CN105543186B - 一种醇脱氢酶lc3及其基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种醇脱氢酶LC3及其基因和应用。该醇脱氢酶LC3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明从雷氏乳酸杆菌中提取了醇脱氢酶基因lc3，并构建了基因工程菌株，实现了该醇脱氢酶基因lc3的异源表达，所产生的醇脱氢酶LC3具有优良的酶学特性。本发明还成功构建了含有葡萄糖脱氢酶gdh基因和醇脱氢酶基因lc3的共表达基因工程菌株，实现了葡萄糖脱氢酶和醇脱氢酶的共表达。本发明还将上述醇脱氢酶LC3及其基因工程菌株应用于生物酶法合成手性醇(R)‑4‑氯‑3羟基丁酸乙酯和其他手性醇类产品的生产中，具有底物浓度高、反应速率快、方便的特点。

Description

一种醇脱氢酶LC3及其基因和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地涉及一种醇脱氢酶LC3及其基因和应用。
背景技术
酮还原酶广泛存在于高等动、植物以及低等微生物体内。酮还原酶在催化酮、醇时表现出高度的化学、区域、对映体选择性，受到颇多学者的青睐，现成为生物催化领域不可或缺的催化剂。
醇脱氢酶(ADH)家族来源的酶在手性化合物合成中占据了重要地位。醇脱氢酶对醛基、酮基、单糖以及酮类固醇具有氧化还原能力。醇脱氢酶可分为锌离子依赖性的ADH和非离子依赖性的ADH(短链醇脱氢酶)两个超家族。目前研究最多的是短链醇脱氢酶家族。酮还原酶，作为氧化还原酶系中的一个分支，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)为辅酶，可在温和的条件下将一系列酮或者醛不对称还原为具有光学活性的手性醇。
手性药物是指引入手性的药物有的一对互为镜像关系的对映异构体，它们的理化性质相似，但是立体结构的旋光性有所差异。可分为外消旋、R型(右旋)和S型(左旋)三种。不同的对映体对于不同的目标具有不同的生物活性，一个异构体是有效的，可能另一个是无效甚至有害的。手性药物的用量低、药效好的特点在临床治疗方面展现出了良好的应用前景。近年来，随着对药物手性特征的深入研究以及对光学异构体的认识度的提高，手性药物的市场迅猛增长，而消旋药物的市场以每年29.5％的速度递减。如今市场上销售药品的三分之一都为单一的同分异构型，即手性药物进行销售。而目前开发的药物三分之二都是手性药物。
手性醇一般可通过天然物质提取、化学合成和生物合成方法获得。(R)/(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)是一种非常重要的合成许多药物化合物的手性中间体。化学合成法催化产物的能耗高、污染高，相对于生物法有很多缺陷。生物法又分为动力学拆分异构体和底物不对称还原制备光学纯的CHBE。外消旋体的拆分虽然简单易行，但是其制备效率不高，且所得产物为混合物，后期分离困难。
生物催化转化法制备手性化合物是以氧化还原酶及其相关的微生物作为催化剂催化还原潜手性的底物羰基，生成相应的手性醇。其中利用基因工程菌进行全细胞催化已成为生物催化生成手性CHBE的发展趋势，生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。具有良好的工业化前景。
现已发现的能够催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)生成光学醇的4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的氧化还原酶中大都为生成(S)-CHBE的酶，生成(R)-CHBE的酶比较少见而且转化率比较低。现报道的单水相催化COBE中最高浓度能够达到800mM，24h完全转化生成(R)-CHBE(ee>99％)。(R)-CHBE可用于合成L-肉毒碱、大环内酯A、阿法替尼、2，5-环己二烯合成纤维的关键手性中间体，并且能够转化为[+]负霉素。阿法替尼是一种口服药物，是表皮生长因子受体(EGFR)和人表皮受体2(HER2)酪氨酸激酶的不可逆抑制剂，用于EGFR外显子19缺失和外显子(L85R)取代突变的转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗。阿法替尼(afatinib)由德国勃林格殷翰研发，已于2013年7月获美国FDA批准上市。目前阿法替尼的合成路线还是主要以化学合成法来进行。所以生物催化转化法制备(R)-CHBE具有良好的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种醇脱氢酶LC3及其基因和应用，从而解决现有技术中制备手性醇的生物酶的缺失。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供一种醇脱氢酶LC3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述醇脱氢酶LC3来源于CCTCC M 2011381雷氏乳酸杆菌(Lactobacilluscurieae sp.Nov.)。
