利用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒，并以Fe3O4磁性颗粒为磁核通过乳化交联法制备磁性壳聚糖微球，用环氧氯丙烷对磁性壳聚糖微球表面进行活化，用于黄嘌呤氧化酶的固定化研究。
进一步地，所述化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒的步骤为：将摩尔比为3:1～1:1的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合，氮气保护下滴加NaOH溶液，至溶液变为黑亮色，30～50℃下搅拌30～40min，结束后加入0.5～1mL油酸，于70～80℃水浴振荡下熟化30～60min，超声10～20min；冷却后用磁铁吸附，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性颗粒。
更进一步地，所述化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒的步骤为：将摩尔比为3:1～1:1的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合，氮气保护下滴加NaOH溶液，至溶液变为黑亮色，30℃下搅拌30min，结束后加入0.5mL油酸，于80℃水浴振荡下熟化30min，超声10min；冷却后用磁铁吸附，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性颗粒。
更进一步地，所述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的摩尔比为4:3～2:1。
进一步地，所述乳化交联法制备磁性壳聚糖微球的步骤为：制备10～15mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3O4磁性颗粒，超声分散30～40min；分散结束后，加入80～120mL液体石蜡、1.5～3mL吐温-80、1.5～3gSpan-80，在40～60℃水浴条件下搅拌30～40min；逐滴加入1～5ml戊二醛溶液，升温至60～70℃，搅拌1～1.5h，逐滴滴加NaOH溶液调节pH至9.0～11.0，置于70-75℃恒温振荡1～1.5h，超声10～15min；冷却后用磁铁吸附分离，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得磁性壳聚糖微球。
更进一步地，所述乳化交联法制备磁性壳聚糖微球的步骤为：制备10～15mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3O4磁性颗粒，超声分散30min；分散结束后，加入80～120mL液体石蜡、1.5～3mL吐温-80、1.5～3gSpan-80，在40℃水浴条件下搅拌30min；逐滴加入2ml戊二醛溶液，升温至60℃，搅拌1h，逐滴滴加NaOH溶液调节pH至9.0～11.0左右，置于70℃恒温振荡1h，超声10～15min；冷却后用磁铁吸附分离，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得磁性壳聚糖微球。
更进一步地，壳聚糖与Fe3O4磁性颗粒的质量比为2:1～1:2，水相与油相的体积比为1:3～1:6，戊二醛的体积分数为10～50％。
进一步地，所述对磁性壳聚糖微球表面进行活化的步骤为：称取磁性壳聚糖微球于离心管内，加入NaOH溶液与环氧氯丙烷溶液，搅拌混匀，加入NaBH4溶液，恒温水浴振荡反应3～5h。
更进一步地，恒温水浴振荡反应4h。
进一步地，所述NaOH溶液的浓度为0.2～1.6mol/L，环氧氯丙烷溶液的体积分数为10～50％，NaBH4溶液的浓度为0.3～1.5g/L。
进一步地，对所制备的Fe3O4磁性颗粒和磁性壳聚糖微球进行了红外、粒径及热重分析，证明Fe3O4磁性颗粒成功包裹在壳聚糖中。
进一步地，所述黄嘌呤氧化酶的固定化步骤为：称取0.01～0.05g经过活化的磁性壳聚糖微球于离心管中，加入100～500μL黄嘌呤氧化酶酶液，2～4mLTris-HCl缓冲液，在水浴震荡下进行固定化，得磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶。
进一步地，所述固定化时间为30～180min，固定化温度为25～60℃，固定化pH为6.0～10.0。
黄嘌呤氧化酶酶活测定方法：称取0.01～0.05g的磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶于离心管中，加入400μL1～10mmol/L的黄嘌呤标准液，3mL显色液，水浴保温20min后磁铁分离，取清液在508nm下测定吸光值。以显色液作为参比溶液。
固定化黄嘌呤氧化酶活力单位(U/g)定义：在30℃下每克磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶每分钟催化1μmol黄嘌呤，H2O和O2生成1μmolH2O2和尿酸为1个活力单位。
式中：c为H2O2浓度，mmol/L；V为溶液总体积，mL；t为反应时间，min；m为微球质量，g。
与现有技术相比，本发明具有如下优点与技术效果：
(1)制备步骤简单易行，利于工业生产；
(2)载体具有较好的机械强度，不会因机械搅拌或其他作用力影响破碎或脱落，载体可有效回收利用；
(3)本发明制备的固定化酶保持其生物活性，有较好的重现性；
(4)本发明制备的固定化酶具有良好的热稳定性，pH稳定性及操作稳定性。
附图说明
图1为实施例1Fe3O4磁性颗粒、壳聚糖、未活化和已活化磁性壳聚糖微球的傅里叶变换红外光谱图。
