CN105543184A - 黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法，Cyp24a1序列的全长为2180bp，编码506个氨基酸。黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C2602H4112N704O740S26，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。对黄颡鱼Cyp24a1蛋白结构和功能预测分析,Cyp24a1蛋白没有信号肽序列，并且也没有跨膜结构域。在NCBI上比对黄颡鱼Cyp24a1蛋白发现与斑点叉尾鮰和斑马鱼的同源性分别达到94％和74％。Cyp24a1基因在肝脏中表达最高，在肌肉和肠中微量表达。本发明利用RACE技术填补了该基因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究该基因在鱼类上的功能奠定了基础。

Description

黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地指一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法。
背景技术
维生素D属于固醇类衍生物，具有抗佝偻病的作用，是动物必需的一种维生素。鱼体不能合成维生素D而必须由食物供给。由于鱼体对维生素D3的利用率高于维生素D2，所以维生素D3是鱼体中维生素D的主要贮存形式。维生素D3经鱼体的肠的吸收后，被乳糜微粒经血液运送至肝脏。在肝脏中，维生素D3在25位羟基化形成25-羟基维生素D3[25(OH)D3]。25(OH)D3随后在25-羟基维生素D3-1α-羟化酶(CYP24A1)的催化下转变为具有生物活性的1α,25-二羟维生素D3[1α,25(OH)2D3]。
一些体内研究已经表明，维生素D3最活跃的代谢物1α,25(OH)2D3可以减弱上皮细胞的增殖作用、促进大肠癌细胞的分化和凋亡，并且还具有降低肿瘤浸润程度、抑制肿瘤细胞转移和远处迁移等一系列的抗癌作用。Cyp24a1基因编码抑制维生素D3代谢活化的酶25-羟基维生素D3-24-羟化酶(CYP24A1)，该酶能将1α,25(OH)2D3转换成失活形式的维生素D3-23-羧酸，减少1α,25(OH)2D3的生成，降低其发挥生物学功能。然而，Cyp24a1基因在鱼类上的研究还较为缺乏。
发明内容
本发明的目的提供了一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法。黄颡鱼Cyp24a1基因填补了该基因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究黄颡鱼的该基因奠定了分子基础。
为实现上述目的，本发明提供的一种黄颡鱼Cyp24a1蛋白，所述黄颡鱼Cyp24a1的氨基酸序列为：
(1)由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)与序列SEQIDNo.3限定的氨基酸序列同源性在90～100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；
(3)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中密码子的第三个碱基替换的一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
进一步地，所述黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C2602H4112N704O740S26，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。
编码蛋白的黄颡鱼Cyp24a1基因的开放阅读框ORF，所述开放阅读框ORF的序列为SEQIDNo.1所示。
包含所述ORF的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列，其特征在于：所述的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列为SEQIDNo.2所示。
获取黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，包括以下步骤：
1)肝脏组织总RNA的提取；
2)cDNA第一链的合成；
3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增；
4)RACE-PCR扩增；
5)RACE片段的分离与回收；
6)连接和转化；
7)将阳性克隆菌液送出测序；
8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。
进一步地，具体包括以下步骤：
1)肝脏组织总RNA的提取
总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括以下步骤：
(1)从-80℃冰箱中取出100mg的肝脏组织，放入用高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮并磨成粉末；
(2)向2mL的离心管中加入1mL预冷的RNAisoPlus裂解液，然后迅速把组织粉末加入到离心管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室温静置5min；
(3)4℃条件下12000×g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中；
(4)吸取0.2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液乳化呈白色，在室温静置5min；
(5)4℃条件下12000×g离心15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离心管中；
(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒离心管使其充分地混匀，在室温静置10min；
(7)4℃条件下12000×g离心10min，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；
(8)小心弃去上清，沿着离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁；
(9)4℃条件下7500×g离心5min后小心弃去上清；