虽然GenBank上公布了一种双乙酰还原酶，并且具有与上述SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列，也就是说，该段序列在此之前被认为是一种双乙酰还原酶。但是，所谓双乙酰还原酶，主要用于催化还原联二酮，而醇脱氢酶属于酮还原酶的一种，催化还原的是酮基，本专利利用醇脱氢酶催化还原的是一种酮基。醇脱氢酶来源有很多，但针对该底物进行催化还原需要进行大量的筛选试验探索。本领域技术人员一般不会从双乙酰还原酶推断出其可以用来催化还原4-氯乙酰乙酸乙酯，因此，目前对于双乙酰还原酶的研究还停留在催化还原联二酮上。
根据本发明的另一方面，提供一种醇脱氢酶基因lc3，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
还提供一种重组质粒，所述重组质粒由所述醇脱氢酶基因lc3与表达载体质粒连接构建而成。
优选地，该表达载体质粒为pET-28a，构成重组质粒lc3-pET-28a。
还提供另一种重组质粒，所述重组质粒由如上所述的醇脱氢酶基因lc3以及葡萄糖脱氢酶基因gdh与表达载体质粒连接构建而成。
优选地，该表达载体质粒为pET-28a，构成重组质粒lc3-gdh-pET-28a。
根据本发明的又一方面，提供一种表达醇脱氢酶LC3的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将包括醇脱氢酶基因lc3的重组质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株。
根据本发明的又一方面，提供一种共表达醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将包括醇脱氢酶基因lc3以及葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株。
该葡萄糖脱氢酶基因GDH含有783bp碱基，其在Genbank中的收录号为M12276，由该基因编码的羰基还原酶，包含260个氨基酸，其在Genbank中的收录号为AAA22463。
本发明从雷氏乳酸杆菌(Lactobacillus curieae sp.Nov.)中提取了醇脱氢酶基因lc3，并构建了含有醇脱氢酶基因lc3的基因工程菌株，从而实现了该醇脱氢酶基因lc3的异源表达，所产生的醇脱氢酶LC3具有优良的酶学特性，催化还原的温度范围为25-50℃，催化还原pH值为5.0-8.0，在40℃条件下保存24h后还有70％以上的的残余酶活。
所述醇脱氢酶LC3的催化温度优选为30-40℃，pH优选为5.0-7.0。
所述醇脱氢酶LC3的催化温度最优选为35℃，pH最优选为6.0。
目前本领域对于双乙酰还原酶的研究还仅限于催化还原二羰基，尤其是联二酮，如2,3-丁二酮，因此，根据本领域公知常识，双乙酰还原酶并不能被用来催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
而本发明还提供一种所述醇脱氢酶LC3以及所述基因工程菌株在合成手性醇类产品中的应用。
特别是所述醇脱氢酶LC3以及所述基因工程菌株被用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的应用。
具体地，本发明还提供了一种将共表达醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH的基因工程菌株用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的应用，该应用包括：将共表达醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH的基因工程菌株培养所得菌体作为催化剂，在以下反应体系中进行催化反应：pH 5.0～8.0磷酸盐、LC3-GDH湿菌体、1.5M～2.25M葡萄糖、0.2mM NAD+、1.0M～1.5M COBE于30～45℃水浴锅中，搅拌，反应结束，反应液用乙酸乙酯萃取，收集萃取相，离心，取有机相减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到油状的液体即为(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的粗品。
