CN105535988A - 双靶向递送化疗药物纳米体系制备方法及其增强抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，本发明公开了一种双靶向递送化疗药物纳米体系、制备方法及其增强抗肿瘤应用。本发明的双靶向递送化疗药物纳米体系，其药物载体以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳；所装载的化疗药物为5-氟尿嘧啶；药物载体通过马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯还连接抗Her-1抗体。本发明的双靶向递送化疗药物纳米体系经实验结果表明具有良好的生物相容性，与游离药物相比，能够通过EPR效应、温敏和抗体多重靶向，增强药物在肿瘤部位的富集，增强其抗肿瘤作用的同时，大大降低了化疗药物的毒副作用。

Description

双靶向递送化疗药物纳米体系制备方法及其增强抗肿瘤应用

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种双靶向递送化疗药物纳米体系及其制备方法与在增强抗肿瘤中的应用。

背景技术：

常规的抗癌治疗着意于直接杀死肿瘤细胞，不可避免地杀死人体正常细胞和破坏免疫***，从而引发严重的***毒性。药物的给药方式对药效的发挥起很大的作用，很多药物有一个最适宜的浓度范围，即在这个范围可以产生理想的药效，高于或低于此浓度则影响药效的发挥，甚至产生毒副作用。同时，一些重大疾病治疗的研究进展十分缓慢，这产生了综合运用多种方案来将药物靶向运输到疾病组织的需求。于是，一些控制药物代谢动力学、非特异性毒理学、免疫学、生物识别、药物效能等方面的新想法应运而生，这些新的方案，就是我们常说的的药物运输***。

纳米药物运输***将纳米技术与现代药剂学结合，具有的药物缓控、控释性和靶向性等特点可以大幅度提高药物的生物利用率、降低用药量、减少毒副作用，已成为国际肿瘤药物研制中的热点和前沿。特定位点靶向性的药物输运对调节有效药物剂量和治疗疾病是很重要的，而靶向性药物运输***具有细胞特异性，可以有效地将载有药物的运输***运送到靶细胞，通过细胞内吞进入细胞内，有效的杀灭病变细胞，而不伤及其他正常细胞，因此能大幅度提高药物生物利用率、降低药物服用量和对其他器官的毒性。在众多的靶向纳米载体中，应用最多的是主动靶向性纳米载体，主动靶向性纳米载体是指以抗体、配体或磁性为导向的纳米载体，由于其对靶器官或靶细胞具有高度的特异性和选择性，因此近年来得到迅速发展。

5-氟尿嘧啶是化疗常用抗癌药物之一，它进入细胞后，经过代谢作用，转变成5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸，从而抑制脱氧胸苷酸合成酶，进而抑制DNA的合成，最终杀死细胞。5-氟尿嘧啶抗瘤谱广，适用于乳腺癌、胃癌、肝癌等，但体内代谢快，有效期短，与其它化疗药物一样，患者直接应用5-氟尿嘧啶时，副作用较大。由于肿瘤细胞活性增强，周围组织局部温度高于正常组织温度，脉管***宽渗漏范围等特点。但5-氟尿嘧啶化疗时毒副反应强，病患的化疗反应很痛苦，如何做到5-氟尿嘧啶到达肿瘤部位后能够更快地释放药物，并促使肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的内吞，从而降低5-氟尿嘧啶的毒副作用是目前急需解决的问题。本发明采用带有正电的PEI与温度敏感的PNIPAM形成纳米凝胶载体，通过PEI的正电荷和化疗药物5-Fu的负电荷相互作用，将5-Fu包裹进凝胶载体内，避免了游离药物在体内对正常组织的毒副作用；另外，肿瘤部位较高的温度和载体表面抗体主动靶向能够显著增强肿瘤细胞对载药纳米凝胶的内吞，纳米载体进入肿瘤组织和细胞后，肿瘤组织独特的微环境作用下可以实现药物在肿瘤部位有效快速的释放，从而有效的杀死肿瘤细胞。

