CN105542158B - 一种萘酰亚胺双光子荧光染料、其制备方法和应用 - Google Patents

一种萘酰亚胺双光子荧光染料、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于精细化工领域，公开了一种萘酰亚胺双光子荧光染料、其制备方法和应用，该萘酰亚胺双光子荧光染料为下式所示的4‑位偶联低分子量PEI、N‑位为烷烃或脂肪胺取代的萘酰亚胺化合物，具有双光子吸收特性，水溶性好，生物相容性好，毒性低，染色时间短，可用于细胞核、溶酶体成像，且可实现非固定的活细胞染色及成像，并且细胞内成像时无渗漏现象。

Description

一种萘酰亚胺双光子荧光染料、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于精细化工领域，涉及一种萘酰亚胺双光子荧光染料，具体为一种具有双光子吸收特性、4-位为低分子量PEI取代的萘酰亚胺化合物及其制备方法，以及这类荧光染料在生物染色、成像方面的应用。
背景技术
双光子荧光显微成像采用近红外光激发，能够穿透标本，实现组织、动物成像；与单光子成像相比具有可以避免光致毒、荧光漂白，减小对细胞的损伤，高横向分辨率与纵横向分辨率，降低生物组织吸收系数和自发荧光干扰、改善成像效果等优势。实现双光子显微成像需要双光子荧光染料，因此，双光子荧光染料越来越受到生命科学、医学诊断等研究领域的青睐。某些传统的荧光染料(如香豆素、荧光素)虽然可以用于双光子显微成像，但是由于它们的双光子吸收能力太小，使用时必需用高强度激光激发，结果导致生物样品热损伤。目前报道的具有较强双光子吸收能力的化合物多数水溶性较差，不适于在生物体系中应用。生物成像领域常见的双光子发色团，它们中大多数的双光子吸收截面积较低，导致双光子激发荧光亮度较弱，不得已采用增大脉冲激光器功率的方法，来获得较强的双光子激发荧光，但是这样会对生物组织或细胞伤害较大，不利于长时研究。通过物理吸附或者自组装把双光子荧光染料包载到纳米材料上，或者通过化学键把染料修饰到纳米材料上均可以改善染料水溶性，但是受进入细胞方式所限往往需要较长的染色时间，并且被包载的双光子荧光染料容易伴有渗漏的现象，影响成像效果。因此，开发适于染色、成像用双光子荧光染料具有重要的意义。
萘酰亚胺作为一类重要的绿光区发色团，具有显著的非线性光学特性，可以实现近红外波段的双光子激发，它的双光子吸收截面大(200GM)，荧光量子产率高，使其双光子活性吸收截面也大。多数荧光染料在增大密度(浓度)时，会出现荧光淬灭，但萘酰亚胺因其具有很大的Stokes位移(100nm以上)，不会发生这种现象。以萘酰亚胺为荧光团的双光子荧光探针越来越引起人们的关注，不过多数萘酰亚胺化合物水溶性较差，仍然需要溶解在水和有机溶剂的混合溶剂中使用，并且具有细胞毒性。因此，开发性能优良的萘酰亚胺类双光子荧光染料是研发用于生物学、诊断医学等领域应用的双光子荧光染料的一个有效途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种萘酰亚胺双光子荧光染料、其制备方法和应用，该萘酰亚胺化合物具有双光子吸收特性，水溶性好，生物相容性好，毒性低，染色时间短，可用于细胞核、溶酶体成像，且可实现非固定的活细胞染色及成像，并且细胞内成像时无渗漏现象。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种萘酰亚胺化合物，该萘酰亚胺化合物的结构如通式Ⅰ所示：
通式Ⅰ
a)通式Ⅰ中，PEI是通式Ⅱ所示的支化PEI或通式Ⅲ所示的线型PEI，分子量不超过3000；
b)通式Ⅰ中，R1选自以下取代基团：(1)式中：m＝1～16；(2)式中：m＝1～4，R2和R3分别选自C1～C6的烷基中一种；
通式Ⅱ
通式Ⅲ
一实施例中：所述PEI分子量为800，1200，2000或2500；PEI分子量过大会具有一定毒性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
上述萘酰亚胺化合物的制备方法，包括：
1)将4-溴-1,8-萘酐与含有R1基团的脂肪胺按照1:1～1.1的摩尔比加入至适量乙醇中，加热回流1～4h，得到中间体M；
