CN105535990A - 一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列,是通过调节亲水配位体硫辛酸三聚乙二酰胺和疏水配位体硫辛酸正九酰胺的相对比例,并使所述配位体分子通过金硫键共价作用与金纳米颗粒连接后制得。本发明还公开了所述金纳米颗粒阵列在研究纳米颗粒与小鼠骨髓来源的树突状细胞相互作用并且可以指导作为药物载体以及免疫药物佐剂方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种金纳米颗粒阵列及其应用,尤其涉及一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其应用;属表面功能化修饰的纳米材料及其应用技术领域。
背景技术
纳米材料以其独特的物理化学性质如不同的尺寸、形貌、大的比表面积以及不同的表面化学修饰等特点使它具有广泛的应用。特别是在生物医药领域,普遍应用到疫苗佐剂、生物成像、纳米载药、纳米传感等方面,但同时纳米材料的广泛应用可能会产生基因毒性、细胞毒性、组织器官毒性及产生免疫反应等一些负面影响。其中纳米材料的表面化学在其与生物体相互作用过程中起着重要的作用,而表面修饰配位体的亲疏水性、电荷密度、氢键性质、π-键密度、空间位阻结构等都是影响其作用的重要因素。
免疫***作为人体的第一道防线,可以阻挡外来物质的入侵,并且敏锐识别外来物质后做出有效的抵抗措施。树突状细胞是目前认为最主要的专职抗原递呈细胞,是连结固有性免疫反应和适应性免疫反应的重要桥梁。他们存在于皮肤、肺部以及体腔等有利于吞噬抗原及呈递抗原的部位。未成熟的抗原递呈细胞有很强的吞噬作用,吞噬抗原后,吞噬能力丧失,转变成活化的抗原递呈细胞,表现出很强的抗原递呈能力。活化的抗原递呈细胞的标志是其细胞膜上表达CD11c,组织相容性分子MHCII,以及表达各种共刺激分子CD40,CD80,CD86等。活化的树突状细胞可以迁移到***,使T细胞产生特异性反应。活化的树突状细胞和巨噬细胞可以产生各种细胞因子和化学因子引起免疫反应。目前,金纳米颗粒经表面化学修饰后的免疫毒性及调节功能尚不明确,采用免疫***中有重要地位的抗原递呈细胞(树突状细胞)研究金纳米颗粒的功能化修饰与抗原递呈细胞的免疫效应的关系显得尤为有价值。
经检索,有关表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其对树突状细胞的免疫调节或其在药物载体以及免疫药物佐剂制备方面的应用还未见报道。
发明内容
针对现有纳米材料表面化学修饰及应用存在的不足,本发明的目的在于提供一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其对树突状细胞的免疫调节或其在药物载体以及免疫药物佐剂制备方面的应用。
本发明所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列,是通过调节亲水配位体和疏水配位体的相对比例,并使所述配位体分子与金纳米颗粒连接后制得;
其特征在于:
所述阵列中亲水配位体是硫辛酸三聚乙二酰胺,疏水配位体是硫辛酸正九酰胺,配位体分子通过金硫键共价作用与金纳米颗粒连接依次形成8种平均粒径为5.0±0.2纳米的金纳米颗粒,分别以GNP-1、GNP-2、GNP-3、GNP-4、GNP-5、GNP-6、GNP-7、GNP-8表示,该8种金纳米颗粒共同组成球形金纳米颗粒阵列;其中GNP-1表面连接有100%单配位体分子硫辛酸三聚乙二酰胺,GNP-8表面连接有100%单配位体分子硫辛酸正九酰胺,GNP-2、GNP-3、GNP-4、GNP-5、GNP-6或GNP-7表面连接有双配位体分子硫辛酸三聚乙二酰胺与硫辛酸正九酰胺,其中硫辛酸三聚乙二酰胺相对硫辛酸正九酰胺的比例GNP-2至GNP-7呈现连续依次降低变化,但其相对比例之和为100%;所述球形金纳米颗粒阵列表面亲疏水性呈单一变化,用logP指数表征亲疏水性的大小,GNP-1至GNP-8依次为:-1.43511,-1.03967,-0.41074,-0.19551,0.174569,0.376064,1.241267,1.621869,其中logP指数越负,表示亲水性越强,logP指数越正,表示疏水性越强。金纳米颗粒阵列示意图见图1。
本发明所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列在制备针对树突状细胞的免疫调节制剂中的应用。
本发明所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列在制备药物载体以及免疫药物佐剂中的应用。
为了更好地理解本发明的实质和它的应用价值,下面用金纳米颗粒的制备实验及其表征结果和金纳米颗粒阵列与树突状细胞的相互作用来说明金纳米颗粒在药物载体以及免疫药物佐剂制备方面的应用。
1.金纳米颗粒阵列配位体及金纳米颗粒的制备:
选择硫辛酸作为与金纳米颗粒相连的链接分子,另一端选择了三聚乙二胺和正九胺作为亲疏水性质的调节分子,通过酰胺反应制备硫辛酸三聚乙二酰胺(配体1)和硫辛酸正九酰胺(配体2)两种配位体。
将单配位体(配体1和2)分子或者不同比例的双配位体(硫辛酸三聚乙二酰胺/硫辛酸正九酰胺)分子溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后将氯金酸加到此溶液中并在室温下搅拌30分钟,再将硼氢化钠的水溶液滴加入其中,在室温下继续搅拌4小时。所得的金纳米颗粒溶液用离心洗涤的方法进行纯化,即得到表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒。