图2为实施例1Fe3O4磁性颗粒、未活化和已活化磁性壳聚糖微球的粒径分布图。
图3为实施例1磁性壳聚糖微球的热重分析(DTG)和差示扫描量热分析(DSC)图。
图4为实施例1固定化酶的最适温度曲线图。
图5为实施例1固定化酶的最适pH曲线图。
图6为实施例1固定化酶的热稳定性曲线图。
图7为实施例1固定化酶的pH稳定性曲线图。
图8为实施例1固定化酶的操作稳定性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
(1)共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒：量取0.5mol/L的FeCl3·6H2O溶液40mL和0.5mol/L的FeCl2·4H2O溶液30mL于烧杯中，氮气保护下滴加3mol/LNaOH溶液，至溶液变为黑亮色，30℃下搅拌30min，结束后加入0.5mL油酸，80℃水浴振荡下熟化30min，超声10min。冷却后磁铁吸附，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性颗粒。
(2)乳化交联法制备磁性壳聚糖微球：制备20mL15mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，在溶液中加入0.4g磁性Fe3O4颗粒，超声分散30min；分散结束后，加入80mL液体石蜡、2mL吐温-80、1.5gSpan-80，在40℃水浴条件下搅拌30min；逐滴加入2ml体积分数为25％戊二醛溶液，升温至60℃，搅拌1h，逐滴滴加NaOH溶液调节pH至9.0，70℃恒温振荡1h，超声10min。冷却后磁铁吸附分离，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得磁性壳聚糖微球。
(3)磁性壳聚糖微球的活化：称取0.01g磁性壳聚糖微球于离心管内，加入2.0mL1.2mol/L的NaOH溶液，2.0mL体积分数为30％的环氧氯丙烷溶液，搅拌混匀，加入1.5mL0.6g/L的NaBH4溶液，40℃恒温水浴振荡反应4h。
(4)结构表征：对所制备的Fe3O4磁性颗粒和磁性壳聚糖微球进行红外、粒径及热重分析，其结果见图1、图2和图3。图1中Fe3O4的特征峰为571.88cm-1，未活化及活化的磁性壳聚糖微球红外光谱图中，同时呈现了Fe3O4和壳聚糖的特征振动吸收峰，说明制备的壳聚糖微球成功包裹了Fe3O4磁性粒子。图2中Fe3O4、未活化磁性壳聚糖微球和已活化磁性微球的D50分别为2.15、20.30、24.69μm，说明壳聚糖包埋了Fe3O4，且活化的微球表面结合有活性基团环氧基，使其中径大于未活化微球的中径。图3中Fe3O4与壳聚糖的质量比为72.3％，远大于文献(磁性材料及器件,2001,32:1-3)中的9.05％，故具有优良的磁响应性。其它实施例制得的Fe3O4磁性颗粒和磁性壳聚糖微球的红外、粒径及热重分析结果与实施例1的基本一致。
(5)黄嘌呤氧化酶的固定化：称取0.01g磁性壳聚糖微球于离心管中，加入100μL黄嘌呤氧化酶酶液，3mLTris-HCl缓冲液(pH8.0)，在30℃下水浴震荡60min，得磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶。
(6)固定化酶酶学性质的研究：取步骤(5)中得到的固定化酶，分别研究该固定化酶的最适温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及操作稳定性，其结果见图4、图5、图6、图7和图8；由图4和图5可知，本实施例制备的固定化酶的最适温度为48℃、最适合pH为8.5，由图6、图7和图8可知，该固定化酶的热稳定性、pH稳定性及操作稳定性良好。其它实施例制得的固定化酶的最适温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及操作稳定性与实施例1的基本一致。
(7)此种方法得到的固定化酶的最高酶活回收率为76.51％。
实施例2：
(1)共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒：量取0.5mol/L的FeCl3·6H2O溶液40mL和0.5mol/L的FeCl2·4H2O溶液20mL于烧杯中，氮气保护下滴加3mol/LNaOH溶液，至溶液变为黑亮色，30℃下搅拌30min，结束后加入0.75mL油酸，80℃水浴振荡下熟化45min，超声10min。冷却后磁铁吸附，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性颗粒。
(2)乳化交联法制备磁性壳聚糖微球：制备20mL10mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，在溶液中加入0.4gFe3O4磁性颗粒，超声分散30min；分散结束后，加入100mL液体石蜡、3mL吐温-80、2.0gSpan-80，在40℃水浴条件下搅拌30min；逐滴加入2ml体积分数为50％戊二醛溶液，升温至60℃，搅拌1h，逐滴滴加NaOH溶液调节pH至11.0，70℃恒温振荡1h，超声10min。冷却后磁铁吸附分离，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得磁性壳聚糖微球。
(3)磁性壳聚糖微球的活化：称取0.025g磁性壳聚糖微球于离心管内，加入5mL0.6mol/L的NaOH溶液，体积分数为5mL40％的环氧氯丙烷溶液，搅拌混匀，加入3.75mL1.2g/L的NaBH4溶液，40℃恒温水浴振荡反应4h。