虽然现有技术将该氨基酸序列编码的蛋白定义为一种双乙酰还原酶，但是根据本领域公知常识，双乙酰还原酶主要用于催化还原联二酮，并不用于催化还原酮基，本发明首次发现由该序列编码的蛋白也是一种醇脱氢酶，并惊奇地发现可将其用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成重要的手性中间体(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。因此，本发明将由该段序列编码的蛋白作为一种醇脱氢酶LC3应用于生物酶法合成手性醇4-氯-3羟基丁酸乙酯和其他手性醇类产品的生产中相对现有技术均具有创造性。其中，基于氧化还原反应，在高底物(COBE)浓度条件下，在单水相中该醇脱氢酶LC3就已实现高浓度催化合成(R)-CHBE的反应。本发明的生物催化法单水相制备手性醇(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯，产量高达1.46M/L(243.2g/L)。在此基础上，本发明还成功构建了含有葡萄糖脱氢酶gdh基因和醇脱氢酶lc3基因共表达的质粒以及含有该重组质粒的共表达基因工程菌株。与双菌耦合催化合成手性(R)-CHBE相比，该共表达基因工程菌具有反应速率快、方便、底物浓度高的特点。
附图说明
图1是本发明纯化的醇脱氢酶LC3的SDS-PAGE图，其中，M为蛋白Marker，1为上清，2为纯化后的目的蛋白LC3；
图2是本发明的醇脱氢酶LC3的最适反应温度示意图；
图3是本发明的醇脱氢酶LC3的最适反应pH示意图；
图4是本发明的醇脱氢酶LC3的热稳定性示意图；
图5是共表达菌株质粒构建流程图；
图6是本发明的醇脱氢酶LC3上清、葡萄糖脱氢酶GDH上清、共表达醇脱氢酶LC3-葡萄糖脱氢酶GDH上清的SDS-PAGE图，其中，M为蛋白Marker，1为空载诱导后上清，2为LC3诱导后上清，3为GDH诱导后上清，4为LC3-GDH共表达菌株诱导后上清；
图7是本发明的醇脱氢酶LC3与葡萄糖脱氢酶GDH双菌耦合催化生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的示意图；
图8是本发明的醇脱氢酶LC3与葡萄糖脱氢酶GDH共表达菌株催化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
1.来源于雷氏乳酸杆菌的醇脱氢酶基因lc3的扩增
本发明的醇脱氢酶基因lc3来源于CCTCC M 2011381雷氏乳酸杆菌(Lactobacillus curieae sp.Nov.)，基于NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的同源比对，本申请的发明人发现一个与其相似性最高为81％的来源于Lactobacillus parafarraginis的双乙酰还原酶。
本发明的醇脱氢酶LC3属于短链脱氢酶家族，编码该醇脱氢酶LC3的醇脱氢酶基因lc3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，大小为777bp。
采用上海生工生物***基因组DNA小提试剂盒，并严格按照说明书上的操作对雷氏乳酸杆菌进行DNA样品纯化，得到雷氏乳酸杆菌(Lactobacillus curieaesp.Nov.)的全基因组。
根据序列分析结果设计扩增醇脱氢酶基因lc3的引物：
lc3F:5'CGCGGATCCATGGCAAAAGTTGCGATGA 3'
lc3R:5'CCCAAGCTTAAAGCAATCCGCCGCCATC 3'
以上述获得的雷氏乳酸杆菌的全基因组为模板，采用上面设计的引物进行PCR扩增，得到醇脱氢酶基因lc3。
2.含有醇脱氢酶基因lc3的重组质粒(lc3-pET-28a)的构建
本发明的含有醇脱氢酶基因lc3的重组质粒是通过将醇脱氢酶基因lc3与可选的质粒pET-28a(作为表达载体)连接构建而成。该醇脱氢酶基因lc3与质粒pET-28a的结合位点是BamHI和HindIII。以雷氏乳酸杆菌的全基因组基因为模板，以设计含酶切位点的引物lc3F/lc3R通过PCR扩增，得到醇脱氢酶基因lc3。
PCR扩增体系如下(50μL)：2×Taq Plus Master PCR Mix 25μL，引物2μL，模板2μL，加ddH2O补足至25μL。PCR扩增条件：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环；72℃5min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证大小以及胶回收纯化。具体步骤按照FAVORGEN DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收的基因片段和pET-28a质粒37℃下进行双酶切。回收酶切片段并于16℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布在卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h，挑取单菌落验证为阳性克隆后经LB培养基培养后提取质粒，获得醇脱氢酶基因lc3与质粒pET-28a的重组质粒lc3-pET-28a。