(10)打开离心管盖，室温干燥沉淀3～5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；
(11)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80℃冰箱中保存；
2)cDNA第一链的合成
(1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：
(2)4℃条件下反应2min；
(3)在冰上配制反转录反应体系，如下：
(4)在PCR仪器上37℃15min，85℃5s，在-20℃冰箱中保存；
3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增
根据转录组的数据设计引物对
Cyp24a1-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT；
Cyp24a1-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC；
PCR扩增的反应条件为：
95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5分钟；PCR产物连入pMD19-T载体中，转化E.coliDH5α，涂布含氨卞青霉素的LB筛选平板，挑选若干个阳性克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，对PCR阳性克隆产物进行测序；
4)RACE-PCR扩增
4.1RACE引物设计
根据已获得Cyp24a1核心序列分别设计RACE的巣式引物；
5’RACE引物
Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT
Cyp24a1-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG
3’RACE引物
Cyp24a1-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT
Cyp24a1-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG
4.2RACE-ReadycDNA准备
(1)在冰上分别配制5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液
(2)混匀试剂，瞬时离心，然后在PCR仪器孵育，反应条件为72℃3min，42℃2min，冷却后用14000×g离心10s；
(3)在5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液中都加入下列试剂
(4)混匀试剂，瞬时离心；然后在PCR仪器中进行反转录反应，
反应条件为42℃90min，70℃10min终止反应，用TE缓冲液稀释第一链反应物，并在-20℃中保存；
4.3RACE-PCR扩增
(1)RACE-PCR反应液的配制
(2)混匀试剂，瞬时离心；
按照如下条件进行“Touchdown”PCR：94℃3min；94℃30s，72℃3min，反应5个循环；94℃30s，70℃30s，70℃3min，反应5个循环；94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应25个循环；最后72℃延伸10min；
(3)用Tricine-EDTAbuffer稀释第一步PCR的反应液并作为模版，以3’/5’RACECyp24a1-NGSP和UPM为Short引物进行PCR反应；程序为94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应20个循环；
5)3’/5’RACE片段的分离与回收
(1)切割含目的DNA片段的凝胶块时，要吸干胶上的水分，切胶尽可能的要小，放入到1.5mL离心管中；
(2)称重离心管后，每100mg凝胶加入200μlBufferNT1；
(3)在50℃条件下，约5～10min溶解凝胶，每2min混匀一下，待凝胶完全溶解；
(4)将PCRClean-Up柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至Clean-Up柱中，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；
(5)在Clean-Up柱中加入700μlBufferNT3，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；
(6)11000×g离心1min，确保BufferNT3完全清除；
(7)将Clean-Up柱放入新的离心管中，在Clean-Up柱子膜中央加20μlBufferNE，室温静置1min，11000×g离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA目的片段；
6)连接和转化
6.1连接
(1)在200μl的离心管中依次加入下列试剂：
(2)混匀试剂，瞬时离心；在50℃条件下孵育15min，然后转移到冰上；
6.2转化
(1)取Stellar感受态细胞100μl，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置；
(2)再加入预热的SOC培养基至1mL，37℃预表达1h；
(3)取100μl预表达的菌液放入1.5mL的离心管，在分别加入10μlIPTG和40μlX-gal，并混匀；
(4)将菌液均匀涂布在含氨卞青霉素的LB筛选平板上，37℃正面放置30min，带菌液完全吸收培养基后，37℃倒置培养12～16h；
7)将阳性克隆菌液送出测序
(1)挑取白色单一菌落10个，分别接种于1mL含5μl氨苄SOC培养基，37℃230r/min震荡培养4～6h；
(2)对这10个菌液进行菌液PCR鉴定；
(3)挑选若干个阳性克隆菌液500μl进行测序；
8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。
本发明的有益效果在于：
Cyp24a1序列的全长为2180bp，如SEQIDNo.2所示，包含了1521bp的开放阅读框，47bp的5′非编码区和595bp的3′非编码区，编码506个氨基酸。黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C2602H4112N704O740S26，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。对黄颡鱼Cyp24a1蛋白结构和功能预测分析，发现，Cyp24a1蛋白没有信号肽序列，并且也没有跨膜结构域。在NCBI上比对黄颡鱼Cyp24a1蛋白发现与斑点叉尾鮰和斑马鱼的同源性分别达到94％和74％。利用荧光定量PCR验证该基因在黄颡鱼组织中的表达情况，结果发现Cyp24a1基因在肝脏中表达最高，在肌肉和肠中微量表达。本发明利用RACE技术填补了该基因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究该基因在鱼类上的功能奠定了基础。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
