CN105524994B - 一种大麦粒长基因Lkl2的分子标记HRM7及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及大麦分子育种领域，具体公开了一种大麦粒长基因Lkl2的分子标记HRM7及其应用。本发明提供的与大麦粒长基因Lkl2紧密连锁的分子标记HRM7，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述大麦长粒长基因，预测大麦的粒长特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定大麦长粒长基因Lkl2的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强粒长预测的准确性，以便快速筛选出具有增加粒长的QTL的大麦品种或品系用于育种，可大大加快大麦高产量品种的选育进程。

Description

一种大麦粒长基因Lkl2的分子标记HRM7及其应用
技术领域
本发明涉及大麦分子育种领域，具体地说，涉及一种大麦粒长基因Lkl2的分子标记HRM7及其应用。
背景技术
大麦是世界上最古老的粮食作物之一，具有多种用途：集粮食、饲料、啤酒原料以及医药、保健食品于一身。就其产量而言，大麦是全球第五大农作物；按其种植面积，是全球种植和生产的第四大谷类作物有关数据显示，目前大麦常年播种面积约有6000万hm2，年总产量约为1.5亿吨，仅次于玉米、水稻、小麦。近半个世纪以来，人类对大麦的生产和需求呈持续增长的趋势。2008年的统计数据显示，大麦年总需求量为0.274亿吨，这在谷类作物中的需求量仅次于玉米居第二位，因此高产大麦品种的选育一直是育种家关注的重点。同时，大麦作为遗传学研究的模式植物之一，一直受到遗传学家和分子生物学家的高度重视。分子标记在了解大麦重要经济性状的遗传基础上扮演着重要的角色，分子连锁图谱的应用为植物基因组结构分析和比较提供了有力工具。
大麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点(Quantitativetrait locus，QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育过程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种是一种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条件限制、在植物发育的整个生长时期均可检测、选择效率高等优势。
大麦籽粒大小是粒重的重要决定因素，粒长直接影响大麦籽粒大小，而粒重又是大麦产量的3个构成因素之一，因此大麦粒长大小是影响产量的重要因素。因此，阐述大麦籽粒长的大小的遗传基础和分子机制有利于同时改良大麦的产量和品质。
大麦籽粒大小遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕籽粒基因QTL的分子标记定位及其遗传效应开展。最早Kjaer、G.Backes等在1995年将大麦粒长基因定位在了不同染色体上，近年来又陆续有研究对大麦粒长位点做了定位研究，如CassandraK在2013年将大麦控制粒长的位点定位在了除了4H以外的6条染色体上。迄今为止，已报道的粒长相关基因QTL位于7条染色体上，而未见报道对相关位点做更加深入的研究以完成精细定位工作。
野生大麦AWCS276相对于大麦品种Baudin具有粒长大，粒宽小，有良好的抗病抗逆性等特性(陈光登.大麦抗镰刀菌型茎基腐病遗传及其与重要农艺性状间关系[D].四川农业大学，2013.)。同时，大麦品种Fleet的粒长也小于野生大麦AWCS276。因此，利用野生大麦AWCS276和Fleet构建遗传研究群体，进一步验证野生大麦AWCS276的粒长特性，定位控制粒长基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进大麦粒长基因的图位克隆，同时为大麦粒长材料的创制及高产量育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强粒长预测的准确性，提高高产育种效率，加速实现增加大麦单产的目标。
分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。高分辨熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术近年来国际上兴起的一种SNP及突变研究工具。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与粒长基因紧密连锁的，且适用于荧光定量PCR平台HRM技术的分子标记，不仅能对大麦粒长基因进行选择，有效调控大麦籽粒长短，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良大麦育种群体质量和产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供与大麦粒长基因Lkl2紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的在于提供所述分子标记的荧光定量PCR引物。
本发明的第三个目的在于提供上述大麦粒长基因Lkl2紧密连锁的分子标记的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明的新粒长基因Lkl2来自野生大麦AWCS276，该基因位于大麦4H染色体。Lkl2能显著提高大麦粒长，LOD值大于5.06，解释约16.4％的表型变异。
本发明所提供的分子标记HRM7的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述分子标记与大麦粒长基因Lkl2共定位于大麦4H染色体，且与Lkl2之间的遗传距离为0.5cM。
本发明还提供了一种鉴定大麦粒长基因Lkl2的分子标记的方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将与AWCS276分为同一类型的植株鉴定为含有大麦粒长基因Lkl2的植株。
可选的，所述方法包括以下步骤：
(1)以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增：
(2)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上游引物和下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL；
(3)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s；
(4)利用步骤(3)获得的结果进行基因分型。
其中，所述待鉴定植株的DNA取自大麦样品三叶期的叶片。
本发明还提供了所述分子标记的荧光定量PCR引物，其中，上游引物序列如SEQ IDNo.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了所述分子标记HRM7在大麦育种中的应用。