EGFR广泛分布于哺乳类动物的细胞膜上，基因位于7号染色体P12-14区域，其家族包括EGFR(ErB1/HER1)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)等4个成员。随着人类医学科学的快速发展生物靶向治疗已经成为目前治疗恶性肿瘤的重要手段，近几年许多分子靶向表皮生长因子受体(EGFR)药物已经广泛应用于临床，以ABX-EGF、IMC-C225(西妥昔单抗cetuximab)、MAB528、MAB225为代表的单抗类药物已经应用于临床肿瘤治疗，在治疗中也取得良好疗效。这些抗Her-1单抗隆抗体包括对胃癌(SGC7901)、人肺癌(H125)、人直肠(DiFi)、表皮细胞癌(A431)以及食管鳞癌的治疗等。

中国专利申请CN201210048338.5，发明名称为“一种纳米复合温敏凝胶剂及其制备方法和应用”，申请公布号为CN102525882A，其实施例1公开了一种包载5-氟尿嘧啶(5-Fu)的PLGA-PLL-cRGD温敏复合凝胶剂的制备和应用，是采用复乳法制备：取8mgPLGA-PLL-cRGD溶于400μL二氯甲烷，加入40μL浓度为20mg/mL的5-氟尿嘧啶(5-Fu)溶液，超声乳化后，再加入4.4mL2wt％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm，在以上纳米粒水分散体中加入F-127使浓度为15％，即得复合凝胶剂。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种具备良好的肿瘤靶向和杀伤能力的双靶向递送化疗药物纳米体系，本发明的另一目的是提供上述双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，本发明的第三目的在于提供上述双靶向递送化疗药物纳米体系在制备***药物中的应用。

本发明的主要技术方案是：采用自由基共沉淀的方法制备出5-氟尿嘧啶高载药量的温度敏感性核壳结构微凝胶，该载体以温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺为内核，带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳，借助电荷间的相互吸附可以装载并实现5-氟尿嘧啶的载药量可以调节控制。微凝胶包裹5-氟尿嘧啶之后，可以延长其半衰期，促使更多的5-氟尿嘧啶到达肿瘤部位，微凝胶在受到肿瘤局部高温刺激后，发生塌缩进而减小粒径，促进肿瘤细内吞5-氟尿嘧啶，并更快的释放药物，从而降低5-氟尿嘧啶的毒副作用。本发明还通过连接物连接抗Her-1抗体，靶向微凝胶/5-氟尿嘧啶复合体具备良好的肿瘤靶向和杀伤能力。

本发明的第一方面，提供一种双靶向递送化疗药物纳米体系，所述的药物纳米体系包括：

药物载体，以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)为外壳；

化疗药物，为5-氟尿嘧啶(5-Fu)；

药物载体通过电荷间的相互吸附装载5-氟尿嘧啶；以实现5-氟尿嘧啶载药量的可控调节；

药物载体中的马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(mPEGs)通过mPEGs上马来酸酐中双键与巯基化抗Her-1抗体上的巯基发生加成反应，将抗体连接到mPEGs上，同时mPEGs上的琥珀亚酰胺与载体材料中的游离氨基发生取代反应，从而得到抗体靶向的纳米载体；以实现靶向微凝胶载药体系对Her-1阳性的肿瘤具备良好的靶向性。

所述的温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，在32度是发生临界相转变行为。

所述的聚乙烯亚胺(PEI)，分子量25KD，为分枝状；

所述的纳米粒径为300nm±25nm。

优选的，所述的温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，体积相变温度(VPTT)约32℃，即当温度接近肿瘤病灶部位温度时，温度T大于(相转变温度)VPTT时，能够明显促进细胞对载体的内吞。

本发明的第二方面，提供一种双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，该方法包括如下步骤：

A、阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI的制备

先将PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中，向该PBS体系中通入N₂除氧后，加入叔丁基过氧化氢(TBHP)，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应2--6h；反应结束后，通入O₂搅拌停止反应；37℃下，15000rpm离心纯化凝胶10--20min；用去离子水(Milli-Qwater)重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Milli-Qwater中透析5-10天，制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI。