2)取所述PEI与过量的中间体M反应：取已预先除去水分的PEI溶于适量正丁醇；将过量的中间体M溶于适量三氯甲烷，再用正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液逐滴滴入至处于加热回流的上述含有PEI的正丁醇中；滴加完毕后，继续加热回流10～12h；中间体M过量是由于PEI与产物不易分离，需要使PEI完全反应；而将中间体溶液逐滴滴入至含有PEI的正丁醇中，则可以使得每次都是少量的中间体M和大大过量的PEI反应，从而保证反应顺利、充分地进行，进一步确保PEI能够被完全反应掉；
3)将步骤2)得到的的反应液浓缩后，加水稀释，固液分离，弃去固体部分即未反应完全的中间体M；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体M；合并滤液，浓缩，干燥，即得产物T，即为所述之萘酰亚胺化合物。
合成路线如下式所示：
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
上述萘酰亚胺化合物作为荧光染料的应用。
特别是，上述萘酰亚胺化合物作为双光子荧光染料的应用。
一实施例中：所述应用为细胞、组织、器官、动物体的染色和/或成像。
一实施例中：所述细胞为非固定的活细胞。
一实施例中：所述双光子荧光染料在细胞内定位于细胞核和/或溶酶体。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明提供了一种具有双光子吸收特性、水溶性好的萘酰亚胺类化合物，可以作为双光子荧光染料，并且提供了这类化合物的制备方法，简便易行可重复。
2.萘酰亚胺的两个羰基具有强吸电子能力，在其4位引入助色团后，形成一个分子内推拉电子共轭体系，能发出明亮的荧光。聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)是一种水溶性高分子聚合物，包括支化(branched PEI,bPEI)和线型(linear PEI,lPEI)两种结构，相对分子量从数百至几十万不等，无论哪种结构其基本骨架每三个原子中就含有一个氨基，这使得PEI拥有极强的给电子能力，呈现弱碱性。PEI具有良好的转染效率，作为非病毒基因载体被广泛研究，经基因载体研究证实安全、无毒。本发明把水溶性的低分子量PEI偶联到萘酰亚胺的4位，作为给电子基团、助色团，并作为定位基团，利用PEI的弱碱性导致的趋酸性，使其可以定位于溶酶体，使染料可以在细胞内特定部位累积、成像，并改善染料的水溶性。此外，这种偶联方式制得的染料可以避免在细胞染色、成像时出现渗漏现象。
3.本发明的萘酰亚胺化合物可以作为荧光染料，在单光子、双光子激发下在非固定的活细胞的细胞核、溶酶体染色成像，也可以在固定细胞的细胞核、溶酶体染色成像，且无渗漏现象。现有的多数荧光染料只能应用于固定细胞样品染色，无法在非固定的活细胞中成像，而这种固定的方法对细胞和组织真实形态的观察往往会带来负面影响，并且不同固定细胞方法会产生不同的研究结果；而本发明的萘酰亚胺化合物在非固定的活细胞中也能取得良好的染色、成像效果，因而能够如实准确地检测细胞结构，研究细胞内的动态过程以及分子的细胞定位等；实验操作也更方便快捷。
4.本发明的萘酰亚胺化合物容易进入细胞，染色时间短，与细胞共孵育5分钟后即可染色成像，与细胞共孵育24小时后对细胞依然无毒性，染色、成像效果与染色5分钟时相同，说明本发明的萘酰亚胺化合物毒性较小。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是实施例1和2中得到的萘酰亚胺化合物T-1、T-2在不同激发波段的双光子吸收光谱图。图中横坐标(Wavelength/nm)表示测试时使用的激发波长(单位为nm)，纵坐标(δ/GM)表示化合物在对应的激发波长下的双光子吸收截面积(单位GM)。
图2是实施例1中得到的萘酰亚胺化合物T-1在Hela细胞中用激光扫描共聚焦显微镜成像图，其中左图为T-1成像图(染色时间1h，激发通道488nm)，T-1在细胞核外呈现点状分布(黑白图片中呈白色亮点的部分)，显示明亮的绿色荧光，推断可能定位于溶酶体；中图为商品化溶酶体染料Red DND-99成像图(染色时间5min，激发通道543nm)，与T-1有相似的细胞分布情况(图2中图黑白图片中呈白色亮点的部分)，显示明亮的红色荧光；右图为两个图叠加拟合成像图，呈现黄色荧光、点状分布(图2右图黑白图片中呈白色亮点的部分)，表明左图和中图两图可以很好的叠加，证明T-1能够实现溶酶体成像。