本发明还提供了所述分子标记HRM7在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为粒长基因Lkl2。
本发明还提供了本分发明所述方法在大麦育种改良中的应用。
本方还提供了所述的荧光定量PCR引物在分子标记辅助大麦高产育种中的应用。
在本发明中，大麦粒长基因Lkl2及分子标记HRM7是通过以下方法获得的：
(1)利用长粒长野生大麦AWCS276作为母本，以大麦Baudin为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有130个株系的F8代RIL群体，构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用DArT芯片技术，以亲本AWCS276和Baudin的DNA为模版，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本AWCS276的带型记为A，亲本Baudin的带型记为B。F8群体株系带型来源于AWCS276的记为A，来源于Baudin的记为B。
(3)大麦完熟期所述F8群体室内考种鉴定籽粒的粒长。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建大麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)，并结合F8群体粒长表型数据将粒长基因Lkl2定位于4H染色体上一个2.3cM的区段内。
(5)获取该区段内的DArT探针序列，通过在大麦Morex的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长DArT探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
(6)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(见表1)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。
表1 10对HRM引物序列及扩增片段长度
(7)高分辨熔解曲线(HRM)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的10对引物，以亲本AWCS276和Baudin的DNA为模版，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的荧光定量PCR分子标记引物，命名为HRM7-F/R(核苷酸序列如SEQ ID No.2和3所示)。扩增产物为具有多肽性的分子标记HRM7，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示
b)F8群体的HRM分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记HRM7的PCR引物，扩增亲本AWCS276、Baudin和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本AWCS276的类型记为A，扩增片段大小长87bp，单碱基差异位点为C。亲本Baudin的类型记为B，扩增片段长87bp，单碱基差异位点为T。F8群体株系类型来源于AWCS276的记为A，来源于Baudin的记为B。
有益效果：
本发明首次公开了来自大麦AWCS276的粒长基因Lkl2，位于大麦4H染色体，显著增加大麦粒长。该基因在大麦产量(调控粒重)育种中具有较高的利用价值。
本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测大麦AWCS276新粒长基因Lkl2的分子标记HRM7，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
本发明公开的分子标记HRM7与粒长基因Lkl2极显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的大麦长粒长品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
图1为大麦AWCS276长粒长基因Lkl2在4H染色体上的位置及与本发明分子标记HRM7之间的连锁遗传图谱。
图2为AWCS276×Baudin的F7RIL群体后代用荧光定量PCR引物做基因型分型的结果。
图3为AWCS276×Fleet的F7RIL群体后代用荧光定量PCR引物做基因型分型的结果。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1
本实施例用于说明大麦粒长基因Lkl2及分子标记HRM7的获得方法：
(1)利用长粒长野生大麦AWCS276作为母本，以大麦Baudin为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有130个株系的F8代RIL群体构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，以DArT芯片技术，以亲本AWCS276和Baudin的DNA为模版，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。AWCS276的带型记为A，亲本Baudin的带型记为B。F8群体株系带型来源于AWCS276的记为A，来源于Baudin的记为B，杂合型为H。
(3)大麦完熟后进行室内考种测量籽粒粒长。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建大麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)，并结合F8群体粒长表型数据将粒长基因Lkl2定位于4H染色体上一个2.3M的区段内。
(5)获取该区段内的DArT探针序列，通过在大麦Morex的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长DArT探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
(6)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(如表1所示)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。
(7)高分辨熔解曲线(HRM)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的10对引物，以亲本AWCS276和Baudin的DNA为模版，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的荧光定量PCR分子标记。