所述的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)这三者的重量比例为4/6/0.1～6/4/0.1。

B、靶向纳米凝胶包裹化疗药物5-Fu的制备

步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带有一定负电荷的化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)溶于纳米凝胶溶液中，所述的纳米凝胶与药物的质量比为1:1,1:3,1:5。根据载体载药后药物的释放情况以及载体的稳定性确定纳米凝胶载体与5-Fu的质量比为1:1～1:3之间最为合适；然后通过mPEGs将巯基化的抗体和纳米凝胶载体交联起来，巯基化抗体的质量与载体的质量比为1:10为佳。

所述的步骤A具体为：

先将25KD的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中向该体系中通入30min的N₂除氧后，加入TBHP，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应4h；反应结束后，通入O₂搅拌20min停止反应；37℃下，采用落地式高速冷冻离心机纯化凝胶，15000rpm离心15min；用30mLMilli-Qwater重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Milli-Qwater中透析7天，定期换水。保持反应体系总质量不变的情况下，通过调节PEI和NIPAM的比例，即可制备PEI含量不同的聚阳离子纳米凝胶。

所述的步骤B具体为：

步骤A制备得到的智能靶向纳米凝胶PNIPAM/PEI与带负电的化疗药物5-Fu溶于去离子水中，按照不同的纳米凝胶与5-Fu的质量超声2min，静置12h后，形成粒径为250nm左右的微凝胶/5-FU体系；然后向微凝胶/5-FU体系中加入mPEGs，混匀后，室温下静止10小时；再加入巯基化抗Her-1抗体，将巯基化的抗体和纳米凝胶载体交联起来，形成抗体修饰的纳米凝胶载药复合体系。

本发明的第三方面，提供一种双靶向递送化疗药物纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为对Her-1阳性的肿瘤，例如H125(人肺癌细胞)，DiFi(人结肠癌细胞)，A431(表皮细胞癌)等。

本发明用具有温敏特性的PNIPAM和带正电荷的PEI制备出具有温敏响应性的核壳结构智能纳米凝胶包裹化疗药物5-Fu，然后在纳米载体表面修饰上能够靶向肿瘤的抗Her-1抗体用于肿瘤的靶向治疗。我们发现，制备的靶向纳米凝胶载药体系可显著的被肿瘤细胞所摄取；体外实验表明，抗体靶向纳米凝胶载药体系能够显著抑制肿瘤的生长；本发明用小动物活体成像仪(CaliperLifeSciences，Hopkinton，MA)来检测我们制备出的这种稳定、均一的纳米凝胶复合体通过尾静脉注射方式在荷瘤裸鼠体内24小时的富集情况，结果显示，相对于游离药物组和非靶向组，抗体靶向组能够明显的富集在肿瘤部位；肿瘤抑制实验结果表明，抗体靶向组通过尾静脉注射方式给药的肿瘤体积相对于对照组和非靶向组减少了15倍和6倍左右。我们的研究结果表明了我们制备出来的低毒、温度敏感和抗体主动靶向的核壳结构智能纳米凝胶/5-Fu复合体系在肿瘤的治疗上具有显著的疗效。

本发明制备的靶向纳米凝胶载药体系具有如下特点：

(1)该载体以温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺为内核，带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳，借助电荷间的相互吸附可以装载并实现5氟尿嘧啶载药量的可控调节；

(2)通过连接物连接抗Her-1抗体后，靶向微凝胶载药体系能通过纳米药物增强的渗透与滞留效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect，EPR)以及抗原抗体的识别和结合效应，增强其在肿瘤内部的富集能力。