2.金纳米颗粒的形貌分析:
将制备的全部球形金纳米颗粒进行透视电子显微镜的观察。在透视电子显微镜下观察到的金纳米颗粒形貌,结果如图2所示:金纳米颗粒为粒径为5.0纳米左右的球形金纳米颗粒。
3.球形金纳米颗粒阵列的亲疏水性指数LogP的测定:
将正辛醇(优级纯)与高纯水等体积混合,搅拌24h,静置分层,分别取两相,保存备用。上层为水饱和的正辛醇溶液,下层为正辛醇饱和的水溶液。然后取一定量的表面亲疏水性质不同的球形金纳米颗粒溶液,加入正辛醇饱和的水溶液,超声混匀后,加入等体积的水饱和的正辛醇溶液。然后置于振摇器,25℃振摇24小时。
24小时后分别取两相真空干燥后用王水消解,ICP-MS测定油相(正辛醇层)和水相中Au的含量,利用公式logP=lg(Co/Cw)计算每种金纳米颗粒的亲疏水性指数logP的值。
结果见表1。
表1:金纳米阵列的亲疏水性指数LogP的测定结果
亲疏水性指数 | |
GNP-1 | -1.43511 |
GNP-2 | -1.03967 |
GNP-3 | -0.41074 |
GNP-4 | -0.19551 |
GNP-5 | 0.174569 |
GNP-6 | 0.376064 |
GNP-7 | 1.241267 |
GNP-8 | 1.621869 |
4.表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列用于研究纳米材料的细胞存活率:
分离和纯化小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。
BMDC细胞培养在含胎牛血清、抗生素、丙酮酸钠、HEPES、非必需氨基酸和β-巯基乙醇的1640培养液中。
将BMDC细胞接种在96孔板中,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育24小时后补加100μL含有本发明所述金纳米颗粒阵列材料的新鲜培养基,处理24小时后以celltiter方法检测细胞的存活率(操作步骤参照celltiter说明书),每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
结果见图3。
5.表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列用于研究纳米材料对树突状细胞的活化影响:
将BMDC细胞接种于12孔板中,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育24小时后补加1mL含有本发明所述金纳米颗粒阵列材料的新鲜培养液,处理24小时后收集细胞,用MHCII-FITC和CD86-FITC两种抗体在4℃条件下标记细胞膜上的蛋白分子,然后用流式细胞仪检测标记的荧光强度,每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
分析结果见图4,图5(*p<0.05,代表实验组与对照组有差异性,**p<0.001,代表实验组与对照组有显著性差异)。
6.表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列用于研究纳米材料对树突状细胞的炎症效应:
将BMDC细胞接种在96孔板中,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育24小时后补加100μL含有本发明所述金纳米颗粒阵列材料的新鲜培养基,处理一定时间后以ELISA方法检测细胞产生的炎症因子TNF-α和IL-12(操作步骤参照ELISA说明书),每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
结果见图6,图7(*p<0.05,代表实验组与对照组有差异性,**p<0.001,代表实验组与对照组有显著性差异)。
由以上实验结果可以得出以下结论:
根据透射电镜结果,我们可以看出金纳米颗粒的粒径都在5纳米左右(见图2),同时我们通过测Logp的数值对纳米材料的亲疏水性进行了表征(见表1),可以看出,我们成功制备了表面亲疏水性差异化的金纳米颗粒阵列。
本发明制备表面亲疏水性差异化的金纳米颗粒阵列由8种金纳米颗粒组成,这些纳米颗粒亲疏水性质不同,在与细胞发生相互作用时表现出不同的作用,所以可以得出以下结论:亲疏水性质影响纳米材料与细胞之间的相互作用,纳米颗粒越疏水对树突状细胞的活化越明显(图4、图5),纳米颗粒越疏水对树突状细胞的促炎效果越明显(图6、图7)。由此可实现研究纳米颗粒与细胞之间的作用机制,还可以指导作为药物载体,药物佐剂等应用于生物医学领域的设计。
附图说明
图1:本发明所述表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列示意图。
图2:制备的金纳米颗粒粒径表征。其中:
a:为GNP-1在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
b:为GNP-2在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