图3是实施例1中得到的萘酰亚胺化合物T-1在Hela细胞中用双光子共聚焦显微镜成像图(染色时间1h，激发通道900nm)，其中左一为T-1双光子激发成像图，与激光扫描共聚焦显微镜有相似的成像现象，T-1在细胞核外呈现点状分布，显示明亮的绿色荧光，并且实际成像效果明显好于激光扫描共聚焦成像，表明T-1具有良好的双光子成像能力。左二为商品化溶酶体染料Red DND-99单光子激发成像图(染色时间5min，激发通道543nm)，与T-1成像情况相似，在细胞核外呈现点状分布，显示明亮的红色荧光。右二为DAPI单光子激发成像图(黑白图片中白色部分即细胞核。染色时间24h，激发通道405nm)，染色细胞核，显示明亮的蓝色荧光。右一为前三个图(即T-1、Lyso和DAPI成像图)叠加拟合成像图，黑白图片亮色包围的中间部分为细胞核显示DAPI的蓝色荧光，亮白的部分为T-1和Lyso叠加区域呈现明亮的黄色荧光，进一步证明T-1定位于细胞溶酶体。
图4是实施例2中得到的萘酰亚胺化合物T-2在Hela细胞中用激光扫描共聚焦显微镜成像图，其中两张左图为T-2成像图(染色时间1h，激发通道488nm)，T-2分布在整个细胞核内(图4左图黑白图片中亮白色部分)，呈现绿色荧光；两张中图为DAPI成像图(染色24h，激发通道405nm)，DAPI仅分布于细胞核外周呈现蓝色荧光，似乎包围在T-2染色范围的外周；两张右图为左图与中图叠加拟合成像图，可以看到DAPI的蓝色完全包围在T-2呈现的绿色外周，用黑白图片显示即为白色部分，表明T-2进入细胞核。
图5是实施例2中得到的萘酰亚胺化合物T-2在Hela细胞中用双光子共聚焦显微镜成像图，其中左图为T-2成像图(染色时间1h，激发通道900nm),与激光扫描共聚焦显微镜有相似的成像现象，T-2分布在细胞核、显示明亮的绿色荧光，并且实际成像效果明显好于激光扫描共聚焦成像，证明染料T-2确实能够实现双光子激发成像；中图为DAPI单光子激发成像图(染色24h，激发通道405nm)，分布于细胞核显示蓝色荧光；右图为两个图叠加拟合成像图，中间亮色部分为DAPI的蓝色荧光和T-2的绿色荧光叠加后呈现蓝、黄、绿混杂三色，进一步证明T-2定位于细胞核。
图6是实施例1中得到的萘酰亚胺化合物T-1在MCF-7中单、双光子激发成像图(染色时间5min，单光子405nm激发480～580nm采集，双光子810nm激发，520～580nm采集)。上面三张图为单光子激发成像图，上左、上右两图为T-1成像图，显示明亮的绿色荧光；下面三张图为双光子激发成像图，与单光子激发成像图完全相同；中上、中下两张图分别为单、双光子激发下白光细胞图片。
图7是实施例1中得到的萘酰亚胺化合物T-1在MCF-7中单、双光子激发成像图，染色时间24h(单光子405nm激发480～580nm采集，双光子810nm激发520～580nm采集)。上面三张图为单光子激发成像图，上左、上右两图为T-1成像图，显示明亮的绿色荧光；下面三张图为双光子激发成像图，与单光子激发成像图完全相同，与染色5min时的成像图完全相同；中上、中下两张图分别为单、双光子激发下白光细胞图片。
图8是实施例2中得到的萘酰亚胺化合物T-2在MCF-7中单、双光子激发成像图，染色时间5min(单光子405nm激发480～580nm采集，双光子810nm激发520～580nm采集)。上面三张图为单光子激发成像图，上左、上右两图为T-1成像图，显示明亮的绿色荧光；下面三张图为双光子激发成像图，与单光子激发成像图完全相同；中上、中下两张图分别为单、双光子激发下白光细胞图片。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1：4-支化PEI-N-丁基-1,8-萘酰亚胺(T-1)
本实施例提供了一种萘酰亚胺化合物4-支化PEI-N-丁基-1,8-萘酰亚胺(以下用T-1表示)，其结构如下式所示；其中，PEI为分子量2000的支化PEI；