3.含有醇脱氢酶基因lc3的重组基因工程菌株的构建
将大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养基，按照本领域常规方法制备BL21感受态细胞。
将上述实施例2获得的重组质粒lc3-pET-28a转入大肠杆菌BL21感受态细胞，均匀涂布在卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h，挑取单菌落验证为阳性克隆后经LB培养基培养获得重组基因工程菌株。
4.醇脱氢酶LC3蛋白的表达和纯化
4.1将上述构建的重组基因工程菌株接种于含LB(+100μg/mL)培养基的试管中，37℃摇床培养12h。
4.2以1％的接种量接种到新鲜的液体LB(+100μg/mL)培养基中，200转/分的转速下37℃摇至OD600＝0.6，加IPTG至100μl/mL，20℃诱导20h。
4.3将培养基在4℃、8000rpm离心5min，收集菌体。将菌体用Tris-HCL(pH 8.0)重悬，于低温水浴中超声破碎，将破碎后的粗酶液8000rpm离心10min后，吸取上清用Ni-NTASuperflow Cartridge脱盐，浓缩，获得目的蛋白，即醇脱氢酶LC3。
4.4对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图1所示，重组醇脱氢酶LC3在大肠杆菌中表达，在TPI-200洗脱条件下纯化后为单一条带。
该醇脱氢酶LC3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共258个氨基酸，其理论分子量为26.8kDa。
5.醇脱氢酶LC3的最适反应温度分析
本发明的重组醇脱氢酶LC3的最适反应温度在25-65℃范围内测定。检测的反应体系(200μl)为：100mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，5mM 4-氯乙酰乙酸乙酯和9.25μg纯蛋白(即重组醇脱氢酶LC3)，0.2mM NADH，分别在25、30、35、40、45、50、55、60、65℃下反应2min，测定结果如图2所示，对LC3最适反应温度分析发现醇脱氢酶LC3的最适反应温度为35℃，且在大于35℃的反应体系中酶活开始下降，65℃时酶几乎失去活性。综上所述，重组醇脱氢酶LC3的最适反应温度为35℃。
6.重组醇脱氢酶LC3的最适反应pH值分析
重组醇脱氢酶LC3的最适反应pH在4.0-10.0范围内测定，检测方法为：在不同pH缓冲溶液中加入5mM 4-氯乙酰乙酸乙酯和9.25μg纯蛋白(即重组醇脱氢酶LC3)，在30℃条件下反应2min，在340nm波长下测定吸收值，测定结果如图6所示。测定所使用的缓冲液为：100mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.0-6.0)，100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0)，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)，100mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.0)。测定结果如图3所示，表明：重组醇脱氢酶LC3的最适pH为pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，在pH 5.0-8.0范围内均具有较高活性。
7.重组醇脱氢酶LC3的酶学稳定性分析
重组醇脱氢酶LC3的热稳定性在30-60℃范围内测定，检测方法为：将纯化的醇脱氢酶LC3酶液分别保温在30℃、40℃、50℃和60℃条件下，然后间隔同样时间取样测定残余酶活，检测的反应体系(200μl)为：100mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，5mM 4-氯乙酰乙酸乙酯和9.25μg纯蛋白(即重组醇脱氢酶LC3)，0.2mM NADH，在340nm波长下测定吸收值，分别在30℃下反应2min，测定结果如图4所示，表明：重组醇脱氢酶LC3的热稳定性在温度小于50℃时很好；40℃时24h后还有70％的活力；50℃时，1h酶活下降到30％，12h几乎完全失活；60℃时1h就完全失活。
综上所述，该醇脱氢酶LC3具有优良的酶学性质，催化还原范围为25-50℃，催化还原pH值为5.0-8.0，在40℃条件下24h后还有70％的残余酶活。
8.醇脱氢酶基因lc3与葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组质粒(lc3-gdh-pET-28a)的构建