(4)结构表征：对所制备的Fe3O4磁性颗粒和磁性壳聚糖微球进行红外、粒径及热重分析，其结果见图1、图2、图3。
(5)黄嘌呤氧化酶的固定化：称取0.025g磁性壳聚糖微球于离心管中，加入200μL黄嘌呤氧化酶酶液，4mLTris-HCl缓冲液(pH8.5)，在37℃下水浴震荡120min，得磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶。
(6)此种方法得到的固定化酶的酶活回收率为51.87％。
实施例3：
(1)共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒：量取0.5mol/L的FeCl3·6H2O溶液30mL和0.5mol/L的FeCl2·4H2O溶液20mL于烧杯中，氮气保护下滴加3mol/LNaOH溶液，至溶液变为黑亮色，30℃下搅拌30min，结束后加入1mL油酸，80℃水浴振荡下熟化30min，超声10min。冷却后磁铁吸附，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性颗粒。
(2)乳化交联法制备磁性壳聚糖微球：制备20mL12mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，在溶液中加入0.4g磁性Fe3O4微粒，超声分散30min；分散结束后，加入60mL液体石蜡、1.5mL吐温-80、1.5gSpan-80，在40℃水浴条件下搅拌30min；逐滴加入2ml体积分数为40％戊二醛溶液，升温至60℃，搅拌1h，逐滴滴加NaOH溶液调节pH至10.0，70℃恒温振荡1h，超声10min。冷却后磁铁吸附分离，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得磁性壳聚糖微球。
(3)磁性壳聚糖微球的活化：称取0.05g磁性壳聚糖微球于离心管内，加入10mL0.9mol/L的NaOH溶液，10mL体积分数为20％的环氧氯丙烷溶液，搅拌混匀，加入7.5mL0.9g/L的NaBH4溶液，40℃恒温水浴振荡反应5h。
(4)结构表征：对所制备的Fe3O4磁性颗粒和磁性壳聚糖微球进行红外、粒径及热重分析，其结果见图1、图2、图3。
(5)黄嘌呤氧化酶的固定化：称取0.05g磁性壳聚糖微球于离心管中，加入500μL黄嘌呤氧化酶酶液，3mLTris-HCl缓冲液(pH10.0)，在30℃下水浴震荡60min，得磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶。
(6)此种方法得到的固定化酶的酶活回收率为20.21％。

Claims (9)

1.一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，该方法利用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒，并以Fe3O4磁性颗粒为磁核通过乳化交联法制备磁性壳聚糖微球，用环氧氯丙烷对磁性壳聚糖微球表面进行活化，用于黄嘌呤氧化酶的固定化研究。
2.根据权利要求1所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒的步骤为：将摩尔比为3:1~1:1的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合，氮气保护下滴加NaOH溶液，至溶液变为黑亮色，30~50°C下搅拌30~40min，结束后加入0.5~1mL油酸，于70~80oC水浴振荡下熟化30~60min，超声10~20min；冷却后用磁铁吸附，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性颗粒。
3.根据权利要求2所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的摩尔比为4:3~2:1。
4.根据权利要求1所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述乳化交联法制备磁性壳聚糖微球的步骤为：制备10~15mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3O4磁性颗粒，超声分散30~40min；分散结束后，加入80~120mL液体石蜡、1.5~3mL吐温-80、1.5~3gSpan-80，在40~60oC水浴条件下搅拌30~40min；逐滴加入1~5ml戊二醛溶液，升温至60~70oC，搅拌1~1.5h，逐滴滴加NaOH溶液调节pH至9.0~11.0，置于70~75oC恒温振荡1~1.5h，超声10~15min；冷却后用磁铁吸附分离，用无水乙醇和去离子水洗涤，干燥，得磁性壳聚糖微球。
5.根据权利要求4所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，壳聚糖与Fe3O4磁性颗粒的质量比为2:1~1:2，水相与油相的体积比为1:3~1:6，戊二醛的体积分数为10~50%。
6.根据权利要求1所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述对磁性壳聚糖微球表面进行活化的步骤为：称取磁性壳聚糖微球于离心管内，加入NaOH溶液与环氧氯丙烷溶液，搅拌混匀，加入NaBH4溶液，恒温水浴振荡反应3~5h。
7.根据权利要求6所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述NaOH溶液的浓度为0.2~1.6mol/L，环氧氯丙烷溶液的体积分数为10~50%，NaBH4溶液的浓度为0.3~1.5g/L。