其制备方法如下：
1)在圆底烧瓶中加入4-溴-1,8-萘酐(542mg,2mmol)、正丁胺(205μl,2.1mmol)加入至乙醇(150ml)中，80℃加热回流3h后，将反应液浓缩沉淀、过滤得到黄色固体，即为中间体M-1，分子量331，产率90％；M-1的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.65(dd,J＝8.0Hz和0.8Hz,1H),8.56(d,J＝8.0Hz,1H),8.41(d,J＝8.0Hz,1H),8.03(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(t,J＝8.0Hz,1H),4.18(t,J＝8.0Hz,2H),1.74–1.68(m,2H),1.45–1.40(m,2H),0.98(t,J＝8.0Hz,3H)。
2)取支化PEI(MW＝2000)0.126g与过量的中间体M-1反应：
支化PEI与中间体M-1所需的量的计算方式如下：
使用分子量2000的支化PEI，其每个单元的分子量为43，其中的叔胺不能参与反应，假设伯胺和仲胺均参与反应(事实上由于位阻伯胺、仲胺不可能完全反应)，则(2000÷43)×(3÷4)＝34.88≈35，表示分子量2000的PEI中有近似35个胺基可能与中间体M-1反应。那么需要的M-1的质量就是{[0.126÷2000(结果为称量的PEI的摩尔量)]×35(计算的结果为中间体的摩尔分数)}×331(中间体的摩尔质量)＝0.7299。或者可以采用更简单的粗略计算方法，用称量的PEI质量除以2000得到摩尔量，2000除以PEI每个单元的分子量43得到含有基本单位的个数，摩尔量乘以基本单元个数就是PEI中能反应的胺的摩尔量再乘以中间体M-1的摩尔质量就估算出需用的M-1质量:(0.126÷2000)×(2000÷43)＝0.00293,0.00293×331＝0.9699。考虑PEI中的胺基由于位阻的关系，不可能都参加反应，中间体多加可以保证PEI中可以反应的基团全部反应完毕，所以称取1g中间体M-1，即可保证中间体M-1过量。线型PEI计算原理同上，在此不加以详细叙述。
本实施例之中，取已预先经冷冻干燥除去水分的分子量2000的支化PEI 0.126g溶于4ml正丁醇；将过量的中间体M-11g溶于1ml三氯甲烷，再用25ml正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液用微量注射泵(型号为KDS series 100single-single pump)在14h内逐滴滴入至100～130℃加热回流的上述含有PEI的正丁醇中，这样实际形成少量的M-1和大大过量的PEI反应，保证反应顺利进行；滴加完毕后，继续在100～130℃加热回流10h；
3)将步骤2)得到的的反应液旋蒸浓缩后，得到粘稠的溶液，加少量水稀释复溶，离心过滤，弃去固体部分即未反应完全的中间体M-1；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体M-1；合并滤液，浓缩，冷冻干燥，即得产物，即为所述之萘酰亚胺化合物4-支化PEI-N-丁基-1,8-萘酰亚胺(T-1)。
实施例2：4-支化PEI-N-(N,N-二甲基乙二胺)-1,8-萘酰亚胺(T-2)
本实施例提供了一种萘酰亚胺化合物4-支化PEI-N-(N,N-二甲基乙二胺)-1,8-萘酰亚胺(以下用T-2表示)，其结构如下式所示；其中，PEI为分子量2000的支化PEI；
其制备方法如下：
1)在圆底烧瓶中加入4-溴-1,8-萘酐(542mg,2mmol)、N,N-二甲基乙二胺(230μl,2.1mmol)加入至乙醇(150ml)中，80℃加热回流3h后，将反应液浓缩沉淀、过滤得到黄色固体，即为中间体M-2，产率88％；M-2的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.66(dd,J＝7.2Hz和1.2Hz,1H),8.57(dd,J＝8.0Hz和0.8Hz,1H),8.41(d,J＝8.0Hz,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(t,J＝8.0Hz,1H),4.32(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(t,J＝7.2Hz,2H),2.35(s,6H)。
