CN105518022B - 具有嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及轮状病毒颗粒用于展示单独形式或与其它分子的复合物形式的异源蛋白的应用。本发明还涉及采用冷冻电子显微镜(冷冻EM)，利用这些经修饰的轮状病毒颗粒以快速确定所述异源蛋白或所述复合物的结构的方法。本发明还涉及使患者免疫的方法，其中所述方法包括给予所述患者本发明的经修饰的轮状病毒颗粒。

Description

具有嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年7月8日提交的欧洲专利申请号13175637.1的权益。上述 申请的全部教导内容通过引用纳入本文。
序列表
一同提交序列表的电子版本，其通过引用纳入本文并形成该提交申请的部 分。
政府支持
本发明是在美国政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes ofHealth) 授予的基金号P01-GM062580和AI-89618资助完成。美国政府享有本发明的一定权利。
发明领域
本发明涉及轮状病毒颗粒用于展示单独形式或与其它分子的复合物形式 的异源蛋白的应用。本发明还涉及采用冷冻电子显微镜(冷冻EM)，利用这些经 修饰的轮状病毒颗粒以快速确定所述异源蛋白或所述复合物的结构的方法。本 发明还涉及使患者免疫的方法，其中所述方法包括：给予所述患者本发明的经 修饰的轮状病毒颗粒。
背景
呼肠病毒科(Reoviridae)家族包括结构相关的一组病毒。该病毒家族的成员 可造成哺乳动物与鸟类的肠胃***和呼吸道感染。该家族的一些病毒还能感染 植物。
所述呼肠病毒科是无包膜、双链RN病毒，其由二十面体衣壳形成，该衣壳 通常由蛋白质外层和一个或多个蛋白质内层组成。轮状病毒(Rotavirus)属形成 呼肠病毒科家族的部分。轮状病毒形成三层的病毒颗粒。轮状病毒颗粒的外层 由壳蛋白VP7，和纤突蛋白VP4组成；中层由VP6组成；而内层由VP2组成。所 述三层的病毒颗粒在通过胰蛋白酶激活之后是感染性的。在轮状病毒细胞侵入 过程中，所述病毒颗粒的外层经由出芽“脱壳”机制移除，从而双层颗粒侵入胞 质。在细胞侵入过程中，轮状病毒穿透细胞膜，或可能穿透内体膜。所述双层 轮状病毒颗粒具有转录活性。在胞质中，其转录基因组，通过其表面的孔挤出mRNA。新转录本被用于制备轮状病毒蛋白质和新双链RNA基因组区段，其被 包装成新形成的病毒颗粒。
对于一些呼肠病毒，脱壳过程可采用纯化的病毒颗粒体外刺激。在轮状病 毒的情况中，钙螯合或热激会造成病毒颗粒的体外脱壳。一旦移除了外部蛋白 质层，所得的轮状病毒双层颗粒能够被重组表达形式的形成外层的蛋白质“再包 被”。通过用重组VP4和VP7再包被，能够形成非常类似成熟病毒粒的感染性的 再包被的轮状病毒颗粒。通过用单独的VP7再包被，能够形成感染性最小的、 三层的、无纤突颗粒。通过对外层的个体蛋白质的编码区进行遗传修饰并使其 重组表达，能够在再包被实验中研究形成所述外层的蛋白质的性质，而不需要 产生完全重组病毒。为了描述这些类型的实验，引入术语“再包被遗传学”。
对于呼肠孤病毒，感染性的亚病毒颗粒的亚稳态已允许采用冷冻电子显微 镜(冷冻EM)来阐明呼肠孤病毒进入其宿主细胞的潜在机制的结构基础。类似 地，已采用冷冻EM，利用体外再包被的轮状病毒颗粒来研究轮状病毒组装和 脱壳的分子相互作用。本发明建立于通过这些再包被和冷冻EM研究所带来的 先进技术。
发明内容
高分辨率冷冻EM与再包被遗传学的结合使其能够超越轮状病毒本身的研 究而使轮状病毒模型的应用更加先进。发明人已发现，轮状病毒颗粒可用于对 展示在经修饰的轮状病毒颗粒的表面上的异源性三聚体蛋白质进行快速结构 测定。经修饰以在其表面上展示异源性三聚体蛋白质的轮状病毒颗粒也有利于 生产众多的新型疫苗。
本发明提供包含嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒，所述嵌合表面蛋白由连接 至异源蛋白的轮状病毒表面蛋白组成。在本发明的一个方面，所述轮状病毒表 面蛋白通过接头序列连接至所述异源蛋白。在本发明的另一个方面中，所述轮 状病毒表面蛋白通过衔接子***(adapter system)连接至所述异源蛋白。在本发明的一个优选方面，所述异源蛋白通过两部分型(two-part)衔接子***非共价地结合至所述轮状病毒表面蛋白，其中，所述衔接子***的一部分连接至所述轮状病毒表面蛋白，并且所述衔接子***的另一部分连接至所述异源蛋白，其中所述衔接子***的这两部分形成稳定的复合物，因此将所述异源蛋白非共价地连接至所述轮状病毒表面蛋白。所述嵌合表面蛋白可通过体外再包被双层轮状病毒颗粒(DLP)成为所述轮状病毒颗粒外层的组分。
本发明还提供包含如下开放阅读框的第一核酸，该开放阅读框编码含有轮 状病毒表面蛋白、第一衔接多肽和任选的接头序列的经修饰的轮状病毒表面蛋 白。本发明还提供包含如下开放阅读框的第二核酸，该开放阅读框编码包含异 源蛋白、第二衔接多肽和任选的接头序列的融合蛋白。第一衔接多肽和第二衔 接多肽能够形成稳定的复合物。通常，本发明核酸中的开放阅读框操作性地连 接至启动子序列。在一些实施方式中，所述衔接多肽包含七肽重复序列。还提 供包含本发明的核酸的细胞。所述核酸和包含所述核酸的细胞可用于制备本发 明的嵌合表面蛋白。
本发明还涉及包含本发明的第一和第二核酸序列的试剂盒。在一些实施方 式中，本发明的试剂盒可包含第一核酸和第二核酸，第一核酸编码经修饰的轮 状病毒表面蛋白，所述经修饰的轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白和第 一衔接多肽，第二核酸包含编码第二衔接多肽和多克隆位点的核苷酸序列，由 此在多克隆位点***异源蛋白的编码区能产生编码融合蛋白的开放阅读框，所 述融合蛋白包含所述异源蛋白和第二衔接多肽，其中，第一衔接多肽和第二衔 接多肽能够形成稳定的复合物。本发明的试剂盒还可包含轮状病毒颗粒。所述 轮状病毒颗粒可源自轮状病毒的相同物种，所述轮状病毒表面蛋白源自该相同 物种或来自不同物种。例如，恒河猴轮状病毒VP7可用于再包被由牛轮状病毒 制备的DLP，反之亦然。