b)F8群体的HRM分析：以上述步骤获得的具有多态性的分子标记HRM1，扩增亲本AWCS276、Baudin和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据,结果如图2。亲本AWCS276的类型记为A，扩增片段大小长87bp，单碱基差异位点为‘C’。亲本Baudin的类型记为B，扩增片段长87bp，单碱基差异位点为‘T’。F8群体株系类型来源于AWCS276的记为A，来源于Baudin的记为B。
c)利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)，并结合F8群体粒长表型数据，发现分子标记HRM7位于粒长基因Lkl2 2.3cM的区段内，结果如图1所示，由图可知，粒长基因Lkl2定位在标记3263026|F|0--5:C>T和3256153|F|0--57:A>G之间的2.3cM的区段内，而分子标记HRM7距离DArT标记3256153|F|0--57:A>G有1.2cM，Lkl2基因与分子标记HRM7距离0.5cM，呈紧密连锁。
实施例2
1.1DNA的提取
试验材料选取AWCS276、Baudin，其中Baudin为短粒长品种，AWCS276为长粒长品种。采用CTAB法提取大麦样品三叶期的叶片DNA。
1.2检测大麦粒长基因Lkl2的引物的筛选
1.2.1引物设计
(1)获取该区段内的DArT探针序列，通过在大麦Morex的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长DArT探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
(2)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(见表1)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。
1.2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性
(1)提取AWCS276、Baudin三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，本发明所述HRM7-F(SEQ ID No.2所示的序列)和HRM7-R(SEQ ID No.3所示的序列)为引物进行荧光定量PCR扩增。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。
(5)以步骤(4)所得结果文件，导入BioRadPrecisionMelt软件进行基因分型，结果如图2。在绘制熔解曲线过程中，根据碱基对A＝T，C≡G解链的温度不同，BioRadPrecisionMelt将样本分为两种类型。AWCS276类型的记为A，Baudin类型的记为B。
1.3群体检测过程中引物序列HRM7-F/R的适用性
(1)以AWCS276为母本，Fleet为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F7代RIL验证群体。提取群体中各株系三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，利用本发明所提供的引物进行荧光定量PCR扩增，荧光染料为SsoFast EvaGreen。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：5μL SsoFast EvaGreen超混合液、上下游引物各300ng、100ng模板DNA、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。
(5)以步骤(4)所得结果文件，导入BioRadPrecisionMelt软件进行基因分型，结果如图3。随机抽检86株株系，45株能扩增出与AWCS276相同类型的片段，为含有长粒长基因Lkl2的植株，预测株系植株在成熟后粒长较大。41株能扩增出与Baudin、Fleet相同的B型片段，为不含有长粒长基因Lkl2的植株，预测这些植株在成熟后粒长较小。
(6)大麦完熟期后室内考种测得籽粒的粒长，结果见表2，长粒长基因Lkl2的分子标记HRM7预测遗传群体分蘖能力的结果。与长粒长基因Lkl2类型相同的植株平均粒长为9.03mm，显著高于与Fleet类型的植株粒长(平均8.83mm)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的粒长基因Lkl2确实有显著增大粒长的作用；同时本发明的分子标记HRM7可以用与跟踪鉴定粒长基因Lkl2。
表2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种大麦粒长基因Lkl2的分子标记HRM7，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记与大麦粒长基因Lkl2共定位于大麦4H染色体，且与Lkl2之间的遗传距离为0.5cM。
3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，大麦粒长基因Lkl2显著增加大麦籽粒长度，LOD值大于5.06。
4.一种鉴定权利要求1所述的大麦粒长基因Lkl2的分子标记HRM7的方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将与野生大麦Awcs276分为同一类型的植株鉴定为含有大麦粒长基因Lkl2的植株；
其中，所述荧光定量PCR引物包括：
如SEQ ID No.2所示的上游引物，和如SEQ ID No.3所示的下游引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增；
(2)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上游引物和下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL；
(3)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s；
(4)利用步骤(3)获得的结果进行基因分型。
6.权利要求1-3中任意一项所述分子标记的荧光定量PCR引物，其特征在于，上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。
7.权利要求1所述的分子标记HRM7在大麦育种中的应用。
8.权利要求1所述的分子标记HRM7在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为粒长基因Lkl2。
9.权利要求4或5所述的方法在大麦育种改良中的应用。
10.权利要求6所述的荧光定量PCR引物在分子标记辅助大麦高产育种中的应用。
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