CN105524890B - 一种葡萄糖氧化酶egod及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明涉及一种葡萄糖氧化酶EGOD及其基因和应用。其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明的葡萄糖氧化酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，可广泛应用于食品、饲料、医药等领域。

Description

一种葡萄糖氧化酶EGOD及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明涉及一种葡萄糖氧化酶EGOD及其编码基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)，***名为D-葡萄糖氧化还原酶(ECl.1.3.4)，能专一性地将葡萄糖与氧反应形成葡萄糖酸和过氧化氢，广泛分布于动物、植物和微生物体内，可以食品、饲料、医药等领域。

目前，GOD通常采用微生物发酵法进行生产，如黑曲霉、青霉属等、但生产水平较低，生产成本高。本发明开发出了一种高效的葡萄糖氧化酶工程菌，具有较高的发酵生产水平，可以较大程度地降低葡萄糖氧化酶的生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶EGOD。

本发明的另一目的是提供编码上述葡萄糖氧化酶的基因Gegod。

本发明的另一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因Gegod的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述葡萄糖氧化酶EGOD的方法。

本发明的另一目的是提供上述葡萄糖氧化酶EGOD的应用。

本发明提供了一种来自于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶EGOD，该葡萄糖氧化酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

该葡萄糖氧化酶蛋白由584个氨基酸残基组成，其理论pI/Mw为4.88/64104.81。

本发明还提供了编码上述葡萄糖氧化酶的基因Gegod，该基因的序列如SEQ IDNO.2所示：

本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因Gegod的重组载体，优选为Gegod-pPIC9K。将本发明的葡萄糖氧化酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的葡萄糖氧化酶基因Gegod***到质粒pPIC9K上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒Gegod-pPIC9K。

本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因Gegod的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母GS115。

本发明还提供了一种高效表达上述葡萄糖氧化酶基因Gegod的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化毕赤酵母感受态细胞GS115，得到重组菌株Gegod-pPIC9K-GS115；

2)采用筛选获得的重组菌株在25L发酵罐中进行发酵培养，诱导该葡萄糖氧化酶的表达；以及

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的该葡萄糖氧化酶进行相关测试。

其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：

第一阶段为菌体培养阶段，按10％比例接入种子，培养20-24小时，以流加完葡萄糖或甘油为标志；

第二阶段为饥饿阶段，流加葡萄糖或甘油结束后，当溶氧上升至80％以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；

第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，整个培养时间为190小时左右。

发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜进行后处理。利用本发明的方法表达上述葡萄糖氧化酶，可达到1500U/mL左右的发酵水平，与国内外目前技术相比，本发明的葡萄糖氧化酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平。

附图说明

图1葡萄糖氧化酶在25L罐中的发酵过程曲线；

图2葡萄糖氧化酶的最适反应温度；

图3葡萄糖氧化酶耐温性能曲线；

图4葡萄糖氧化酶的最适反应pH值；

图5葡萄糖氧化酶抗胃蛋白酶、胰蛋白酶消化的性能曲线；

图6葡萄糖氧化酶贮存稳定性曲线；

图7各种离子及试剂对葡萄糖氧化酶活力的影响。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生化材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌Topl0、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K均购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

逆转录酶SuperScript^TM III购自Invitrogen公司，RNA提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、限制性内切酶、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。

3、培养基

基本盐培养基(BSM)：磷酸二氢铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.4毫升PTM1

微量无机盐溶液(PTM1)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％

实施例1、黑曲霉(GOD－AN1312)葡萄糖氧化酶基因的克隆

在PDA平板上培养葡萄糖氧化酶生产菌株(黑曲霉，Aspergillus niger)，取孢子制成孢子悬液，然后采用紫外线、硫酸二乙酯(DES)进行单独或复合诱变处理，筛选获得一株葡萄糖氧化酶突变株GOD－AN1312。

对该突变株进行发酵培养，其发酵培养基组成如下：

蛋白胨1％、酵母粉0.5％、葡萄糖5％、磷酸二氨钾0.2％、硫酸镁0.10％，初始pH6.0。

以上发酵培养基于121℃、0.1MPa下灭菌30min，冷却后接种，于30℃、200rpm条件下培养5天。

按照逆转录酶SuperScript^TM III Reverse Transcriptase的操作说明，采用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉(GOD－AN1312)的总RNA，合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增，并将PCR产物进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素G418筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒并进行测序。测序结果表明，克隆得到的DNA含有葡萄糖氧化酶完整的开放阅读框。该葡萄糖氧化酶基因(Gegod)全长1755bp，编码584个氨基酸，得到的重组表达载体命名为Gegod-pPIC9K。

所用扩增引物如下：

GOD-R(EcoRI)：

5’TCACCGAATTCATGCTTCGAAGCTTGACCGT3’

GOD-F(NotI)：

5’GCACAGCGGCCGCTTACAAGGCAAAGAGAGCAG3’

将上述重组表达载体Gegod-pPIC9K采用BglⅡ进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母GS115，电转化后涂布于含G418的YPD平板上进行筛选，筛选获得葡萄糖氧化酶发酵水平最高的工程菌Gegod-pPIC9K-GS115。

实施例2、葡萄糖氧化酶工程菌株的发酵培养

采用筛选获得的葡萄糖氧化酶重组菌株Gegod-pPIC9K-GS115进行高密度液体发酵培养。

配制10L基础盐培养基，在25L液体发酵罐中高温灭菌后，冷却至常温。用氨水调节发酵液的pH值为4.60，接入1L液体种，发酵温度设定为30℃，调节转速和空气流量控制整个发酵过程中溶氧大于20％以上。