包含嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒可通过多种方法制备。本发明的优选方 法涉及：在培养基中生长的细胞中繁衍包含外层的天然轮状病毒颗粒，从所述 培养基纯化所述颗粒，从所述颗粒移除外层以获得轮状病毒DLP，和用一种或 多种嵌合表面蛋白再包被所述轮状病毒DLP，以形成包含一种或多种所述嵌合 表面蛋白的轮状病毒颗粒。天然轮状病毒颗粒是三层的颗粒，其中，最外侧的 第三层形成所述轮状病毒颗粒的外壳。
在一个具体方面，本发明涉及第一融合蛋白，其包含形成三聚体的轮状病 毒表面蛋白、七肽重复序列，和任选的接头序列。本发明还提供第二融合蛋白， 所述第二融合蛋白包含形成三聚体的异源蛋白、七肽重复序列，和任选的接头 序列。第一融合蛋白和第二融合蛋白通过其中各自包含的七肽重复序列能够形 成稳定的复合物。在一些实施方式中，本发明提供由第一融合蛋白和第二融合 蛋白形成的嵌合表面蛋白。所述嵌合表面蛋白可在轮状病毒颗粒的表面上展 示。
在本发明的一个方面，包含嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒可用于确定形成 所述嵌合表面蛋白的部分的异源蛋白的结构。例如，本发明提供用于获得嵌合 表面蛋白的三维模型的方法，其中，所述方法包括如下步骤：(i)用包含全部或 部分异源蛋白的嵌合表面蛋白再包被轮状病毒DLP以产生展示所述嵌合表面蛋 白的轮状病毒颗粒的悬液，(ii)冷冻所述悬液，(iii)采用冷冻EM对所述轮状病毒 颗粒成像以获得多张显微照片，和(iv)分析所述多张显微照片以获得所述嵌合 表面蛋白的三维模型。在一些实施方式中，步骤(i)可细分为两个步骤，即，(a) 再包被步骤，其中，所述轮状病毒DLP用轮状病毒表面蛋白再包被，所述轮状 病毒表面蛋白包含第一衔接子以形成轮状病毒颗粒，和(b)结合步骤，其中，所述再包被的轮状病毒DLP在异源蛋白的存在下孵育，所述异源蛋白包含第二衔 接子，由此形成第一衔接子和第二衔接子的复合物，从而使嵌合表面蛋白展示 在所述轮状病毒颗粒的表面上。在一些情况中，所述方法可经修改以确定与特 异性结合至所述异源蛋白的分子结合的异源蛋白的结构。所述经修改的方法包 括如下步骤：(i)用包含全部或部分异源蛋白的嵌合表面蛋白再包被轮状病毒 DLP以产生展示所述嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒的悬液，(ii)向该悬液添加 特异性结合至所述异源蛋白的分子，其中，所述分子与所述嵌合表面蛋白形成 复合物，(iii)冷冻所述悬液，(iv)采用冷冻EM对所述轮状病毒颗粒成像以获得 多张显微照片，和(v)分析所述多张显微照片以获得与所述分子复合的嵌合表 面蛋白的三维模型。所述分子可以是蛋白质分子。例如，该蛋白质分子可以是 特异性结合所述异源蛋白的受体或抗体的全部或部分。或者，所述蛋白质分子 可以是特异性结合至所述异源蛋白的多肽或肽。在其它实施方式中，所述分子 是非蛋白质分子。例如，所述非蛋白质分子可以是核酸。
在另一个方面中，根据本发明制备的轮状病毒颗粒被用作药物。在一个实 施方式中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含含有本发明的嵌合表面蛋 白的轮状病毒颗粒。本发明还涉及一种治疗有此需要的患者的方法，所述方法 包括给予所述患者本发明的轮状病毒颗粒，例如以本发明免疫原性组合物的形 式给予。
通过适应本文所述的方法，本发明的基础概念可拓展成其它(三聚体或非三 聚体)异源蛋白和其它病毒(尤其是呼肠孤病毒)或组装形式(例如病毒样颗粒、铁 蛋白笼等)。
发明详述
病毒颗粒
轮状病毒是呼肠病毒科家族中的双链RN病毒的属，其包括五种已知类型 (轮状病毒A-E)。轮状病毒是儿童肠胃炎的主要致病因素。轮状病毒是无包膜、 三层的二十面体颗粒。感染性的三层的颗粒(TLP)或病毒粒由非感染性的双层颗 粒(DLP)形成，通过用壳蛋白VP7和纤突蛋白VP4包被DLP形成。VP7是三聚体， 而260个此类三聚体修饰经包被的颗粒的外侧。所述DLP，其由同心VP2和VP6 二十面体蛋白质层组成，直径为约
Figure BDA0000937042360000051
并且以壳体包裹11种双链RNA基因 组区段，病毒聚合酶(VP1)和加帽酶(VP3)。在感染细胞的过程中，VP4和VP7 蛋白(其形成所述轮状病毒颗粒的外层)，在低钙环境(很可能在内体隔室中)从DLP解离–该过程称为“脱壳”–并且将包含病毒RNA转录机器的DLP递送进 入胞质。在那里，DLP合成帽，并释放11种mRNA物质的拷贝。
VP4和VP7从轮状病毒颗粒的解离或“脱壳”可通过使轮状病毒颗粒在钙螯 合剂例如EDTA或EGTA的存在下孵育，或通过热激来体外进行。所得的DLP可 用重组表达的VP4和VP7体外再包被以形成完全感染性的轮状病毒颗粒。以此 方式再包被的颗粒是非常有序的，并且可给出高分辨率冷冻EM图像和密度图。 采用体外重建的TLP，冷冻EM已被用于以与X射线晶体学相当的分辨率研究轮 状病毒组装和脱壳的分子相互作用(参见参考文献1和2)。
发明人在本文中显示，异源性三聚体蛋白质(例如流感血凝素)能连接至三 聚体VP7蛋白，由此形成能够从合适地再包被的轮状病毒DLP的表面突出的嵌 合表面蛋白，因此能够采用相同冷冻EM方法来测定所述异源蛋白的结构，所 述冷冻EM方法已于先前提供接近原子分辨率的轮状病毒及其亚颗粒的结构。 所述方法第一次使开发用于确定抗原-抗体复合物的结构的高通量试验成为可 能。这在先前是不可能的，因为X射线晶体学(其已是测定抗原-抗体复合物的结 构的可用方法)的限制条件。
原则上，包含内层和外层的任何无包膜的二十面体病毒颗粒均可用于实践 本发明的方法。例如，采用任何二十面体病毒，展示包含全部或部分异源蛋白 的嵌合表面蛋白是简易可行的，为此已建立了用于生成病毒颗粒的反向遗传学 ***。基于质粒的，由十种呼肠孤病毒cDNA构建体组成的反向遗传学***已 被建立用于哺乳动物呼肠孤病毒(参见参考文献3)。铁蛋白笼的八聚体对称也具 有3倍轴对称，并且适合于实践本发明。可组装成颗粒状、常规结构的具有三 倍轴对称的其它蛋白质可适合于实践本发明。
理想上，无包膜二十面体病毒的病毒颗粒的外层可被移除或剥去，例如通 过蛋白酶处理或在低钙条件下，以产生仅包含内层且可用重组产生的外层蛋白 再包被的亚病毒颗粒。通过添加重组表达的外层蛋白将亚病毒颗粒体外再组装 或再包被成完全病毒颗粒在以下情况中是特别有利的：所述嵌合表面蛋白的存 在会干扰采用反向遗传学方法的细胞培养物中繁衍的病毒的正确组装。此外， 进需要构建用于外层蛋白的表达载体，排除了对适当的高效的基于质粒的反向 遗传学***的需要。天然病毒可在组织培养细胞中简单繁衍，并且病毒颗粒可 被剥去外层，并用重组表达的外层蛋白体外再组装。因此，采用依赖于将亚病 毒颗粒体外再包被成完全病毒颗粒的方法消除了对转染大量的质粒的需要，并排除了从基于质粒的反向遗传学***产生大量的病毒颗粒所通常需要的额外 繁衍步骤，这使所述方法更加适于高通量应用。