(3)所述纳米凝胶载药体系与游离化疗药物相比具有更长的半衰期。

附图说明：

图1为靶向纳米凝胶载药体系构建示意图；

图2为靶向纳米凝胶载药体系表征分析；

图3为靶向纳米凝胶载药体系的生物相容性检测；

图4为靶向纳米凝胶载药体系的载药和释放检测；

其中4A：不同浓度的5-FU制备的靶向纳米凝胶载药体系载药量检测；

4B：不同载药量的靶向纳米凝胶载药体系的药物释放曲线；

4C：靶向智能纳米载药体系在不同温度下的药物释放曲线；

图5为靶向纳米凝胶载药体系细胞杀伤功能检测；

其中5A：靶向纳米凝胶在37℃杀伤肿瘤细胞能力检测；

5B：靶向纳米凝胶在40℃杀伤肿瘤细胞能力检测；

图6为靶向纳米凝胶载药体系体内分布检测；

图7为靶向纳米凝胶载药体系体内肿瘤杀伤效应检测。

具体实施方式：

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下述具体实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：靶向纳米凝胶的制备方法

1.溶解0.84g的25kPEI到20mlMilli-Qwater，用盐酸调pH到7；

2.准确称取0.4746g的NIPAM晶体，13.146mg的BIS晶体到上述溶液中；

3.将上述混合液转移到50ml磨口烧瓶中，补加l0mlMilli-Qwater；

4.将烧瓶底部浸入含有硅油的恒温磁力搅拌器，搅拌下加热硅油到50℃；

5.向体系中通入高纯氮气并搅拌30min；

6.30min后，加热硅油到80℃，并向体系加入250μl0.01M叔丁基过氧化氢(TBHP)；

7.在80℃条件下，维持氮气环境再搅拌2小时；

8.2小时后，停止N₂，通入O₂，搅拌过夜；

9.收集制备的微凝胶，35℃下，采用落地式高速冷冻离心机纯化微凝胶，15000rpm离心l5min；

10.用30mlMilli-Qwater重新溶解微凝胶沉淀；

11.采用30kMWCO透析膜透析微凝胶溶液，每天更换Milli-Qwater，连续透析一周。聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶的合成线路图如图1A所示

实施例2：靶向纳米微凝胶组分的鉴定

1.冷冻干燥透析后的微凝胶(25KPEI含量为60％)；

2.取适量微凝胶粉末，溶于D₂O中，¹H-NMR测试微凝胶组分；NIPAM含有酰胺键(δ，5.0-8.0)，PEI中含有胺类(δ，0.5-5.0)，从合成得到的微凝胶¹H-NMR图谱中可以发现，既有酰胺键的质子吸收峰，同时也能看到PEI的胺类质子吸收峰，可见我们已成功将PEI与PNIPAM接枝形成纳米凝胶共聚物。

实施例3：靶向纳米微凝胶粒径的测试

1.用适量Mi1li-Qwater稀释透析后的微凝胶；

2.取lml微凝胶溶液，确认测定容器中无气泡产生后，加入样品池，每个样品重复测定3次。测量条件为：170散射角，25℃。

实验结果如图2所示，随着微凝胶载体中PEI含量的上升，从0％-70％，其粒径逐渐降低从493±55nm下降到255.2±30nm，这是因为随着载体中PEI含量的增加，微凝胶交叉更加紧密，也使得微凝胶所带的正电荷逐渐增多，有利于体系的稳定和增加药物的载药量。

实施例4：靶向纳米微凝胶核壳结构的鉴定

1.经300kMWCO透析膜透析后的微凝胶(25kPEI含量为60％)，稀释1倍；

2.取8μl样品滴加到铜网的涂碳膜面上，通风橱中干燥过夜；

3.取l0μl质量分数为2％PTA到封口膜上，将铜网炭化面盖到液面上面，染色5min；

4.铜网炭化面向上，自然晾干,用透射电镜观测纳米凝胶载药体系的结构。

从透射电镜图中可以看到形成的纳米凝胶在铜网中分布均匀，呈核壳结构的圆球颗粒状分布，其粒径大小在250nm左右，同粒度仪检测得到的结果一致，表明形成的纳米凝胶稳定且分布均匀。