2)取支化PEI(MW＝2000)0.132g与过量的中间体M-2反应：计算原理同实施例1；
取已预先经冷冻干燥除去水分的分子量2000的支化PEI 0.132g溶于4ml正丁醇；将过量的中间体M-21.065g溶于1ml三氯甲烷，再用25ml正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液用微量注射泵(型号为KDS series 100single-single pump)在14h内逐滴滴入至100～130℃加热回流的上述含有PEI的正丁醇中，这样实际形成少量的M-2和大大过量的PEI反应，保证反应顺利进行；滴加完毕后，继续在100～130℃加热回流10h；
3)将步骤2)得到的的反应液旋蒸浓缩后，得到粘稠的溶液，加少量水稀释复溶，离心过滤，弃去固体部分即未反应完全的中间体M-2；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体M-2；合并滤液，浓缩，冷冻干燥，即得产物，即为所述之萘酰亚胺化合物4-支化PEI-N-(N,N-二甲基乙二胺)-1,8-萘酰亚胺(T-2)。
实施例3：4-支化PEI-N-正十六胺基-1,8-萘酰亚胺(T-3)
本实施例提供了一种萘酰亚胺化合物4-支化PEI-N-正十六胺基-1,8-萘酰亚胺(以下用T-3表示)，其结构如下式所示；其中，PEI为分子量2000的支化PEI；
其制备方法如下：
1)在圆底烧瓶中加入4-溴-1,8-萘酐(542mg,2mmol)、正十六烷胺(507mg,2.1mmol)加入至乙醇(150ml)中，80℃加热回流3h后，将反应液浓缩沉淀、过滤得到黄色固体，即为中间体M-3，产率85％；M-3的1H NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.67(d,J＝6.4Hz,1H),8.57(d,J＝8.4Hz,1H),8.41(d,J＝7.6Hz,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(t,J＝7.6Hz,1H),4.16(t,J＝7.6Hz,2H),1.76–1.26(m,28H),0.88(t,J＝6.4Hz,3H)。
2)取支化PEI(MW＝2000)0.132g与过量的中间体M-3反应：计算方式同上；
取已预先经冷冻干燥除去水分的分子量2000的支化PEI 0.132g溶于4ml正丁醇；将过量的中间体M-31.534g溶于1ml三氯甲烷，再用25ml正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液用微量注射泵(型号为KDS series 100single-single pump)在20h内逐滴滴入至100～130℃加热回流的上述含有PEI的正丁醇中，这样实际形成少量的M-3和大大过量的PEI反应，保证反应顺利进行；滴加完毕后，继续在100～130℃加热回流10h；
3)将步骤2)得到的的反应液旋蒸浓缩后，得到粘稠的溶液，加少量水稀释复溶，离心过滤，弃去固体部分即未反应完全的中间体M-3；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体M-3；合并滤液，浓缩，冷冻干燥，即得产物，即为所述之萘酰亚胺化合物4-支化PEI-N-正十六胺基-1,8-萘酰亚胺(T-3)。
实施例4：4-线型PEI-N-丁基-1,8-萘酰亚胺(T-4)
本实施例提供了一种萘酰亚胺化合物4-线型PEI-N-丁基-1,8-萘酰亚胺(以下用T-4表示)，其结构如下式所示；其中，PEI为分子量2500的线型PEI；
其制备方法如下：
1)按照实施例1中步骤1)的方法制备得到中间体M-1；
2)取线型PEI(MW＝2500)0.126g与过量的中间体M-1反应：计算方式同上；