c:为GNP-3在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
d:为GNP-4在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
e:为GNP-5在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
f:为GNP-6在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
g:为GNP-7在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
h:为GNP-8在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm。
图3:表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列的细胞存活率。
图4,图5:表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列诱导细胞表面膜蛋白分子MHCII和CD86的表达。
图6,图7:表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列诱导细胞炎症因子TNF-α和IL-12的产生。
具体实施方式
实施例1
金纳米颗粒阵列的制备:
将单配位体分子或者不同比例的双配体(硫辛酸三聚乙二酰胺(配体1)和硫辛酸正九酰胺(配体2))分子(相关比例见表2)溶于DMF(6mL)中,然后将氯金酸(12.5mg,0.032mmol)加到此溶液中并在室温下搅拌30分钟。硼氢化钠(5.0mg,0.13mmol)的水溶液(6mL)滴加入其中。在室温下继续搅拌4小时。所得的金纳米颗粒溶液用透析(截留分子量3500)或者超滤(截留分子量5000)洗涤的方法进行纯化。
得到的金纳米颗粒阵列由8种金纳米颗粒组成,分别以GNP-1、GNP-2、GNP-3、GNP-4、GNP-5、GNP-6、GNP-7、GNP-8表示。
表2:金纳米颗粒阵列制备中配位体分子的投料比例
GNPs | 配体1 | 配体2 |
GNP-1 | 29.896μmol | 0μmol |
GNP-2 | 21.525μmol | 2.817μmol |
GNP-3 | 19.134μmol | 3.155μmol |
GNP-4 | 16.742μmol | 3.381μmol |
GNP-5 | 14.350μmol | 3.662μmol |
GNP-6 | 10.763μmol | 4.169μmol |
GNP-7 | 8.969μmol | 5.634μmol |
GNP-8 | 0μmol | 11.269μmol |
实施例2
用透射电子显微镜(TEM)对金纳米颗粒阵列进行形貌分析:
将八种金纳米材料分别进行透射电子显微镜的观察。在JEOL1200EX透射电子显微镜,电压80KV,AMT2kCCD镜头下观察到的金纳米颗粒形貌如图2所示,金纳米颗粒呈近似球形,平均粒径在5纳米左右。
实施例3
金纳米颗粒亲疏水性指数LogP的测定:
溶剂的预饱和:将正辛醇(优级纯)与高纯水等体积混合,搅拌24小时,静置分层,分别取两相,保存备用。上层为水饱和的正辛醇溶液,下层为正辛醇饱和的水溶液。
亲疏水性指数LogP的测定步骤如下:
1)取含0.1mgGNPs的样品溶液,置于5mL离心管中,加入正辛醇饱和的水溶液至总体积为1mL,超声混匀后,加入1mL水饱和的正辛醇溶液,缠好封口膜,置于振摇器,25℃振摇24小时。
2)振摇24小时后,将离心管取下,静置分层,待两相分离界线清晰(大约0.5-1.0h),用移液枪分别取出两相溶液,再将固定体积两相溶液(视浓度而定)分别加入到10mL比色管中,120℃真空干燥至溶剂完全挥发。
3)每支比色管中分别加入200μL新制王水,消解12小时后,加入高纯水,定容至5mL,酸度为4%。
4)配制标准曲线:根据计算的浓度范围,配制一系列浓度的标准溶液,保证酸度与样品一致。
5)用ICP-MS测定油相(正辛醇层)和水相中Au的含量,利用公式logP=lg(Co/Cw)计算每种金纳米颗粒的亲疏水性指数logP的值。结果见表1。
实施例4
分离小鼠骨髓来源的树突状细胞:
选取6-8周雄性C57小鼠,颈椎脱位法处死,将小鼠置于75%酒精中浸泡5~10min。无菌条件下取其股骨和胫骨,剪掉骨两端,用1mL注射器吸取冰冷的RPMI1640培养液反复冲洗含骨髓的骨干,收集冲洗液于15ml离心管中(以上都在冰上操作)。1500rpm,10min,离心,弃去上清,将收集的细胞用红细胞裂解液除去掺杂的红细胞,再用RPMI1640培养液洗两次。用全RPMI1640培养液悬浮细胞,并调整浓度为106个/mL,加入30ng/mL粒细胞巨噬细胞刺激因子,将细胞接种于10cm培养皿中,每皿10ml,置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,记为第0天;第3天,补加等量含30ng/mLGM-CSF的全RPMI1640培养液;第6天收集细胞,并用流式细胞仪检测细胞表面CD11c+的阳性表达率。
经检测细胞表面CD11c+的阳性表达率不小于80%,表明树突状细胞模型建立成功。
实施例5
细胞存活率的测定:
细胞培养在含10%胎牛血清、1%抗生素、1‰β-巯基乙醇、1%HEPES、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠、20ng/mlGM-CSF的全1640培养基中。细胞接种到96孔板里,密度为80万/孔,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中培养24小时,然后将100μL含本发明所述金纳米颗粒(50μg/mL,100μg/mL)的细胞培养基溶液添加到孔里,使金纳米颗粒阵列材料终浓度为25μg/mL,50μg/mL,于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育24小时,以celltiter方法检测细胞的存活率(操作步骤参照celltiter说明书),每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
结果见图3。
实施例6
金纳米材料对细胞膜表面活化蛋白分子(MHCII,CD86)影响:
将BMDC细胞接种在12孔板中,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中培养24小时后补加1mL含有本发明所述金纳米颗粒(100μg/mL)的新鲜培养基,使孔里的金纳米材料终浓度为50μg/mL,处理24小时后收集细胞,用含有2%FBS预冷的PBS漂洗2次,漂洗过程1500rpm×5min离心。并调节细胞浓度107个/ml,分装于1.5mLEP小管中,每管50μL,即每个样品50万细胞。每个样品中分别加入2μLMHCII-FITC和CD86-FITC待测抗体,于4℃条件下避光标记30min,每隔10min轻弹细胞。30min后用含有2%FBS预冷的PBS洗涤细胞1次,最终用400μL含2%FBS的PBS悬浮细胞,然后用流式细胞仪检测标记的荧光强度,每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
分析结果见图4,图5(*p<0.05,代表实验组与对照组有差异性,**p<0.001,代表实验组与对照组有显著性差异)。
实施例7
金纳米材料对细胞的促炎效应(TNF-α,IL-12):
将BMDC细胞接种在96孔板中,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中培养24小时后补加100μL含有本发明所述金纳米颗粒材料(50μg/mL,100μg/mL)的新鲜培养基,使金纳米材料终浓度为25μg/mL,50μg/mL处理24小时后收集上清,并以2000r/min的转速离心去掉纳米材料及细胞碎片,取上清保存在-20℃备用。以ELISA方法检测细胞产生的炎症因子TNF-α和IL-12(操作步骤参照ELISA说明书),每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
结果见图6,图7(*p<0.05,代表实验组与对照组有差异性,**p<0.001,代表实验组与对照组有显著性差异)。
Claims (3)
1.一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列,是通过调节亲水配位体和疏水配位体的相对比例,并使所述配位体分子与金纳米颗粒连接后制得;
其特征在于:
所述阵列中亲水配位体是硫辛酸三聚乙二酰胺,疏水配位体是硫辛酸正九酰胺,配位体分子通过金硫键共价作用与金纳米颗粒连接依次形成8种平均粒径为5.0±0.2纳米的金纳米颗粒,分别以GNP-1、GNP-2、GNP-3、GNP-4、GNP-5、GNP-6、GNP-7、GNP-8表示,该8种金纳米颗粒共同组成球形金纳米颗粒阵列;其中GNP-1表面连接有100%单配位体分子硫辛酸三聚乙二酰胺,GNP-8表面连接有100%单配位体分子硫辛酸正九酰胺,GNP-2、GNP-3、GNP-4、GNP-5、GNP-6或GNP-7表面连接有双配位体分子硫辛酸三聚乙二酰胺与硫辛酸正九酰胺,其中硫辛酸三聚乙二酰胺相对硫辛酸正九酰胺的比例GNP-2至GNP-7呈现连续依次降低变化,但其相对比例之和为100%;所述球形金纳米颗粒阵列表面亲疏水性呈单一变化,用logP指数表征亲疏水性的大小,GNP-1至GNP-8依次为:-1.43511,-1.03967,-0.41074,-0.19551,0.174569,0.376064,1.241267,1.621869,其中logP指数越负,表示亲水性越强,logP指数越正,表示疏水性越强。
2.权利要求1所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列在制备针对树突状细胞的免疫调节制剂中的应用。
3.权利要求1所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列在制备药物载体以及免疫药物佐剂中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CN201610009891.6A CN105535990A (zh) | 2016-01-08 | 2016-01-08 | 一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其应用 |
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