根据发明人的理解，病毒颗粒的外层可被剥去且亚病毒颗粒可用重组表达 的外层蛋白再包被以形成感染性的病毒颗粒的所有已知的无包膜二十面体病 毒均属于呼肠病毒科家族。该家族被细分为两个亚家族，光滑呼肠孤病毒亚科 (Sedoreovirinae)和刺突呼肠孤病毒亚科(Spinareovirinae)，其分别包含六个和九 个属。亚家族光滑呼肠孤病毒亚科包括卡多呼肠孤病毒(Cardoreovirus)，米莫 呼肠孤病毒(Mimoreovirus)、环状病毒(环状病毒)、植物呼肠弧病毒 (Phytoreovirus)、轮状病毒(Rotavirus)和东南亚十二节段RNA病毒(Seadornavirus) 属。亚家族刺突呼肠孤病毒亚科包括水产呼肠孤病毒(Aquareovirus)、科罗拉多 壁蝨热病毒(Coltivirus)、质型多角体病毒(Cypovirus)、迪诺维纳病毒 (Dinovernavirus)、斐济病毒(Fijivirus)、虫源呼肠孤病毒(Idnoreovirus)、真菌呼 肠孤病毒(Mycoreovirus)、正呼肠孤病毒(Orthoreovirus)和水稻病毒(Oryzavirus)属。
除了轮状病毒以外，哺乳动物正呼肠孤病毒也有利于实践本发明。对于这 些病毒，用于外衣壳的完全体外组装的合适条件和冷冻EM的应用均已成熟建 立(参见参考文献1、2、4和5)。冷冻EM已经对其应用并且其结构信息已经可得 的其它正呼肠孤病毒(例如狒狒或禽类正呼肠孤病毒)水稻病毒(例如水稻皱缩 矮化病毒)和水产呼肠孤病毒(参见参考文献6、7和8)也可适合于实践本发明。
质型多角体病毒和迪诺维纳病毒仅具有等同的内衣壳，并因此通常被认为 不适用于实践本发明，从而被认为是较不优选的。在某些实施方式中，用于本 发明的无包膜二十面体病毒不包括质型多角体病毒和迪诺维纳病毒。在一个优 选实施方式中，本发明的病毒可以生物安全水平2或更低水平制造(参见参考文 献9)。
优选地，用于实践本发明的病毒颗粒具有三种或更少的外层蛋白。更优选 地，所述病毒颗粒的外层可由单一外层蛋白形成，其为用于制备所述嵌合表面 蛋白的外表面蛋白。小数量的外层蛋白是有利的，因为需要被重组表达以再包 被剥离后的亚病毒颗粒的蛋白质较少。
例如，轮状病毒具有两种外层蛋白，VP4和VP7，但形成轮状病毒颗粒的 外层仅需要VP7是壳蛋白。在大多数情况中，仅仅采用一种外层蛋白，VP7， 来再包被轮状病毒DLP就足以实践本发明。
嵌合表面蛋白
一方面，本发明涉及包含共价连接至异源蛋白的轮状病毒表面蛋白的嵌合 表面蛋白。所述轮状病毒表面蛋白可通过接头序列连接至所述异源蛋白。在一 个特定实施方式中，所述异源蛋白被***所述轮状病毒表面蛋白的柔性环，其 为外表面暴露部分。在一些情况中，删去所述轮状病毒表面蛋白的部分以更好 地配合所述接头序列和/或异源蛋白。例如，短N末端和C末端截短体(≤10氨基 酸)通常不影响轮状病毒VP7蛋白再包被轮状病毒DLP的能力。此外，当采用VP7 来再包被DLP时，形成从所述病毒颗粒延伸出来的表面环的氨基酸序列不是必 需的。缺失是否会影响VP7蛋白再包被DLP的能力可通过使重组表达的VP7蛋白 在DLP的存在下孵育，并观察再包被的病毒颗粒的形成来评估。
在本发明的另一个方面中，所述轮状病毒表面蛋白通过衔接子***非共价 地连接至所述异源蛋白。在本发明的一个优选方面，所述异源蛋白通过两部分 型衔接子***非共价地结合至所述轮状病毒表面蛋白，其中，所述衔接子*** 的一部分连接至所述轮状病毒表面蛋白和所述衔接子***的另一部分连接至 所述异源蛋白，其中所述衔接子***的这两部分形成稳定的复合物从而将所述 异源蛋白非共价地连接至所述轮状病毒表面蛋白。所述衔接子***通常由第一 衔接多肽和第二衔接多肽组成。第一衔接多肽融合至所述轮状病毒表面蛋白， 任选地通过接头序列融合。第二衔接多肽融合至所述异源蛋白，任选地通过接 头序列融合。第一和第二衔接多肽彼此相互作用以形成稳定的复合物，由此将所述轮状病毒表面蛋白非共价地连接至所述异源蛋白，从而形成嵌合表面蛋 白。
病毒表面蛋白
适合于实践本发明的病毒颗粒的外层通常包含数种不同外表面蛋白。主要 表面蛋白特别合适于展示异源蛋白，因为它覆盖病毒颗粒的大部分表面。例如， 轮状病毒的外表面(排除纤突)由780个拷贝的VP7蛋白形成，其形成同源三聚体。 选择具有形成同源三聚体的主要表面蛋白的病毒颗粒是用于实践本发明所特 别优选的。
在一个特定实施方式中，所述病毒表面蛋白是轮状病毒表面蛋白。在另一 个特定实施方式中，所述病毒表面蛋白是糖蛋白。
具有可适合于实践本发明的病毒表面蛋白的其它病毒包括正呼肠孤病毒。 例如，水产呼肠孤病毒的病毒外衣壳由称为VP5的蛋白质的200个三聚体组成。 在哺乳动物正呼肠孤病毒中，感染性的呼肠孤病毒颗粒的外层包含600个拷贝 的三聚体膜穿透蛋白μ1，其与蛋白质伴侣σ3(也以600个拷贝形式存在)联接，从 而形成异六聚体。
异源蛋白
采用三聚体轮状病毒表面蛋白可展示许多异源蛋白，前提条件是选择何时 长度的接头和/或表面蛋白中的合适***位点，以避免单体组装成三聚体过程中 发生位阻现象。对于所述异源蛋白，没有尺寸上限，只要所述异源蛋白形成的 体积不与相邻的其它固定的异源蛋白的体积重叠即可。优选地，采用衔接子系 统来在三聚体轮状病毒表面蛋白上展示所述异源蛋白。不具溶解性、形成高级 寡聚体或聚集体的异源蛋白通常被认为不适于实践本发明。
考虑到位阻现象的任何尺寸约束条件均可通过选择合适的接头或衔接子 ***来克服。
对于所述异源蛋白，术语“异源性”通常指，所述蛋白质不是轮状病毒蛋白 质。在一些实施方式中，表述“异源蛋白”可以指所述蛋白质不源自与展示所述 蛋白质所用相同的轮状病毒毒株。
三聚体表面蛋白特别合适于展示三聚体异源蛋白。三聚体异源蛋白的示例 包括三聚体病毒细胞侵入蛋白和其它三聚体病毒表面蛋白，具体是被中和抗体 靶向的那些。具体的示例有，流感血凝素(HA)、人免疫缺陷型病毒(HIV)gp140、 埃博拉病毒糖蛋白、狂犬病病毒糖蛋白(RVG)，山羊关节炎-脑炎病毒的Env蛋 白，呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白，人单纯性疱疹病毒和人巨细胞病毒(HCMV) 中发现的gB蛋白及其复合物，等。