实施例5、靶向纳米微凝胶温度敏感性的研究

1.用适量Milli-Qwater稀释透析后的微凝胶到适宜浓度；

2.吸取3ml(25KPEI含量为60％)微凝胶到紫外分光光度计样品池中；

3.分光光度计参数设置：

Wavelength：400nmrate：0.5℃/min

SBW：2.0nmhold：lmin

Avetime：0.5sdatainterval：0.2

4.搅拌变温条件下测试微凝胶的紫外吸光情况，用紫外分光光度计检测得到纳米凝胶载体以温度对吸光值作图分析可以看到，随着温度的升高，具有温度敏感的PNIPAM从亲水性向疏水性逐渐转变，表现在紫外吸光值上逐渐增大，当温度升高到37℃以上，PNIPAM完全变成疏水结构，纳米凝胶由于疏水之间的相互作用形成聚集体，此时紫外分光光度计由于纳米凝胶形成的大的聚集体而检测得到的吸光值呈最大。因此借助温度升高吸光值的改变得到纳米凝胶发生相转变的温度(VPTT)，其值约为39℃，为后续细胞实验做好准备。

实施例6、靶向纳米微凝胶生物相容性研究

将对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-23l细胞(购自美国ATCC)消化、离心后计数，铺96孔板，细胞数2×10⁴/孔，将其与不同浓度的纳米凝胶载体进行孵育，16小时后用CCK-8试剂盒检测每孔细胞密度并计算不同浓度载体对细胞的毒性。

MDA-MB-231细胞生存率结果显示：浓度为20，40,80,160μg/mL单独NIPAM作用细胞后，细胞的存活率在高浓度的160μg/mL下仍能达到90％以上；而单独的PEI在浓度仅为20μg/mL时，细胞的存活率不到5％，表明单独的PEI对细胞具有显著的毒副作用；而制备得到的纳米凝胶载体在160μg/mL下，其细胞存活率有50％左右，相对于PEI对细胞的毒性，纳米凝胶对细胞的毒性已经很低了，为了能够更好的应用于细胞和体内实验，后续实验中所用到的纳米凝胶浓度为100μg/mL以内，数据显示纳米凝胶浓度<100μg/mL，其细胞存活率能达到80％以上。

实施例7、制备靶向、非靶向微凝胶包裹5-氟尿嘧啶体系：

1.BSA和Anti-HER-1巯基化

2.用Mil1i-Qwater稀释制备6ml0.5mg/ml微凝胶溶液

3.精密天平称取3mg5-FU，并加入到上述微凝胶溶液中，超声2分钟后，静止12小时，即可形成微凝胶/5-FU体系

4.12小时后，取出1.5ml微凝胶/5-FU体系，向剩余4.5ml溶液中加入1.8mgmPEGs，混匀后，室温下静止10小时

5.10小时后，采用l0kMWCO离心柱离心纯化微凝胶/5-FU体系

6.向3ml凝胶/5-FU体系中加入0.7ml9.7mg/ml巯基化抗Her-1抗体或巯基化的BSA

7.以Milli-Qwater为透析液，采用30kMWCO透析膜透析靶向、非靶向nanogel/5-FU体系12小时

8.透析结束后，冷冻干燥该体系，采用D₂O溶解，核磁共振鉴定抗体是否连接到微凝胶上面

对比分析靶向纳米药物复合体系和没有连接抗体的纳米药物复合体系的氢核磁谱不难发现，靶向纳米药物复合体系的氢核磁谱在3.6处有一个很明显的单峰，从而表明，抗体成功连接到纳米凝胶药物复合体系上。