8.根据权利要求1所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述黄嘌呤氧化酶的固定化步骤为：称取0.01~0.05g经过活化的磁性壳聚糖微球于离心管中，加入100~500μL黄嘌呤氧化酶酶液，2~4mLTris-HCl缓冲液，在水浴震荡下进行固定化，得磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶。
9.根据权利要求8所述的一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述固定化时间为30~180min，固定化温度为25~60oC，固定化pH为6.0~10.0。
CN201510971138.0A 2015-12-20 2015-12-20 一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法 Pending CN105543208A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510971138.0A CN105543208A (zh) 2015-12-20 2015-12-20 一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510971138.0A CN105543208A (zh) 2015-12-20 2015-12-20 一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105543208A true CN105543208A (zh) 2016-05-04

Family

ID=55822766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510971138.0A Pending CN105543208A (zh) 2015-12-20 2015-12-20 一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105543208A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893063A (zh) * 2017-10-17 2018-04-10 淮阴工学院 一种通过环氧交联包埋磁性纳米粒子固定酶的方法
CN108715601A (zh) * 2018-05-24 2018-10-30 华南理工大学 一种同时具有抗氧化和抑制Aβ42聚集特性的多肽及其应用与编码该多肽的基因
CN108772044A (zh) * 2018-07-06 2018-11-09 福建师范大学福清分校 磁性纳米壳聚糖负载鞘细菌复合生物吸附剂及其制备方法
CN113061595A (zh) * 2021-03-17 2021-07-02 东北农业大学 一种以环氧基修饰的磁性壳聚糖纳米粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法
CN114457063A (zh) * 2022-03-11 2022-05-10 安徽黑娃食品科技有限公司 一种降解花生中黄曲霉毒素b1的固定化酶制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102505008A (zh) * 2011-11-09 2012-06-20 华南理工大学 一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用
CN103898086A (zh) * 2014-04-24 2014-07-02 长沙学院 固定化水解酶及其制备方法和应用
CN104099317A (zh) * 2014-07-18 2014-10-15 江南大学 一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102505008A (zh) * 2011-11-09 2012-06-20 华南理工大学 一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用
CN103898086A (zh) * 2014-04-24 2014-07-02 长沙学院 固定化水解酶及其制备方法和应用
CN104099317A (zh) * 2014-07-18 2014-10-15 江南大学 一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周敬豪: "磁性壳聚糖微球的制备及其分离降血压肽的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *
张玉然等: "黄嘌呤氧化酶酶学性质及共价交联固定化", 《食品与生物技术学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893063A (zh) * 2017-10-17 2018-04-10 淮阴工学院 一种通过环氧交联包埋磁性纳米粒子固定酶的方法
CN108715601A (zh) * 2018-05-24 2018-10-30 华南理工大学 一种同时具有抗氧化和抑制Aβ42聚集特性的多肽及其应用与编码该多肽的基因
CN108772044A (zh) * 2018-07-06 2018-11-09 福建师范大学福清分校 磁性纳米壳聚糖负载鞘细菌复合生物吸附剂及其制备方法