在一些实施方式中，所述轮状病毒表面蛋白和/或所述异源蛋白包含三聚化 标签，以协助由三聚体轮状病毒表面蛋白和三聚体异源蛋白形成的异六聚体复 合物的组装。所述三聚化标签，尤其是基于卷曲螺旋的三聚化标签(例如GCN4， [10])，也可作为结构模块以延伸异源蛋白的可用空间，所述异源蛋白在用经修 饰的轮状病毒VP7蛋白再包被的轮状病毒颗粒的表面上展示。另一种合适的三 聚化标签可源自细菌噬菌体T4噬菌体次要纤维蛋白(Fibritin)[11]。
在某些实施方式中，非三聚体形式的异源蛋白可与所述轮状病毒表面蛋白 上存在的三聚化标签相互作用。举例来说，如果所述异源蛋白具有能够与基于 卷曲螺旋的三聚化标签的α螺旋相互作用的可及的α螺旋，则异源蛋白能够结合 该三聚化标签。若没有位阻现象，至多三个所述异源蛋白能够同时结合所述三 聚化标签，形成六螺旋束状物。如果结合了少于三个所述异源蛋白，则该六螺 旋束状物将会是不完整的，其包含轮状病毒蛋白质上存在的三聚化标签造成的 内部三螺旋，但仅包含所述束状物的一个或两个外螺旋。所述非三聚体异源蛋 白可具有1、2、4或更多个亚基(即，是单体、二聚体、四聚体或其它寡聚体)， 前提条件是所述亚基中至少一个具有能够与所述轮状病毒表面蛋白上存在的 三聚化标签相互作用的α螺旋。
在某些实施方式中，单体异源蛋白可包括排列的多个α螺旋，从而，多于 一个螺旋能够与所述轮状病毒表面蛋白上存在的三聚化标签的α螺旋相互作 用，形成完整或局部六螺旋束状物。在某些实施方式中，其中至少三个所述单 体包含合适排列的α螺旋的四聚体(或更高级结构)可与连接至所述轮状病毒表 面蛋白的三聚化标签联合，以形成六螺旋束状物。在某些实施方式中，其中至 少三个所述单体包含合适排列的α螺旋的四聚体(或更高级结构)可与和所述轮 状病毒表面蛋白相联的三聚化标签联合，以形成局部六螺旋束状物，其缺失所 述外螺旋之一。所述异源蛋白的亚基可以是相同的(即，同二聚体、同三聚体、同四聚体等)或可以是不相同的(即，异二聚体、异三聚体、异四聚体等)。
如果所述轮状病毒表面蛋白上存在的三聚化标签不是α螺旋卷曲螺旋，则 所述异源蛋白上的相互作用性结构元件可具有与三聚化标签而非α螺旋结合的 二级结构。
优选地，所述异源蛋白不是特异性结合至轮状病毒表面蛋白的抗体。
衔接子***
在本发明的一些实施方式中，采用衔接子***来在轮状病毒颗粒上展示所 述异源蛋白。所述衔接子***通常由两种衔接子分子组成。第一衔接子分子共 价连接至经选择以展示异源蛋白的轮状病毒表面蛋白。第二衔接子分子共价连 接至所述异源蛋白。第一衔接子分子和第二衔接子分子彼此相互作用以形成稳 定的复合物。
衔接子***通常由两种衔接多肽组成。第一衔接多肽融合至经选择以展示 异源蛋白的轮状病毒表面蛋白。第二衔接多肽融合至所述异源蛋白。第一衔接 多肽和第二衔接多肽可彼此相互作用以形成稳定的复合物。
已知许多多肽能够彼此相联以形成稳定的复合物。在一些情况中，这些多 肽将源自不同蛋白质，例如受体和配体或抗体和抗原。在其它示例中，这些多 肽可源自相同蛋白质，例如HIV gp41的两种七肽重复序列。
也可设想不依赖于两种衔接多肽之间的相互作用的合适的衔接子***。例 如，所述轮状病毒表面蛋白可经修饰以包含特定糖基化位点，并且所述异源蛋 白可经修饰以包含能够特异性地识别所述糖基化位点处的聚糖的凝集素结构 域。识别特定聚糖结构的凝集素的示例是本领域熟知的。
不依赖于两种衔接多肽之间的相互作用的另一种合适的衔接子***是链 霉亲和素-生物素***。优选采用已经突变以防止四聚体形成和增强稳定性的单 体链霉亲和素[12]。所述单体链霉亲和素可被融合至经选择以展示异源蛋白的 所述轮状病毒表面蛋白。为了发生复合物形成，所述异源蛋白是生物素化的。 酶促生物素化是优选的，因为其允许生物素特异性地连接至待生物素化的蛋白 质的氨基酸残基。例如，所述异源蛋白可通过***“AviTag”或“Acceptor Peptide” (AP)来修饰，其可在生物素和ATP的存在下通过生物素连接酶(例如，BirA)被 特异性地生物素化(具体参见参考文献13)。
不依赖于两种衔接多肽之间的相互作用的另一种衔接子***可包括结合 至半抗原(例如，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10- 四乙酸(DOTA))的抗体。或者，螯合剂DTPA和DOTA可与金属离子联用以形成 螯合物。
衔接子***的应用并不是实践本发明所必需的。然而，优选采用衔接子系 统以最优地保持所述异源蛋白的结构特征，具体是待展示在轮状病毒颗粒上的 其它病毒的三聚体表面蛋白的结构特征。衔接子***的应用是特别有利的，因 为已被修饰以包含第一衔接子的轮状病毒表面蛋白仅需要制备一次，并且随后 可与已经修饰以包含相容的第二衔接子的任何异源蛋白联用。
采用衔接子***的另一个优势是，对于嵌合表面蛋白的各个组分能够分开 最优化表达和纯化。在大多数情况中，衔接多肽序列的***将不会改变病毒表 面蛋白或所述异源蛋白的与其表达或纯化相关的那些特点。因此，通常采用现 有的表达***和纯化方法而无需修改即可制备大量的包含第一衔接多肽的病 毒表面蛋白和包含第二衔接多肽的异源蛋白。相反，由共价连接至异源蛋白的 病毒表面蛋白组成的嵌合表面蛋白的特点将可能与病毒表面蛋白或所述异源 蛋白各自本身的特点显著不同。
所述轮状病毒表面蛋白和许多呼肠孤病毒表面蛋白形成三聚体。因此，在 本发明的一个方面，所选的衔接子***优选地形成三聚体复合物。特别优选的 是衔接子***，其中，第一衔接多肽和第二衔接多肽包含七肽重复序列，并且 形成允许六螺旋束状物的形成的α螺旋结构。最优选地，三个拷贝的第二衔接 多肽形成内部卷曲螺旋三聚体，而三个拷贝的第一衔接多肽包装进入该三聚体 表面的槽，以使所述六螺旋束状物完整。然而，相反状况(inverse)也是有可能 的，该情况中，三个拷贝的第一衔接多肽形成内部卷曲螺旋三聚体，而三个拷 贝的第二衔接多肽包装成该三聚体的表面上的槽。包含七肽重复序列并形成六 螺旋束状物的多种多肽对是本领域中已知的。这些通常源自病毒融合蛋白。因 为轴对称及其六螺旋束状物的稳定性，病毒融合蛋白是衔接多肽序列的优选来 源。