获取黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，包括以下步骤：
1、肝脏组织总RNA的提取
总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括以下步骤：
(1)从-80℃冰箱中取出约100mg左右的肝脏组织，放入用高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮并磨成粉末；
(2)向2mL的离心管中加入1mL预冷的RNAisoPlus裂解液，然后迅速把组织粉末加入到离心管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室温(15-30℃)静置5min；
(3)4℃条件下12000×g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中(切勿吸取沉淀)；
(4)吸取0.2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液乳化呈白色，在室温静置5min；
(5)4℃条件下12000×g离心15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离心管中；
(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒离心管使其充分地混匀，在室温静置10min；
(7)4℃条件下12000×g离心10min，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；
(8)小心弃去上清(切勿触及沉淀)，沿着离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁；
(9)4℃条件下7500×g离心5min后小心弃去上清(切勿触及沉淀)；
(10)打开离心管盖，室温干燥沉淀3-5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；
(11)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80℃冰箱中保存。
2、cDNA第一链的合成
(1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：
(2)4℃条件下反应2min；
(3)在冰上配制反转录反应体系，如下：
(4)在PCR仪器上37℃15min，85℃5s，在-20℃冰箱中保存。
3、Cyp24a1核心片段的PCR扩增
根据转录组的数据(AccessionNo.SSR2239572)设计引物
Cyp24a1-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT；
Cyp24a1-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC。
PCR扩增的反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5分钟。PCR产物连入pMD19-T(大连宝生物工程公司，中国)载体中，转化E.coliDH5α(大连宝生物工程公司，中国)，涂布含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中国)的LB筛选平板，挑选若干个阳性克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，将PCR阳性克隆产物送到大连宝生物工程公司测序。
4、RACE-PCR扩增
4.1RACE引物设计
根据已获得Cyp24a1核心序列分别设计RACE的巣式引物。
5’RACE引物
Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT
Cyp24a1-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG
3’RACE引物
Cyp24a1-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT
Cyp24a1-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG
(在5’和3’RACE引物的5’段都加入一段“GATTACGCCAAGCTT”序列)
4.2RACE-ReadycDNA准备
(1)在冰上分别配制5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液
(2)混匀试剂，瞬时离心。然后在PCR仪器孵育，反应条件为72℃3min，42℃2min，冷却后用14000×g离心10s；
(3)在5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液中都加入下列试剂
(4)混匀试剂，瞬时离心，然后在PCR仪器中进行反转录反应，
反应条件为42℃90min，70℃10min终止反应，用TE缓冲液稀释第一链反应物，并在-20℃中保存；
4.3RACE-PCR扩增
(1)RACE-PCR反应液的配制
(2)混匀试剂，瞬时离心：按照如下条件进行“Touchdown”PCR：94℃3min；94℃30s，72℃3min，反应5个循环；94℃30s，70℃30s，70℃3min，反应5个循环；94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应25个循环，最后72℃延伸10min；
(3)用Tricine-EDTAbuffer稀释第一步PCR的反应液并作为模版，以3’/5’RACECyp24a1-NGSP和UPM为Short引物进行PCR反应；程序为94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应20个循环；
5)3’/5’RACE片段的分离与回收
(1)切割含目的DNA片段的凝胶块时，要吸干胶上的水分，切胶尽可能的要小(可以提高DNA的回收率)，放入到1.5mL离心管(以称重)中；