实施例8、靶向纳米微凝胶药物装载与释放实验

1.载药量计算：载药量＝体系中化疗药的浓度/载体浓度

2.靶向纳米凝胶载药体系药物释放检测：

取靶向与非靶向的纳米凝胶/5-FU复合体加入到1000MWCO透析膜中，以220mlMilli-Qwater为透析液，分别在37℃，40℃条件下透析，不同时间点各取出0.5ml，紫外分光光度计在265nm波长处测试不同时间点样品的吸光值，计算对应时刻释放出的5-氟尿嘧啶浓度

结果如图4所示。5-Fu释放曲线显示：在37℃和40℃下，载药量为10.5％的微凝胶对5-Fu的释放可以起到缓空释放作用；相对于37℃下的药物释放，5-Fu在40℃下释放的速度更快。这是因为，温度敏感性微凝胶在40℃时，亲水性的外壳PNIPAM随着温度的上升向疏水转变，使得形成的核壳纳米粒子复合物在高温下会发生进一步“塌缩”，快速释放微凝胶包裹的5-Fu；纳米凝胶药物复合物接上BSA或是抗体后，在37和40℃下对5-Fu的释放起到一定的缓释作用，药物的释放时间会略有延长，这是因为载体表面连接亲水性的BSA和抗体能够加强纳米凝胶和药物之间的相互作用，有利于药物在纳米载体中的稳定。

实施例9、靶向纳米微凝胶载药体系对乳腺癌细胞的杀伤实验

1.用Mi11i-Qwater稀释制备6ml0.5mg/ml微凝胶溶液；

2.精密天平称取3mg5-Fu，并加入到上述微凝胶溶液中，超声2min后，静置12h，即可形成微凝胶/5-Fu体系；

3.12h后，取出1.5mL微凝胶/5-Fu(nanogel/5-Fu)复合体，想剩余的4.5ml溶液中加入1.8mgmPEGs，混匀后室温下静置10h；用10KMWCO的离心柱离心纯化nanogel/5-Fu复合体，nanogel/5-Fu/mPEGs复合体；

4.离心后，nanogel/5-Fu为0.85ml，计算得到nanogel浓度为882μg/ml，5-Fu浓度为93μg/ml，其载药量为10.5％；

5.离心后，nanogel/5-Fu/mPEGs为6ml，向3mlgel/5-Fu/mPEGs中加入6.79mg巯基化抗体，向另外3mlgel/5-Fu/mPEGs中加入2.262mg巯基化的BSA，混匀后，静止12小时；

6.细胞铺板：将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞消化、离心计数，在96孔板中每孔放置5.0×10⁴/mL细胞，每孔加入100μl含10％FCS的细胞培养液，放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中；

7.细胞铺板12小时后，用10％FCS分别稀释gel/5-Fu，gel/5-Fu/BSA，gel/5-Fu/mAb至0.156，0.3125，0.625,1.25，2.5，5，10，20，40,80μg/ml，之后按照每孔100μl的量将不同浓度的溶液加入到96孔板中，并放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中孵育6h后；将其中2快96孔板转至40℃，7％CO₂孵箱中孵育，另两块96孔板继续在37℃，7％CO₂孵箱中孵育；48h后，弃去旧的培养基，用PBS清洗细胞两次后，每孔加入含有10％CCK-8的细胞培养液在37℃中孵育2.5h，酶标仪检测细胞活性。

结果如图5所示，随着药物浓度的增大，细胞的存活率逐渐降低；相对于非靶向纳米载体药物复合体系和药物与凝胶载体对细胞毒性作用，抗体靶向组对细胞抑制效果显著要高于非靶向组和药物与凝胶载体组，这是因为抗体对肿瘤细胞上HER-1的靶向能够明显增强细胞对纳米药物载体的内吞，增强药物在细胞内的浓度从而有效杀死肿瘤细胞；图5B中的高温组(40℃)，非靶向组和靶向组，对细胞的抑制效果均好于37℃下的非靶向组和靶向组，但是游离药物5-Fu对细胞的抑制效果基本不受温度的影响，这是因为纳米凝胶载体具有一定的温度响应性，当温度升高时，具有温度敏感的载体从亲水性向疏水性转变，而细胞膜也具有疏水性，升高的温度能够增强纳米凝胶载体与细胞膜之间的相互作用，增强细胞对药物的内吞，从而升高温度有助于纳米凝胶药物复合体系对肿瘤细胞的杀伤效果。