最彻底研究的病毒融合蛋白之一是人免疫缺陷型病毒1(HIV-1)的包膜糖 蛋白。HIV-1包膜糖蛋白的胞外域由gp120和gp41组成。gp41介导病毒和细胞膜 的融合。gp41包含两种七肽重复序列，“螺旋区1”(HR1)和“螺旋区2”(HR2)，其 能够在天然蛋白质中形成六螺旋束状物[14]。在一个优选实施方式中，衔接子 ***的第一衔接多肽和第二衔接多肽分别对应于gp41HR2(SEQ ID NO:1)和 gp41HR1(SEQ ID NO:2)。在另一个优选实施方式中，衔接子***的第一衔接 多肽和第二衔接多肽分别对应于尼帕病毒F蛋白HR2(SEQ ID NO:3)和HR1 (SEQ ID NO:4)。然而，已知多种其它病毒融合蛋白可作为能够用于制备第一和 第二衔接多肽的相互作用的HR1和HR2多肽的来源。这些包括流感血凝素 2(HA2)、莫洛尼氏白血病毒病毒(Mo-MLV)的跨膜(TM)亚基、副粘病毒F蛋白(包 括禽类副粘病毒F蛋白、例如亨德拉病毒F蛋白)、例如、来自呼吸道合胞病毒 (RSV)和新城病病毒(NDV)、科罗拉病毒的纤突蛋白(例如小鼠肝炎病毒和 SARS-CoV的纤突蛋白)、EB病毒的ZEBRA蛋白、猿病毒5融合蛋白等。(参见参 考文献14、15、16和17)。
其中，所述异源蛋白本身包含七肽重复序列，并且这些序列与经修饰的轮 状病毒表面蛋白中所含的七肽重复序列相容，向所述异源蛋白添加七肽重复序 列可能并非必需。在该情况中，所述异源蛋白的天然七肽重复序列可与经修饰 的轮状病毒表面蛋白的七肽重复序列形成六螺旋束状物，并且，所述异源蛋白 可不必通过添加与所述异源蛋白相异的七肽重复序列来被修饰。
例如，上文所列的任何病毒融合蛋白包含相互作用的七肽重复序列，并且 这些天然七肽重复序列能够与经修饰以包含七肽重复序列的轮状病毒表面蛋 白的七肽重复序列相互作用。在一些实施方式中，优选依赖于与所述病毒融合 蛋白异源性的七肽重复序列，具体是，选择两部分型衔接子***以允许模块化 方法，其中，采用相同的经修饰的轮状病毒表面蛋白来展示各种不同的异源蛋 白。
包含形成六螺旋束状物的七肽重复序列的其它蛋白质结构域是已知的。这 些包括人Apaf-1和RAIDD的CARD结构域，FADD的致死效应物结构域和p75和 Fas的致死结构域。形成六螺旋束状物的肽序列的其他来源包括SNARE和 GCN4-pII。任何这些结构域或肽序列可同样地适用于本发明。例如，CARD结 构域的三个N末端螺旋和三个C末端螺旋可分别用于第一衔接多肽和第二衔接 多肽，以形成适合于单体二聚体表面蛋白的衔接子***。
也可使用其它基于肽的衔接子***。例如，与意图在病毒表面上展示的异 源蛋白结合的抗体或其抗原结合部分(例如，Fab片段、scFv、结构域抗体(DAb)) 可被***所述轮状病毒表面蛋白。所述抗体或其抗原结合部分能够识别特异性 表位，所述特异性表位可被***所述异源蛋白(例如，以肽标签形式)或可天然 存在于所述异源蛋白中。
在一些实施方式中，合适的两部分型衔接子***仅需要修饰所述异源蛋 白。例如，在本发明的一个实施方式中，所述轮状病毒表面蛋白是糖蛋白。在 该情况中，异源蛋白可经修饰以包含特异性结合糖蛋白中的聚糖的凝集素结构 域。例如，所述轮状病毒VP7蛋白可通过如下方式被修饰：将在所述蛋白质的 表面暴露部分导入单一糖基化位点，从而经修饰的异源蛋白的凝集素结构域能 够特异性结合至经修饰的VP7蛋白中的聚糖。
或者，所述异源蛋白可经修饰以包含抗体的抗原-结合结构域，该抗体对于 轮状病毒表面抗原上的表位具有特异性。例如，所述异源蛋白可融合至抗体的 Fab片段，所述抗体以高亲和性结合所述轮状病毒表面抗原。
接头序列
接头序列分隔来自不同蛋白质的结构域，并允许这些结构域正确折叠。许 多接头序列是本领域中已知的(参见参考文献18)。可纳入接头序列以分隔所述 轮状病毒表面蛋白和/或所述异源蛋白与衔接子序列。或者，其中，所述轮状病 毒表面蛋白和所述异源蛋白形成相同蛋白质的两个部分，这两个部分可通过接 头序列彼此分隔。
刚性和柔性接头均是已知的。柔性接头的典型序列由氨基酸G和S的重复组 成。例如，该接头可具有如下序列：GS,GSG,SGG,GGSGG(SEQ ID NO:5)或 GSGSGSGT(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，相同序列重复多次(例如二、 三、四、五或六次)以产生较长接头。在其它实施方式中，可采用单一氨基酸例 如S或G作为接头。刚性接头可由氨基酸序列EAAAR(SEQ ID NO:7)的数个重复 组成。
选择接头序列时，应注意选择亲水性接头以避免经修饰的轮状病毒表面蛋 白或异源蛋白的聚集。
通常，接头是蛋白酶-非敏感性的，但在一些实施方式中，接头包含蛋白酶 切割位点。蛋白酶切割位点可有利于移除经纳入以供于例如本发明的经修饰的 轮状病毒表面蛋白的检测/纯化的标签。蛋白酶切割位点还有利于暴露在经修 饰的轮状病毒表面蛋白中***的氨基酸序列，从而，在用位点特异性蛋白酶切 割之后，所述氨基酸序列将变得在经修饰的轮状病毒表面蛋白的外表面上更为 可及。例如，可采用蛋白酶切割位点来暴露衔接多肽，以改善其与两部分型衔 接子***的对应的衔接多肽的结合，其中，所述两部分型衔接子***已经融合 至待在轮状病毒颗粒的表面上展示的异源蛋白。在一些情况中，应用蛋白酶切 割以暴露形成经修饰的轮状病毒表面蛋白的部分的衔接多肽可消除对额外接 头序列的需要，并因此减少了需要***经修饰的轮状病毒表面蛋白以与异源蛋 白形成稳定的复合物的额外氨基酸序列的数量。
供于特定蛋白酶的蛋白酶切割位点可在多种蛋白质中发现。例如，血液凝 结级联反应和互补级联反应包含了多种极具特异性的蛋白酶，其识别级联反应 中更下游的蛋白质中的切割位点。通常而言，处于级联反应早期阶段的酶比晚 期阶段的酶更具特异性。例如，X因子比凝血酶更具特异性。如果采用凝血酶， 最优选的凝血酶敏感性切割位点是在纤维蛋白原、XIII因子和凝血素中发现的 那些。血液凝结级联反应的蛋白酶的其它示例，其靶蛋白和特异性切割位点示 于下表1。表1所示的序列的下划线部分是需要被纳入以供蛋白酶识别靶标的最 小切割位点。
表1
Figure BDA0000937042360000141
已经用于切割融合蛋白的其它蛋白酶包括：肠激酶、胶原酶、凝乳酶、尿 激酶、肾素、鼻病毒3C蛋白酶、烟草艾柯病毒(TEV)蛋白酶、因子Xa、凝血酶、 弗林蛋白酶和某些信号肽酶(参见例如，参考文献19)。
优选地，所述切割位点以如下方式位于最终的构建体中：已被添加至所述 轮状病毒表面蛋白或所述异源蛋白的任何标签均能够被容易地移除。