(2)称重离心管后，每100mg凝胶加入200μlBufferNT1；
(3)在50℃条件下，约5-10min溶解凝胶，每2min混匀一下，待凝胶完全溶解；
(4)将PCRClean-Up柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至Clean-Up柱中，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；
(5)在Clean-Up柱中加入700μlBufferNT3，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；
(6)11000×g离心1min，确保BufferNT3完全清除；
(7)将Clean-Up柱放入新的离心管中，在Clean-Up柱子膜中央加20μlBufferNE，室温静置1min。11000×g离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA目的片段。
6、连接和转化
6.1连接
(1)在200μl的离心管中依次加入下列试剂：
(2)混匀试剂，瞬时离心；在50℃条件下孵育15min，然后转移到冰上。
6.2转化
(1)取Stellar感受态细胞100μl，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置；
(2)再加入预热的SOC培养基至1mL，37℃预表达1h；
(3)取100μl预表达的菌液放入1.5mL的离心管，在分别加入10μlIPTG和40μlX-gal，并混匀。
(4)将菌液均匀涂布在含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中国)的LB筛选平板上，37℃正面放置30min，带菌液完全吸收培养基后，37℃倒置培养12-16h。
8、将阳性克隆菌液送出测序
(1)挑取白色单一菌落10个，分别接种于1mL含5μl氨苄SOC培养基，37℃230r/min震荡培养4-6h；
(2)对这10个菌液进行菌液PCR鉴定；
(3)挑选若干个阳性克隆菌液大约500μl送到大连宝生物工程公司测序。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干具体实施例框架。显然，本发明不限于以上实施例，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
9、Cyp24a1的生物信息学分析
利用在线软件ORFfinder分析获得的Cyp24a1基因的全长cDNA序列，找出编码框；ProtParam工具计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成；利用SingalP3.0在线分析软件分析编码蛋白有无信号肤；ProtSCale在线分析软件分析编码蛋白的疏水性；利用TMHMM服务器分析编码蛋白有无跨膜结构；BLAsTp软件以及FASTA软件用于同源蛋白的搜索；利用CDD软件查询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种黄颡鱼Cyp24a1蛋白，其特征在于：所述黄颡鱼Cyp24a1的氨基酸序列为：
(1)由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQIDNo.3限定的氨基酸序列同源性在90～100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；
(3)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中密码子的第三个碱基替换的一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述黄颡鱼Cyp24a1蛋白，其特征在于：所述黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C2602H4112N704O740S26，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。
3.编码权利要求1所述蛋白的黄颡鱼Cyp24a1基因的开放阅读框ORF，其特征在于：所述开放阅读框ORF的序列为SEQIDNo.1所示。
4.包含权利要求3所述ORF的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列，其特征在于：所述的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列为SEQIDNo.2所示。
5.获取权利要求4所述黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)肝脏组织总RNA的提取；
2)cDNA第一链的合成；
3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增；
4)RACE-PCR扩增；
5)RACE片段的分离与回收；
6)连接和转化；
7)将阳性克隆菌液送出测序；
8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。
6.根据权利要求5所述黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)肝脏组织总RNA的提取
总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括以下步骤：
(1)从-80℃冰箱中取出100mg的肝脏组织，放入用高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮并磨成粉末；
(2)向2mL的离心管中加入1mL预冷的RNAisoPlus裂解液，然后迅速把组织粉末加入到离心管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室温静置5min；
(3)4℃条件下12000×g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中；
(4)吸取0.2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液乳化呈白色，在室温静置5min；
(5)4℃条件下12000×g离心15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离心管中；
(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒离心管使其充分地混匀，在室温静置10min；