实施例10：靶向、非靶向荧光微凝胶载体在乳腺癌小鼠肿瘤模型中的分布

裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立，方法如下：

购买的雌性Balb/c裸鼠(4周龄，约20g)，在进行皮下接种肿瘤细胞实验前，先在恒温(25-27℃)、恒湿(45-50％)、新鲜空气高度除尘除菌、无特殊病原体(SPF级)环境下适应一周，动物饲养在有机玻璃饲养盒内，安放层流式超净架内，每只饲养盒内饲养5只动物，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。观察一切正常后，方可进行后续实验；取对数生长期的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231-luc细胞，用胰酶将处于对数生长期的MDA-MB-231-luc细胞消化，用无菌PBS重悬细胞，制备成MDA-MB-231-luc细胞悬液，调整细胞浓度至1×10⁷个/mL；选取Balb/c裸鼠(雌性，5周龄，约20g)，取细胞悬液接种至裸鼠右背部皮下，每只裸鼠接种的细胞数为1×10⁷个；裸鼠精心饲养2周后，选择肿瘤生长良好，肿瘤体积长至约50mm³的裸鼠，作为实验模型，然后每只荷瘤裸鼠注射D-Luciferase底物的剂量为150mg/kg，通过小动物活体成像仪(CaliperLifeSciences，Hokpinton，MA)初步观察裸鼠乳腺癌模型的构建情况。

肿瘤体积计算公式：体积V＝长×宽×宽/2。

当裸鼠的肿瘤体积达到50-60mm³时，即可进行体内分布实验。

将荷瘤裸鼠随机分成3组，每组3只，分别通过尾静脉注射100μl/只包裹FITC的PEI溶液(PEI-FITC)和100μl/只包裹FITC的纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITC，i.v.)，以及通过瘤内给药100μl/只样品包裹FITC的纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITC，i.t.)，每只荷瘤裸鼠注射FITC荧光素的剂量为5mg/kg。每天注射1次，连续注射3天。

麻醉荷瘤裸鼠，分别在0h(未注射样品前，作为空白对照)、6h、8h、12h和24h五个不同时间点用小动物活体成像仪考察三组纳米凝胶样品在裸鼠体内分布情况并拍照，激发波长为500nm。

24h后，对荷瘤裸鼠实施安乐死，取出裸鼠的肿瘤组织及心、肝脏、脾脏和肾脏主要组织，同时用小动物成像***拍照，考察荧光高分子在主要组织的分布，激发波长为500nm。小鼠脏器冷冻包埋后，做冰冻切片DAPI染色5分钟、封片，之后采用confocal观测荧光高分子在肿瘤小鼠脏器内的分布。实验结果如图6所示：非靶向荧光微凝胶注射乳腺癌小鼠模型后，1小时的时间可以分布到全身部位。随着时间的延长，小鼠血液循环，3至6小时这一时间段，荧光高分子由体表位置开始进入机体内部。12至24小时后，非靶向荧光微凝胶仅在小鼠局部部位残留，肿瘤部位也未显示富集；靶向荧光微凝胶注射乳腺癌小鼠模型后，1小时的时间可以分布到全身部位，随着时间延长，小鼠血液循环，3至6小时这一时间段，荧光高分子由体表位置开始进入机体内部，12小时后，靶向荧光微凝胶明显富集在肿瘤部位，肾脏也有少量聚集，这是因为肾脏是机体主要的***器官。随着时间的延长至24小时，肾脏部位的微凝胶被代谢掉，而肿瘤部位仍然有较明显的富集。本实验在小鼠整体水平验证了靶向荧光微凝胶主要富集在小鼠肿瘤部位。