在一些实施方式中，所述接头包含标签供于检测和/或纯化。用于协助蛋白 质检测的多种标签是本领域中已知的。常用的肽标签包括FLAG标签 (DYKDDDDK；SEQ ID NO:12)，HA标签(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:13)，His 标签(例如HHHHHH；SEQ ID NO:14)，Myc标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:15)， Strep标签I(AWRHPQFGG；SEQ ID NO:16)，Strep标签II(NWSHPQFEK；SEQ ID NO:17)，和蛋白质C标签(EDQVDPRLIDGK；SEQ ID NO:18)。His标签是优选的，因为它们允许通过抗His抗体进行容易的检测，并允许采用镍-柱纯化带 标签的蛋白质。Strep标签II允许采用链霉亲和素柱来简单且容易地纯化重组表 达的蛋白质。在一些情况中，可采用蛋白质标签。例如，可纳入谷胱甘肽-S- 转移酶标签以允许采用包含固定化的谷胱甘肽的柱来简易地纯化本发明蛋白 质。如果需要通过荧光显微镜来进行简易检测，则可采用绿色荧光蛋白标签。
在本发明的一些实施方式中，纳入标签(例如蛋白质C标签)作为接头序列的 部分，因为通常用于例如蛋白质检测和纯化的标签不干扰带标签的蛋白质的功 能和折叠，并且通常暴露在表面。因此，标签可提供优于其它人工设计的接头 序列的有利性质。
在其它实施方式中，接头序列可包含表位序列。包含表位序列可有利于包 装识别所述表位的抗体片段，以进一步使通过经修饰的轮状病毒表面蛋白和异 源蛋白经由两部分型衔接子***形成的复合物稳定化。使该复合物稳定化可能 对获得用于结构研究的高分辨率图像特别重要。
信号肽
在本发明的一些实施方式中，所述轮状病毒表面蛋白和所述异源蛋白被进 一步修饰以包含异源性信号肽序列，优选地，替代天然信号肽序列。异源性信 号肽的应用可有利于在用于制备大量的经修饰的轮状病毒表面蛋白和所述异 源蛋白用于再包被轮状病毒DLP的表达***中达到更高的表达水平。因此，所 述异源性信号肽将源自已知在所选表达***中以高水平表达的蛋白质。例如， 人组织纤溶酶原激活物(tPA)的HIV共有信号序列或信号肽特别合适于在人细 胞中表达。对于昆虫细胞中的表达，可采用杆状病毒gp64信号肽或蜜蜂蜂毒肽 信号序列。通常，将接头置于异源性信号肽序列之后以确保高效的信号肽切割。 一般而言，所述信号肽被对于所选表达***属内源性的信号肽酶移除，从而其 不存在于最终的蛋白质(即，从所述表达***回收的轮状病毒表面蛋白和所述异 源蛋白)中。
核酸
本发明还涉及包含如下开放阅读框的核酸，所述开放阅读框编码操作性地 连接至启动子序列的本发明的嵌合表面蛋白，从而，所述嵌合表面蛋白在表达 ***中大量表达。
本发明还涉及一种核酸构建体，其编码经修饰的轮状病毒表面蛋白，该经 修饰的轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白的全部或部分、第一衔接多肽 和任选的接头序列。本发明还涉及包含如下开放阅读框的核酸，所述开放阅读 框编码含有异源蛋白、第二衔接多肽和任选的接头序列的融合蛋白，其中，所 述开放阅读框操作性地连接至启动子序列，从而所述融合蛋白在表达***中大 量表达。在一个实施方式中，本发明涉及一种核酸构建体，其包含编码第二衔 接多肽，任选的接头序列和多克隆位点的核苷酸序列，其中，在所述多克隆位 点***异源蛋白的编码区能够产生编码包含所述异源蛋白和第二衔接多肽的 融合蛋白的开放阅读框。所述核酸构建体还包含能够驱动所述融合蛋白在表达 ***中表达的启动子序列，所述融合蛋白包含所述异源蛋白和第二衔接多肽。
第一衔接多肽和第二衔接多肽形成两部分型衔接子***的部分，从而，所 述融合蛋白包含所述异源蛋白和第二衔接多肽，并且该经修饰的轮状病毒表面 蛋白包含第一衔接多肽，彼此形成稳定的复合物。
表达***
本发明还涉及用于表达由本发明核酸编码的蛋白质的表达***。
在一个实施方式中，采用第一表达***来表达经修饰的轮状病毒表面蛋 白，所述经修饰的轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白的全部或部分、第 一衔接多肽和任选的接头序列。采用第二表达***来表达融合蛋白，所述融合 蛋白包含异源蛋白、第二衔接多肽，和任选的接头序列。任选地，采用第三表 达***来表达一种或多种轮状病毒蛋白质，所述一种或多种轮状病毒蛋白质与 所述轮状病毒表面蛋白一同形成轮状病毒颗粒的外层。第一和第二衔接多肽彼 此相互作用以形成稳定的复合物。第一表达***包含第一核酸构建体，所述第 一核酸构建体包含编码所述经修饰的轮状病毒表面蛋白的开放阅读框，其中， 所述开放阅读框操作性地连接至启动子序列。第二表达***包含第二核酸构建 体，所述第二核酸构建体包含编码融合蛋白的开放阅读框，其中，所述开放阅 读框操作性地连接至启动子序列。所述第三表达***包含用于一种或多种轮状 病毒蛋白质的一种或多种表达载体。随后纯化所述经修饰的轮状病毒表面蛋白 和所述融合蛋白以及任选的一种或多种轮状病毒蛋白质。所述经修饰的轮状病 毒表面蛋白和所述融合蛋白可以合适的比例混合以形成嵌合表面蛋白。然后， 所述嵌合表面蛋白和任选的一种或多种轮状病毒蛋白质用于再包被轮状病毒 DLP，以形成在其表面上展示所述异源蛋白的轮状病毒颗粒。或者，轮状病毒 DLP用经修饰的轮状病毒表面蛋白和任选的一种或多种轮状病毒蛋白质再包被 以形成轮状病毒颗粒。然后，可将所述轮状病毒颗粒与所述融合蛋白混合以允 许形成第一衔接多肽和第二衔接多肽之间的复合物，产生嵌合表面蛋白，从而 所述异源蛋白在轮状病毒颗粒的表面上展示。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种表达***，其包含(i)第一核酸构建 体，其包含编码经修饰的轮状病毒表面蛋白的开放阅读框，所述经修饰的轮状 病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白的全部或部分、第一衔接多肽和任选的接 头序列，其中，所述开放阅读框操作性地连接至启动子序列，和(ii)第二核酸 构建体，其包含编码融合蛋白的开放阅读框，其中，所述融合蛋白包含异源蛋 白、第二衔接多肽，和任选的接头序列，其中，所述开放阅读框操作性地连接 至启动子序列。在一些情况中，所述表达***还包含用于一种或多种轮状病毒 蛋白质的表达载体，所述一种或多种轮状病毒蛋白质与所述轮状病毒表面蛋白 形成轮状病毒颗粒的外层。