CN113061595A (zh) * 2021-03-17 2021-07-02 东北农业大学 一种以环氧基修饰的磁性壳聚糖纳米粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法
CN114457063A (zh) * 2022-03-11 2022-05-10 安徽黑娃食品科技有限公司 一种降解花生中黄曲霉毒素b1的固定化酶制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105543208A (zh) 一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法
Li et al. Preparation and characterization of Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase immobilized on magnetic nanoparticles
Mu et al. Poly (2-vinyl-4, 4-dimethylazlactone)-functionalized magnetic nanoparticles as carriers for enzyme immobilization and its application
Ren et al. Carbonic anhydrase@ ZIF-8 hydrogel composite membrane with improved recycling and stability for efficient CO2 capture
Jing et al. Immobilization of carbonic anhydrase on epoxy-functionalized magnetic polymer microspheres for CO2 capture
CN101323022B (zh) 一种金磁核壳纳米粒子的制备方法
Lima et al. Cellulase immobilization on magnetic nanoparticles encapsulated in polymer nanospheres
CN103862037B (zh) 生物材料包埋零价铁-四氧化三铁双纳米体系的制备及前处理办法
Qi et al. Poly (carboxybetaine methacrylate)-functionalized magnetic composite particles: A biofriendly support for lipase immobilization
Song et al. Preparation and characterization of a thermostable enzyme (Mn-SOD) immobilized on supermagnetic nanoparticles
CN101329296B (zh) 一种基于磁性碳纳米管的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法
CN101979633B (zh) 一种Fe3O4磁性细菌纤维素球的制备方法
Noma et al. Preparation and characterization of amino and carboxyl functionalized core-shell Fe3O4/SiO2 for L-asparaginase immobilization: a comparison study
CN100572457C (zh) 金刚石粉改性方法及改性设备
CN105565506A (zh) 一种负载具有核-壳结构的磁性纳米颗粒的生物复合材料及其制备方法和用途
Mo et al. Preparation and characterization of magnetic polyporous biochar for cellulase immobilization by physical adsorption
Faridi et al. Utility of immobilized recombinant carbonic anhydrase of Bacillus halodurans TSLV1 on the surface of modified iron magnetic nanoparticles in carbon sequestration
CN104480101B (zh) 磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备及其产品和应用
CN108607518A (zh) 一种二氧化锰/氧化石墨烯基自驱动微马达制备方法
CN106745317A (zh) 一步法制备多孔四氧化三铁磁性纳米微球的方法及其应用
Tong et al. Preparation and application of magnetic chitosan derivatives in separation processes
CN105903441A (zh) 一种纳晶纤维素磁性粒子的制备方法
CN104195130A (zh) 一种磁性微/纳米胶包被生物炭固定化脂肪酶的制备方法
CN103406108B (zh) 一种碳基磁性温敏型表面印迹吸附剂的制备方法
CN109876780A (zh) 一种除磷吸附剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160504

RJ01 Rejection of invention patent application after publication