实施例11：靶向、非靶向5-氟尿嘧啶/微凝胶复合体抑瘤的研究

裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立，实验方法如实施例10所示：

当裸鼠肿瘤体积达到50-60mm³时(即肿瘤生长进入增生阶段)，即可进行体内肿瘤生长抑制实验，体积计算公式如前所述；

将荷瘤裸鼠随机分成4组，包括对照组、靶向和非靶向nanogel/5-Fu和5-Fu组；通过尾静脉注射的方式将上述四组药物打入老鼠体内，每组5只。连续3天，每天注射一次，共计给药3次。注射药物后，每天测量小鼠肿瘤体积大小和体重变化，连续观测3周。根据每日测量肿瘤体积绘制小鼠肿瘤生长曲线图，评价靶向纳米凝胶载药体系体内肿瘤杀伤效果。

实验结果如图7所示：靶向5-氟尿嘧啶/微凝胶组可以明显抑制肿瘤的生长，3周之后，靶向5-Fu/微凝胶处理组小鼠体内的肿瘤完全被抑制了；而非靶向5-氟尿嘧啶/微凝胶组和单纯5-氟尿嘧啶组有一定的抑瘤效果，与阴性对照相比，肿瘤体积减小3倍左右，这是因为5-氟尿嘧啶是临床常用的化疗药物，其杀死肿瘤细胞能力比较强。非靶向组对肿瘤的抑制作用要好于游离药物组，是因为非靶向组纳米粒子在肿瘤体内具有EPR效应，增强纳米粒子在肿瘤的富集。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的药物纳米体系包括：

药物载体，以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳；

化疗药物，为5-氟尿嘧啶；

药物载体通过电荷间的相互吸附装载5-氟尿嘧啶；

药物载体通过马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯连接抗Her-1抗体。

2.根据权利要求1所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯通过mPEGs上马来酸酐中双键与巯基化抗Her-1抗体上的巯基发生加成反应，将抗Her-1抗体连接到mPEGs上，同时mPEGs上的琥珀亚酰胺与药物载体材料中的游离氨基发生取代反应。

3.根据权利要求1或2所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺，在32度是发生临界相转变行为。

4.根据权利要求1或2所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺，分子量25KD，为分枝状。

5.根据权利要求1或2所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的纳米粒径为300nm±25nm。

6.一种如权利要求1所述的双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A、阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI的制备

先将PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于PBS中，向该PBS体系中通入N₂除氧后，加入叔丁基过氧化氢，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应2--6h；反应结束后，通入O₂搅拌停止反应；37℃下，15000rpm离心纯化凝胶10--20min；用去离子水重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Milli-Qwater中透析5-10天，制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI；

所述的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)这三者的重量比例为4/6/0.1～6/4/0.1；

B、靶向纳米凝胶包裹化疗药物5-Fu的制备

步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带有一定负电荷的5-氟尿嘧啶溶于纳米凝胶溶液中，所述的纳米凝胶与5-氟尿嘧啶的质量比为1:1至1:5；然后再通过mPEGs将巯基化的抗Her-1抗体和纳米凝胶载体交联起来。

7.根据权利要求6所述的双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，其特征在于，步骤B中：所述的纳米凝胶与5-氟尿嘧啶的质量比为1:1至1:3；所述的巯基化抗Her-1抗体的质量与药物载体的质量比为1:10。

8.根据权利要求6所述的双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，其特征在于，所述的步骤B具体为：

步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带有一定负电荷的5-氟尿嘧啶溶于纳米凝胶溶液中，超声2min，静置12小时后，形成粒径为300nm±25nm的微凝胶/5-FU体系；然后向微凝胶/5-FU体系中加入mPEGs，混匀后，室温下静止10小时；再加入巯基化抗Her-1抗体，将巯基化的抗体和纳米凝胶载体交联起来，形成抗体修饰的纳米凝胶载药复合体系。

9.一种如权利要求1所述的双靶向递送化疗药物纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的双靶向递送化疗药物纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为对Her-1阳性的肿瘤。