所述表达***可以是细菌细胞、酵母细胞、原生动物细胞、昆虫细胞或哺 乳动物细胞。细菌细胞或酵母细胞作为表达***的应用是较不优选的，尤其是 所述表达的蛋白质需要正确糖基化的应用。
试剂盒
本发明还提供试剂盒，所述试剂盒包含第一核酸构建体和第二核酸构建 体，所述第一核酸构建体编码经修饰的轮状病毒表面蛋白，所述经修饰的轮状 病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白的全部或部分和第一衔接多肽，所述第二 核酸构建体包含编码第二衔接多肽和多克隆位点的核苷酸序列，并且其中，在 所述多克隆位点中***异源蛋白的编码区产生编码包含所述异源蛋白和第二 衔接多肽的融合蛋白的开放阅读框，其中，所述嵌合融合蛋白的第一衔接多肽 和所述融合蛋白的第二衔接多肽彼此相互作用以形成稳定的复合物。
本发明还涉及这样的试剂盒，所述试剂盒包含第一核酸构建体和第二核酸 构建体，所述第一核酸构建体编码经修饰的轮状病毒表面蛋白，所述经修饰的 轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白的全部或部分和第一衔接多肽，所述 第二核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含异源蛋白的全部或部分和第 二衔接多肽，其中，经修饰的轮状病毒表面蛋白的第一衔接多肽和融合蛋白的 第二衔接多肽彼此相互作用以形成稳定的复合物，由此产生嵌合表面蛋白。
试剂盒还可包含轮状病毒颗粒。所述轮状病毒颗粒可来自与所述轮状病毒 表面蛋白来源相同的物种，或来源不同的物种。例如，恒河猴轮状病毒VP7可 用于再包被由牛轮状病毒制备的DLP，反之亦然。所述轮状病毒可被脱壳，并 用嵌合表面蛋白再包被。或者，试剂盒可包含供于用嵌合表面蛋白再包被的 DLP。轮状病毒DLP可通过使天然轮状病毒颗粒脱壳或通过重组表达轮状病毒 内壳蛋白质VP2和VP6来制备。
外层蛋白的重组表达
轮状病毒DLP的脱壳仅需要一种或两种重组病毒蛋白质，外层蛋白VP7或 外层蛋白VP7，以及外层纤突蛋白VP4。VP4和VP7的表达和纯化分别详细描述 于参考文献20和21。
包含本发明的嵌合表面蛋白的外层蛋白可采用本领域技术人员已知的常 规表达***产生。为了确保正确折叠，以及在一些情况中的正确糖基化，除原 核或酵母表达***以外的表达***是优选的。例如，哺乳动物细胞例如CHO细 胞或293细胞可用于使轮状病毒DLP的再包被所需的外层蛋白过表达。或者，可 采用原生动物蜥蜴利什曼原虫(Leishmaniatarentolae)来表达外层蛋白。昆虫细 胞***也适合于外层蛋白的表达。例如，昆虫细胞系Sf9、Sf21和Hi-5适合于糖 基化的蛋白质的过表达。在一些情况中，基于杆状病毒的昆虫细胞***是优选 的。描述于参考文献2、4和5的表达***特别合适于实践本发明。
回收和纯化过表达的外层蛋白的不同方式是本领域中已知的。通常，采用 一系列的色谱步骤来从胞质提取物或用作表达***的细胞的上清液纯化过表 达的蛋白质。例如，可采用凝集素亲和色谱，免疫亲和色谱和尺寸排阻色谱。 如果外壳蛋白质是带有肽-或蛋白质标签的，则该标签可有利地用于纯化。如果 标签之前的序列中存在蛋白酶切割位点，则可在纯化之后通过特异性识别该蛋 白酶切割位点的蛋白酶来移除标签。
在一些情况中，重组表达的外层蛋白的粗制物可用于再包被反应。例如， 用于表达外层蛋白的细胞裂解物可采用裂解缓冲剂和/或对细胞进行机械搅拌 (例如，刮擦或超声处理细胞)来制备。通过离心移除任何细胞碎片，并且包含 所述重组外层蛋白的粗制物的上清液可用于再包被反应。所述粗制物可采用超 滤浓缩，随后用于再包被反应。
在其中异源蛋白通过包含第一衔接多肽和第二衔接多肽的两部分型衔接 子***非共价地结合至轮状病毒表面蛋白的本发明的那些方面中，在不同的细 胞中分开表达融合至第一衔接多肽的轮状病毒表面蛋白和融合至第二衔接多 肽的异源蛋白。分开表达可以是优选的，因为这两种蛋白质均可采用供于各蛋 白质的已知纯化方案来分开纯化。纯化后，蛋白质可以轮状病毒DLP的再包被 所需的合适的比例混合。例如，轮状病毒外层中的VP7和VP4的摩尔比是13:1。 包含第一衔接多肽的经修饰的VP7蛋白和包含第二衔接多肽的异源蛋白的摩尔 比通常是1:1。或者，DLP用轮状病毒外层蛋白再包被以形成轮状病毒颗粒。然 后，将所述轮状病毒颗粒与所述异源蛋白混合以允许在第一衔接多肽和第二衔 接多肽之间形成复合物，从而所述异源蛋白在轮状病毒颗粒的表面上展示。
或者，可在相同细胞中表达所述轮状病毒表面蛋白和所述异源蛋白。共表 达导致由两部分型衔接子***(具体参见上文)介导形成所述轮状病毒表面蛋白 和所述异源蛋白的稳定复合物。其中，将衔接子序列连接至所述轮状病毒表面 蛋白或连接至所述异源蛋白的接头序列包含标签，该标签可用于从所述表达系 统的细胞/细胞上清液纯化该复合物。
为了能够用包含全部或部分异源蛋白的嵌合表面蛋白再包被呼肠孤病毒 核颗粒，并非需要提供所有蛋白质来形成外层。例如，哺乳动物呼肠孤病毒的 外层由μ1、σ1和σ3形成。为了再包被呼肠孤病毒核颗粒以用于本发明目的，通 常提供重组形式的μ1就足以形成病毒颗粒。任选地，也可提供重组形式的σ1和 σ3。所述重组蛋白质可采用上述表达***之一制备，然后可采用已知方案纯化。
病毒颗粒的繁衍
已在大量动物物种包括牛、猪、马、兔、小鼠、狗、猫、鸟和外来动物物 种例如曲角羚羊、赛加羚羊、白尾角马、灰熊和红袋鼠中发现轮状病毒。因此， 某些细胞类型用于其繁衍的合适性取决于所选病毒的宿主范围。优选地，选择 允许在建立的细胞培养***中高产量繁衍的病毒。
例如，细胞系MA104可用于繁衍恒河猴轮状病毒。轮状病毒可通过裂解感 染的细胞，例如通过在培养基中冻融感染的MA104细胞来回收。通过低速离心 从裂解物清除细胞碎片，然后通过采用超离心或超滤使病毒颗粒成团来回收它 们。所述病毒颗粒的浓缩悬浮液可采用CsCl梯度离心进一步纯化[2]。用于制备 CsCl梯度的合适的缓冲剂是TNC(20mMTris pH 8.0，100mM NaCl，1mM CaCl2)。
优选地，采用成熟表征的细胞进行轮状病毒繁衍。人、牛和恒河猴轮状病 毒可在Vero细胞中繁衍。合适的Vero细胞系(CCL81)可获自美国典型培养物保 藏中心(ATCC)。