整个发酵过程分3个阶段：

第一阶段为菌体培养阶段，流加已灭菌的2L 50％的甘油或葡萄糖，培养20-24小时，流加甘油完后结束；

第二阶段为饥饿阶段，甘油或葡萄糖流加完之后，当溶氧上升至80％以上、pH上升即表明该阶段结束，为期约30min；

第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在190小时左右。

在发酵过程中的定时取样测定酶活，发酵过程中葡萄糖氧化酶的表达情况如附图1所示，发酵190h的发酵液酶活为1536U/mL。

实施例3、葡萄糖氧化酶活力检测

酶活单位定义：在pH5.5、温度37℃条件下，每分钟催化产生1μmol H₂O₂所需的酶量为一个单位(1U)。

检测方法：在pH5.5、温度37℃条件下，依次加入0.21mmol/L邻联茴香胺甲醇缓冲液2.5mL、18％葡萄糖溶液0.3mL、60U/mL辣根过氧物酶溶液0.1mL，置37℃恒温水浴中，恒温后加入0.1mL适当的稀释酶液摇匀，反应3min后，加入2M硫酸2mL终止反应，于540nm处测定吸光值A₅₄₀。同时，取一管不加酶液，加入0.1mL蒸馏水，其它均同样品酶检测，获得空白对照时的吸光值A₀，计算△A＝A₅₄₀-A₀，查找标准曲线，可获得相对应的酶活。

标准曲线制备：采用SIGMA公司的葡萄糖氧化酶标准品做标准曲线。将葡萄糖氧化酶标准品分别稀释成0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4U/mL。在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺溶液、0.3mL的18％D-葡萄糖液、60U/mL辣根过氧化物酶溶液0.1mL，然后加入0.lmL稀释好的葡萄糖氧化酶标准品，其中空白对照管不加酶液标准品，加入0.1mL蒸馏水，于540nm处测定吸光值，反应3min后加入2M硫酸2mL终止反应，于540nm处测定吸光值。以吸光值△A为横坐，标准酶活为纵坐标制备标准曲线。

1、最适反应温度测定

参照葡萄糖氧化酶的检测方法，分别在不同温度下进行反应，测定葡萄糖氧化酶样品酶活，并以最高酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。

该葡萄糖酶的最适反应温度曲线见图2，其最适反应温度为35℃左右。

2、耐温性能测定

分别取适量发酵获得的葡萄糖氧化酶液体样品，在不同温度下处理10min，冷却后按照葡萄糖氧化酶检测方法进行测定，以未处理样品酶活力为100％，其它温度处理后测得的酶活与之相比，即得到该处理温度下的相对酶活。

该葡萄糖氧化酶的耐温性能曲线见图3，从图中可看出，该酶的耐温性能良好，液体酶在80℃下处理10min，酶活仍可达到48.5％左右。

3、最适反应pH测定

设定一系列检测pH(2.0-9.0)，配制不同pH值的缓冲液，在所设定的pH值下测定样品酶活，以最高酶活为100％，其它检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。

该葡萄糖氧化酶的最适反应pH曲线见图4，其最适反应pH为5.5左右。

4、葡萄糖氧化酶抗胃蛋白酶、胰蛋白酶的消化性能测定

取1mL该葡萄糖氧化酶，分别加入0.5mL 0.1mg/mL胃蛋白酶(pH 2.0浓度100U/mL)和0.5mL 0.1mg/mL胰蛋白酶(pH 7.0浓度200U/mL)，于37℃处理不同时间后测酶活。检测结果如图5所示。

其中胃蛋白酶处理90min后，酶活性仍剩余86.2％，用胰蛋白酶处理90min后，剩余83.1％。这说明该葡萄糖氧化酶具有优良的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化能力。

5、葡萄糖氧化酶贮存稳定性测定

将葡萄糖氧化酶固体样品置于室温下贮存，每月定时取样，按照葡萄糖氧化酶的检测方法，检测保存不同时间的样品酶活，以测定该酶的贮存稳定性能。

该葡萄糖氧化酶的贮存稳定性测定结果见图6。

结果显示该葡萄糖氧化酶的稳定性能良好，在室温条件下保存一年，剩余酶活仍可达到85％左右。

6、各种离子及试剂对葡萄糖氧化酶活力的影响

在酶促反应体系中加入不同的离子及试剂(K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Co^{2 +}、Cu²⁺、EDTA、SDS)，使体系中的终浓度为1mM，以未处理的样品酶活为100％，结果如图7所示。

结果表明，Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺对酶活有一定的激活作用，K⁺、Mn²⁺、Co²⁺、EDTA对酶活影响不大，Fe³⁺、Cu²⁺、SDS则对酶活有一定程度的抑制作用，尤其是SDS对该酶的抑制较严重。

Claims (8)

1.一种葡萄糖氧化酶EGOD，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶EGOD的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种葡萄糖氧化酶基因Gegod，其特征在于，编码权利要求1所述的葡萄糖氧化酶EGOD。

3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因Gegod，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因Gegod的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因Gegod的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为Gegod-pPIC9K，将权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因Gegod***到质粒pPIC9K上，使该基因列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体Gegod-pPIC9K。

6.包含权利要求2所述葡萄糖氧化酶基因Gegod的重组菌株。

7.一种制备葡萄糖氧化酶EGOD的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导葡萄糖氧化酶EGOD的表达；以及

3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶EGOD。

8.权利要求1所述葡萄糖氧化酶EGOD的应用。