本实施例中，本发明的含有醇脱氢酶基因lc3与葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组质粒是通过将醇脱氢酶基因lc3以及来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因gdh与质粒pET-28a(作为表达载体)连接构建而成。该醇脱氢酶基因lc3与质粒pET-28a的结合位点是NdeI和BamHI，葡萄糖脱氢酶gdh与质粒结合的位点是HindIII和XhoI。以重组质粒gdh-pET-28a为模板，以设计的含酶切位点(HindIII、XhoI)、核糖体结合位点(SD)以及间隔序列(AS)的引物gdhF/gdhR通过PCR扩增得到葡萄糖脱氢酶基因gdh。引物如下：
gdhF:5’CCCAAGCTTAAGGAGATATACATATGTATCCGGAT 3’
gdhR:5’CCGCTCGAGTTAACCGCGGCCTGCCTGGA 3’
PCR扩增体系如下(50μL)：2×Taq Plus Master PCR Mix 25μL，引物2μL，模板2μL，加ddH2O补足至50μL。PCR扩增条件：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环；72℃5min。
PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证大小及胶回收纯化。具体步骤按照FAVORGENDNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收的基因片段和lc3-pET-28a质粒于37℃下进行双酶切。回收酶切片段并于16℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布在卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h，挑取单菌落验证为阳性克隆后经LB培养基培养后提取质粒，获得重组质粒lc3-gdh-pET-28a。构建流程如图5所示，其中，Gene1为lc3基因，Gene2为gdh基因，SD为核糖体结合位点，AS为间隔序列。
9.醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的基因工程菌的构建
本实施例中，醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的基因工程菌株通过上述重组质粒lc3-gdh-pET-28a转化大肠杆菌BL21(DE3)获得，转化方法如下：
将构建好的重组质粒lc3-gdh-pET-28a转入感受态细胞BL21，均匀涂布在含有卡那霉素的固体LB培养基上，37℃培养箱中倒置培养16h，挑取培养皿上的单菌落至LB培养基试管中，37℃摇床培养12h后将菌种保存于甘油管中并存于-40℃中，即得到醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的基因工程菌。
利用该基因工程菌株进行醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的方法与利用醇脱氢酶LC3工程菌株获得醇脱氢酶LC3蛋白的方法一致。
对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图6所示，获得了醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的蛋白LC3-GDH，如泳道4所示。
10.重组醇脱氢酶的底物谱分析实验
该实验的目的是检测根据上述实施例4所获得的醇脱氢酶LC3具有活性的底物。检测方法为：配置200mM的底物(底物溶解于甲醇)用于检测酶活。检测的反应体系(200μl)为：100mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，5mM底物和9.25μg纯蛋白(即重组醇脱氢酶LC3)，0.2mMNADH，在340nm波长下测定吸收值，分别在30℃下反应2min，测定结果如表1所示，其中，NMA(NOT MEASURED ACTIVITY)是指没有检测到活力。重组醇脱氢酶LC3对于酮酯类物质具有较好的活性，其中，对丙酮酸甲酯和丙酮酸乙酯的活力较高，丙酮酸乙酯的比活高达231.10U/mg，丙酮酸甲酯的比活高达284.01U/mg，而对苯乙酮类物质没有检测到活性。
表1
11.醇脱氢酶LC3与葡萄糖脱氢酶GDH双菌耦合催化生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯
将上述实施例3获得的含有醇脱氢酶基因lc3的重组基因工程菌株培养所得湿菌体LC3作为催化剂在100mL的三口烧瓶中进行自动加样，2M Na2CO3调节pH(6.0～7.0)反应。反应体系(50mL)：磷酸盐(pH 6.0)、LC3湿菌体(150mg/mL)、GDH冻干菌体(15mg/mL)或GDH湿菌体(150mg/mL)、葡萄糖(1.5M)、NAD+(0.2mM)、COBE(1M)于30℃水浴锅中，以300rpm的速度搅拌，隔1h取样，于1mL乙酸乙酯中萃取两次，取三次平行样，用高效气相色谱检测(DB-5毛细管柱，流速1mL/min,进样口温度250℃，检测器温度250℃，进样量1μL)，检测结果如图7所示。1.0M 4-氯乙酰乙酸乙酯通过醇脱氢酶菌体LC3转化得到(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯16h，转化率为100％，产物浓度为803.3mM。反应结束后，取样品用五倍体积的乙酸乙酯萃取两次加无水硫酸钠干燥过夜，后溶于异丙醇中，利用高效液相色谱(Chiralcel OD-H，流动相：正己烷/异丙醇＝95:5v/v，1mL/min，UV 210nm)测得ee值>99％。对映体过量值：ee.(％)＝(R-S)/(R+S)×100％，其中R、S分别为两种对映体含量。转化率(C)＝(产物量/底物量)×100％。反应液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取相，8000rpm离心10min，取有机相30℃减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到油状的液体为(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的粗品。
12.醇脱氢酶LC3与葡萄糖脱氢酶GDH共表达催化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
将上述实施例9获得的大肠杆菌湿菌体LC3-GDH作为催化剂在100mL的三口烧瓶中进行自动加样，2M Na2CO3调节pH(6.0～7.0)反应。反应体系(50mL)：磷酸盐(pH 6.0)、LC3-GDH湿菌体(200mg/mL)、葡萄糖(1.5M/2.25M)、NAD+(0.2mM)、COBE(1.0M/1.5M)于30℃水浴锅中，300rpm速度搅拌，隔1h取样，于1mL乙酸乙酯中萃取两次，用高效气相色谱检测。结果如图8所示。1.0M COBE通过醇脱氢酶转化得到(R)-CHBE，3h转化率达到100％，产物浓度为0.96M/L(160.0g/L)，ee值>99％。1.5M COBE通过醇脱氢酶转化得到(R)-CHBE，16h转化率为97.7％，产物浓度为1.46M/L(243.2g/L)，ee值>99％。反应液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取相，8000rpm离心10min，取有机相30℃减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到油状的液体即为(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的粗品。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由一种醇脱氢酶基因lc3以及葡萄糖脱氢酶基因gdh与表达载体质粒连接构建而成，所述醇脱氢酶基因lc3的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种共表达醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是将根据权利要求1所述的重组质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株。
3.一种如权利要求2所述的基因工程菌株在合成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述醇脱氢酶LC3的催化温度为25-50℃，pH为5.0～8.0。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌株被用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：将共表达醇脱氢酶LC3和葡萄糖脱氢酶GDH的基因工程菌株培养所得LC3-GDH湿菌体作为催化剂，在以下反应体系中进行催化反应：pH 5.0～8.0磷酸盐、LC3-GDH湿菌体、1.5M～2.25M葡萄糖、0.2mM NAD+、1.0M～1.5MCOBE于30～45℃水浴锅中，搅拌，反应结束，反应液用乙酸乙酯萃取，收集萃取相，离心，取有机相减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到油状的液体即为(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的粗品。
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