取已预先经冷冻干燥除去水分的分子量2500的线型PEI 0.132g溶于4ml正丁醇；将过量的中间体M-11.0g溶于1ml三氯甲烷，再用25ml正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液用微量注射泵(型号为KDS series 100single-single pump)在14h内逐滴滴入至100～130℃加热回流的上述含有PEI的正丁醇中，这样实际形成少量的M-1和大大过量的PEI反应，保证反应顺利进行；滴加完毕后，继续在100～130℃加热回流10h；
3)将步骤2)得到的的反应液旋蒸浓缩后，得到粘稠的溶液，加少量水稀释复溶，离心过滤，弃去固体部分即未反应完全的中间体M-1；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体M-1；合并滤液，浓缩，冷冻干燥，即得产物，即为所述之萘酰亚胺化合物4-线型PEI-N-丁基-1,8-萘酰亚胺(T-4)。
上述实施例可实现下述实验例之效果：
实验例1：双光子吸收光谱测定
方法：利用Z-扫描方式测量了本发明的萘酰亚胺化合物的双光子吸收光谱。测试体系是一个飞秒激光***(Coherent,Inc.)，双光子荧光采用Ti:Sapphire Mira 900-F锁模激光器发出的激光脉冲作为辐照光源(峰值波长调节到800nm，重复频率76MHz，平均功率≈1.1W，脉冲宽度200fs)，Nd3+:YAG倍频激光泵浦(Verdi-10)，放大器(Legend Elite USP)。
图1是实施例1和2中得到的萘酰亚胺化合物T-1、T-2在不同激发波段的双光子吸收光谱图。图中横坐标(Wavelength/nm)表示测试时使用的激发波长(单位为nm)，纵坐标(δ/GM)表示化合物在对应的激发波长下的双光子吸收截面积(单位GM)。由图中数据可以确定化合物T-1和T-2具有良好的双光子吸收特性，分别在810nm和830nm处具有最大双关子吸收截面积，数值分别为369GM和216GM，可以利用双光子激光激发成像，并且化合物T-1的双光子吸收能力要强于化合物T-2。
染料的荧光量子效率在DMSO溶液中测量，硫酸奎宁作为标准化合物，按下列公式进行计算。式中:Φ(Sample),Φ(Standard)分别表示待测化合物和标准化合物的荧光量子产率；Abs(Standard)、Abs(Sample)分别表示待测化合物和标准化合物在激发波长下的最大吸收值；F(Sample)、F(Standard)分别表示待测化合物和标准化合物的荧光光强度。
ФF (sample)＝Ф(standard)×(Abs(standard)×F(sample))/(Abs(sample)×F(standard))
按上述方法测得化合物T-1和T-2的荧光量子产率分别为0.223和0.248，表明这些化合物激发后能够产生极强的荧光，适用于进行荧光成像。
实验例2：本发明的萘酰亚胺化合物在细胞中的染色
首先，用荧光显微镜考察本发明的萘酰亚胺化合物的细胞毒性，以确定染色时间、染色浓度。具体方法为：将生长状态良好、处于对数生长期的小细胞肺癌细胞株(NCI-H466)接种于96孔培养板中，培养基为DMEM(含10％胎牛血清)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养14h。加入实施例1或实施例2的萘酰亚胺化合物溶液使其终浓度分别为1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL，与细胞分别共孵育30min，2h，6h，24h。未加药的细胞培养液为对照组。通过镜检细胞存活情况，确定染色浓度、染色时间。
结果显示：萘酰亚胺化合物终浓度小于1mg/mL时与细胞共孵育24h，细胞存活状况良好。其它种类细胞[子***细胞(HeLa)、乳腺癌细胞株(MCF-7)]依照此法考察本发明的萘酰亚胺化合物对它们的染色浓度及染色时间。