(7)4℃条件下12000×g离心10min，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；
(8)小心弃去上清，沿着离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁；
(9)4℃条件下7500×g离心5min后小心弃去上清；
(10)打开离心管盖，室温干燥沉淀3～5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；
(11)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80℃冰箱中保存；
2)cDNA第一链的合成
(1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：
(2)4℃条件下反应2min；
(3)在冰上配制反转录反应体系，如下：
(4)在PCR仪器上37℃15min，85℃5s，在-20℃冰箱中保存；
3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增
根据转录组的数据设计引物对
Cyp24a1-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT；
Cyp24a1-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC；
PCR扩增的反应条件为：
95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5分钟；PCR产物连入pMD19-T载体中，转化E.coliDH5α，涂布含氨卞青霉素的LB筛选平板，挑选若干个阳性克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，对PCR阳性克隆产物进行测序；
4)RACE-PCR扩增
4.1RACE引物设计
根据已获得Cyp24a1核心序列分别设计RACE的巣式引物；
5’RACE引物
Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT
Cyp24a1-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG
3’RACE引物
Cyp24a1-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT
Cyp24a1-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG
4.2RACE-ReadycDNA准备
(1)在冰上分别配制5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液
(2)混匀试剂，瞬时离心，然后在PCR仪器孵育，反应条件为72℃3min，42℃2min，冷却后用14000×g离心10s；
(3)在5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液中都加入下列试剂
(4)混匀试剂，瞬时离心；然后在PCR仪器中进行反转录反应，
反应条件为42℃90min，70℃10min终止反应，用TE缓冲液稀释第一链反应物，并在-20℃中保存；
4.3RACE-PCR扩增
(1)RACE-PCR反应液的配制
(2)混匀试剂，瞬时离心；
按照如下条件进行“Touchdown”PCR：94℃3min；94℃30s，72℃3min，反应5个循环；94℃30s，70℃30s，70℃3min，反应5个循环；94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应25个循环；最后72℃延伸10min；
(3)用Tricine-EDTAbuffer稀释第一步PCR的反应液并作为模版，以3’/5’RACECyp24a1-NGSP和UPM为Short引物进行PCR反应；程序为94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应20个循环；
5)3’/5’RACE片段的分离与回收
(1)切割含目的DNA片段的凝胶块时，要吸干胶上的水分，切胶尽可能的要小，放入到1.5mL离心管中；
(2)称重离心管后，每100mg凝胶加入200μlBufferNT1；
(3)在50℃条件下，约5～10min溶解凝胶，每2min混匀一下，待凝胶完全溶解；
(4)将PCRClean-Up柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至Clean-Up柱中，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；
(5)在Clean-Up柱中加入700μlBufferNT3，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；
(6)11000×g离心1min，确保BufferNT3完全清除；
(7)将Clean-Up柱放入新的离心管中，在Clean-Up柱子膜中央加20μlBufferNE，室温静置1min，11000×g离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA目的片段；
6)连接和转化
6.1连接
(1)在200μl的离心管中依次加入下列试剂：
(2)混匀试剂，瞬时离心；在50℃条件下孵育15min，然后转移到冰上；
6.2转化
(1)取Stellar感受态细胞100μl，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置；
(2)再加入预热的SOC培养基至1mL，37℃预表达1h；
(3)取100μl预表达的菌液放入1.5mL的离心管，在分别加入10μlIPTG和40μlX-gal，并混匀；
(4)将菌液均匀涂布在含氨卞青霉素的LB筛选平板上，37℃正面放置30min，带菌液完全吸收培养基后，37℃倒置培养12～16h；
7)将阳性克隆菌液送出测序
(1)挑取白色单一菌落10个，分别接种于1mL含5μl氨苄SOC培养基，37℃230r/min震荡培养4～6h；
(2)对这10个菌液进行菌液PCR鉴定；
(3)挑选若干个阳性克隆菌液500μl进行测序；
8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。
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