其次，用激光共聚焦(单光子成像)、双光子共聚焦显微镜考察本发明的萘酰亚胺化合物在细胞内定位、成像。具体方法为：将生长状态良好、处于对数生长期的Hela细胞接种于共聚焦专用测试皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养6～8h。镜检合格，分别加入实施例1或实施例2的萘酰亚胺化合物T-1或T-2与细胞共孵育5min、1h和24h。距离预计孵育结束时间差5min时在含有染料T-1的细胞培养皿中加入商品化溶酶体染料RedDND-99(Lyso)，继续共孵育5min，吸掉培养基，用HBS缓冲液洗涤3次进行成像。证明T-2定位于细胞核需要用DAPI工作液与T-2共染细胞，DAPI很难进入活细胞，染色时间通常为24h。染色完毕操作同上面介绍的，即吸净培养基后用HBS洗去染料，拍照成像。成像时染料T-1、T-2均用488nm通道激发成像；染料Lyso用543nm通道激发成像，拍照尽量快，避免长时间拍照导致光漂白；DAPI用405nm激发，主要参数均为63×物镜。T-1和T-2双光子共聚焦显微镜拍照方式类同与激光共聚焦拍摄成像，激发波长根据使用的仪器不同做相应的调整，参照仪器说明书使用。商品化染料Red DND-99和DAPI无法实现双光子成像。本发明染料在其它种类细胞如MCF-7细胞的成像方式与此法相同。
结果显示：
1、由图2(实施例1中染料T-1在HeLa细胞中激光共聚焦显微镜成像图，染色时间1h)可以发现染料T-1在细胞核外呈现点状分布(图2左图黑白图片中呈白色亮点的部分)，显示明亮的绿色荧光，推断可能定位于溶酶体；商品化染料Red DND-99与T-1有相似的细胞分布情况(图2中图黑白图片中呈白色亮点的部分)，显示明亮的红色荧光。该染料不能长时间与细胞共孵育，在该染色浓度下有细胞毒性。拍照时间在3min左右，时间再长会产生光漂白；图2右图是T-1和溶酶体染料Lysol成像图用仪器上的软件叠加拟合后的成像图，呈现黄色荧光、点状分布(图2右图黑白图片中呈白色亮点的部分)，表明两图可以很好的叠加、证明染料T-1能够实现溶酶体成像。
2、由图3中左图(实施例1中染料T-1在HeLa细胞中双光子共聚焦显微镜成像图，染色时间1h)可以看到与激光扫描共聚焦显微镜相似的成像现象，T-1在细胞核外呈现点状分布，显示明亮的绿色荧光，并且实际成像效果明显好于激光扫描共聚焦成像，证明染料T-1确实能够实现双光子激发成像。图3中左2图是溶酶体染料Lysol成像图，与图2中图成像效果相似-细胞核外点状分布显示红色荧光。左3图是DAPI成像图，黑白图片中白色部分即细胞核。最右边的图是左边三张图(T-1、Lyso和DAPI成像图)叠加图，黑白图片亮色包围的中间部分为细胞核显示DAPI的蓝色荧光，亮白的部分为T-1和Lyso叠加区域呈现明亮的黄色荧光，进一步证明T-1定位于细胞溶酶体。
需要说明的是，Lyso和DAPI这两种染料无法实现双光子成像，只能使用单光子激发成像，所以三种染料成像时需要分别用单、双光子去激发，光轴无法完全重叠，所以叠加的图片无法像激光扫描共聚焦成像图那样完全重叠。
3、由图4(实施例2中染料T-2在HeLa细胞中激光共聚焦显微镜成像图,染色时间1h)可以发现染料T-2分布在整个细胞核内(图4左图黑白图片中亮白色部分)，呈现绿色荧光；DAPI仅分布于细胞核外周呈现蓝色荧光，似乎包围在T-2染色范围的外周(图4中图黑白图片中亮色部分)；右图为左边两图拟合叠加的图像，可以看到DAPI的蓝色完全包围在T-2呈现的绿色外周，用黑白图片显示即为白色部分，表明染料T-2进入细胞核。
4、由图5中左图(实施例2中染料T-2在HeLa细胞中双光子共聚焦显微镜成像图，染色时间1h)可以看到与激光扫描共聚焦显微镜相似的成像现象，T-2分布在细胞核、显示明亮的绿色荧光，并且实际成像效果明显好于激光扫描共聚焦成像，证明染料T-2能够实现双光子激发成像。图5中图是DAPI成像图(与图3中右图成像效果相似)，在细胞核内呈蓝色荧光。最右图为左边两图(T-2和DAPI成像图)叠加拟合的图像，中间亮色部分为DAPI的蓝色荧光和T-2的绿色荧光叠加后呈现蓝、黄、绿三色，进一步证明T-2定位于细胞核。
需要说明的是，T-2双光子成像同样存在上述商品化染料DAPI无法双光子成像，单、双光子分别激发时光轴无法完全重合，叠加的图像无法像激光扫描共聚焦成像图那样完全重叠的问题。
5、图6和图7分别是实施例1中得到的萘酰亚胺化合物T-1在MCF-7中染色5min和24h后单、双光子激发成像图。图8是实施例2中得到的萘酰亚胺化合物T-2在MCF-7中染色5min后单、双光子激发成像图。由此可以确定：T-1能长时间染色，细胞毒性小；T-1、T-2单、双光子激发成像效果一致；可以在多种细胞中实现染色、成像。
6、DAPI用于活细胞染色需要较长时间，通常24h左右，而本发明的萘酰亚胺化合物染色5min即可以细胞核成像，并且可以实现双光子成像。
本领域技术人员可知，当本发明的技术参数在如下范围内变化时，可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果：
一种萘酰亚胺化合物，该萘酰亚胺化合物的结构如通式Ⅰ所示：
通式Ⅰ
a)通式Ⅰ中，PEI是通式Ⅱ所示的支化PEI或通式Ⅲ所示的线型PEI，分子量不超过3000；
b)通式Ⅰ中，R1选自以下取代基团：(1)式中：m＝1～16；(2)式中：m＝1～4，R2和R3分别选自C1～C6的烷基中一种；
通式Ⅱ
通式Ⅲ
所述PEI分子量为800，1200，2000或2500。
上述的萘酰亚胺化合物的制备方法，包括：
1)将4-溴-1,8-萘酐与含有R1基团的脂肪胺按照1:1～1.1的摩尔比加入至适量乙醇中，加热回流1～4h，得到中间体；
2)取所述PEI与过量的中间体反应：取已预先除去水分的PEI溶于适量正丁醇；将过量的中间体溶于适量三氯甲烷，再用正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液逐滴滴入至处于加热回流的上述含有PEI的正丁醇中；滴加完毕后，继续加热回流10～12h；
3)将步骤2)得到的的反应液浓缩后，加水稀释，固液分离，弃去固体部分即未反应完全的中间体；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体；合并滤液，浓缩，干燥，即得产物，即为所述之萘酰亚胺化合物。
上述的萘酰亚胺化合物作为荧光染料的应用。
上述的萘酰亚胺化合物作为双光子荧光染料的应用。
所述应用为细胞、组织、器官、动物体的染色和/或成像。
所述细胞为非固定的活细胞。
所述双光子荧光染料在细胞内定位于细胞核和/或溶酶体。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种萘酰亚胺化合物，其特征在于：该萘酰亚胺化合物的结构如通式Ⅰ所示：
a)通式Ⅰ中，PEI是通式Ⅱ所示的支化PEI或通式Ⅲ所示的线型PEI，分子量不超过3000；
b)通式Ⅰ中，R1选自以下取代基团：(1)-(CH2)m-CH3，式中：m＝0～15；(2) 式中：m＝1～4，R2和R3分别选自C1～C6的烷基中一种；
。
2.根据权利要求1所述的萘酰亚胺化合物，其特征在于：所述PEI分子量为800，1200，2000或2500。
3.根据权利要求1或2所述的萘酰亚胺化合物的制备方法，其特征在于：包括：
1)将4-溴-1,8-萘酐与含有R1基团的脂肪胺按照1:1～1.1的摩尔比加入至适量乙醇中，加热回流1～4h，得到中间体；
2)取所述PEI与过量的中间体反应：取已预先除去水分的PEI溶于适量正丁醇；将过 量的中间体溶于适量三氯甲烷，再用正丁醇稀释，得到中间体溶液；将中间体溶液逐滴滴入至处于加热回流的上述含有PEI的正丁醇中；滴加完毕后，继续加热回流10～12h；
3)将步骤2)得到的反应液浓缩后，加水稀释，固液分离，弃去固体部分即未反应完全的中间体；重复上述浓缩-稀释-固液分离步骤若干次以完全去除未反应的中间体；合并滤液，浓缩，干燥，即得产物，即为所述萘酰亚胺化合物。
4.根据权利要求1或2所述的萘酰亚胺化合物作为荧光染料的应用。
5.根据权利要求1或2所述的萘酰亚胺化合物作为双光子荧光染料的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述应用为细胞、组织、器官、动物体的染色和/或成像。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述细胞为非固定的活细胞。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双光子荧光染料在细胞内定位于细胞核和/或溶酶体。
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