类似地，呼肠病毒科家族的成员已从广泛的哺乳动物、鸟、爬行动物、鱼、 甲壳类、昆虫、蜱、蛛形纲、植物和真菌分离。对于呼肠病毒科家族的其它病 毒也已建立了培养***。例如，水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)可以足够的量从感染 的水稻叶中制备[7]。C6/36细胞可用于繁衍班那病毒(BAV)[22]。小鼠L-细胞， 具体是细胞系L929，和鼠红白血病(MEL)细胞可用于繁衍哺乳动物呼肠孤病毒 毒株类型1Lang(T1L)和类型3Dearing(T3D)[5]。草鱼水产呼肠孤病毒(GCRV) 可在白鲩(Ctenopharyngodon idellus)肾(CIK)细胞培养物中繁衍[8]。
病毒颗粒通常可从细胞上清液或裂解的细胞回收。例如，任何细胞碎片可 通过低速离心移除，并采用超离心从上清液形成病毒颗粒团块。所述团块包含 必要时可被进一步纯化的病毒颗粒。
DLP制备
轮状病毒DLP通过从纯化的轮状病毒颗粒移除外层蛋白来制备。轮状病毒 颗粒可通过使病毒颗粒在钙螯合剂例如EDTA或EGTA的存在下孵育来脱壳。用 于使轮状病毒颗粒脱壳的合适的缓冲剂包含20mM Tris，pH8，100mM NaCl 和1mM EDTA[2]。轮状病毒颗粒也可通过热激脱壳。所得的DLP可通过在两 个依次进行的CsCl梯度(ρ＝1.25至1.50g/cm3)上呈带(banding)来纯化。
所选用于移除外层蛋白的方法取决于所选的病毒颗粒。例如，哺乳动物呼 肠孤病毒颗粒可通过如下方式被剥离至核：将该颗粒与α-糜蛋白酶(CHT)在 37℃孵育两小时[4]。
上述方法可适用于呼肠病毒科家族中的其它病毒，这取决于其外层蛋白对 蛋白酶处理或低钙条件的敏感性。
在一些情况中，亚病毒颗粒可通过裂解用于繁衍所述病毒的细胞来回收。 然后，可从细胞裂解物回收所述亚病毒颗粒，例如，通过关于班纳病毒描述的 CsCl梯度[22]。
或者，DLP或亚病毒颗粒可通过在上述表达***之一中重组表达相关的病 毒蛋白质来制备。例如，轮状病毒内壳蛋白质VP2和VP6可被重组表达以形成 类似DLP的病毒样颗粒。
再包被
轮状病毒DLP的再包被在包括pH 4.5和6.5的pH范围内发生，但在pH 5和 5.5之间最为高效(优选pH 5.2)。再包被于包括4℃和37℃的温度下发生，但在 4℃和30℃之间比37℃时更高效。
呼肠孤病毒核颗粒的再包被通常在模拟细胞中发生的所述病毒颗粒的组 装的条件下进行。例如，哺乳动物正呼肠孤病毒核颗粒可在37℃被再包被。然 而，个别参数例如pH和温度可能需要进一步优化以供从纯化的病毒核和重组表 达的外层蛋白高效再组装病毒颗粒。
再包被的病毒颗粒可通过CsCl梯度离心回收。CsCl梯度纯化可重复第二次 以提高回收的病毒颗粒的纯度。
衔接子***用于在再包被的轮状病毒颗粒的表面上展示异源蛋白时，所述 轮状病毒DLP可用包含第一衔接多肽的轮状病毒表面蛋白再包被。包含与第一 衔接多肽形成稳定复合物的第二衔接多肽的异源蛋白可随后被添加至再包被 的病毒颗粒。这对于其中用由所述异源蛋白和所述轮状病毒表面蛋白形成的复 合物再包被的效率较低(例如归因于所述异源蛋白的尺寸)的情况可能是有利 的。或者，可首先形成所述异源蛋白和所述轮状病毒表面蛋白通过衔接多肽的 复合物，然后可将该复合物添加至轮状病毒DLP用于再包被。
复合物形成
在本发明的一些方面中，采用嵌合表面蛋白来研究在形成所述嵌合表面蛋 白的部分(例如通过两部分型衔接子***非共价结合至轮状病毒表面蛋白)的异 源蛋白和特异性结合至所述异源蛋白的分子之间形成的复合物的结构。
在本发明的一个方面，所述分子是蛋白质分子。所述蛋白质分子通常是另 一种蛋白质，例如与所述异源蛋白或识别所述异源蛋白的表面上存在的表位的 抗体或抗体片段相互作用的受体或配体。
例如，可采用与轮状病毒颗粒的表面上展示的三聚体病毒型细胞侵入蛋白 (例如，HIV gp140或RSV F蛋白)所结合的三聚体轮状病毒表面蛋白的六聚体复 合物来研究所述病毒型细胞侵入蛋白及其宿主细胞表面受体之间的相互作用。
用于在所述异源蛋白和蛋白质分子之间的复合物形成的优选条件取决于 相互作用的性质。受体-配体相互作用可能需要来自抗体-抗原相互作用的不同 条件。通常，复合物的形成在室温于缓冲的溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)中进 行。
在一个实施方式中，蛋白质分子被添加至展示所述嵌合表面蛋白的再包被 的轮状病毒颗粒的悬液。所述缓冲溶液还可包含组分例如Ca2+以防止轮状病毒 颗粒脱壳和任选的一种或多种蛋白酶抑制剂阻滞所述蛋白质降解。在所述蛋白 质分子于再包被的轮状病毒颗粒的存在下孵育之后，结合至轮状病毒颗粒的蛋 白质分子的新形成的复合物可通过离心或超滤从任何未结合蛋白质分子分离。 然而，如果所述再包被的轮状病毒颗粒用于冷冻EM分析，则未结合蛋白质分 子的移除可能不是必需的。
或者，所述蛋白质分子和所述嵌合表面蛋白一起孵育以允许发生复合物形 成。首先，可使所述异源蛋白和轮状病毒表面抗原一同孵育以形成嵌合表面蛋 白。一旦形成嵌合表面蛋白，添加蛋白质分子。然后，可将蛋白质分子和嵌合 表面蛋白的复合物添加至轮状病毒DLP以形成轮状病毒颗粒，任选地，在与所 述轮状病毒表面蛋白一同形成天然轮状病毒颗粒的外层的任何其它轮状病毒 蛋白质存在下。
在本发明的一个具体方面，本发明的嵌合表面蛋白用于确定抗原-抗体复合 物的结构。在本发明的该方面，所述异源蛋白可源自病原体例如病毒或细菌。 例如，可选择免疫显性的抗原作为所述异源蛋白来研究在针对抗原的免疫应答 过程中，该蛋白质的哪部分被抗体靶向。优选地，所述异源蛋白是三聚体病毒 表面蛋白例如流感病毒血凝素，呼吸道合胞病毒F或HIV gp140。为了确定抗原 -抗体复合物的结构，采用Fab片段来代替全长抗体通常是优选的，以避免邻接 嵌合表面蛋白之间的位阻现象，并确保所述异源蛋白上的表位的最大化占据。
在本发明的另一个方面中，可研究异源蛋白和非蛋白质分子之间的复合物 形成。非蛋白质分子可以是核酸(例如，RNA或DNA)、多糖或寡糖(例如，聚糖)。 例如，所述异源蛋白可以是转录因子或与特定DNA序列形成复合物的其它 DNA-结合蛋白质。或者，所述异源蛋白可以是与聚糖形成复合物的凝集素。
冷冻EM
采用冷冻EM用于结构确定具有优于传统方法例如X射线晶体学的数种优 势。具体而言，冷冻EM对于待分析的样品的纯度、同质性和质量的要求严苛 性较低。重要的是，冷冻EM可被施加至不形成合适晶体的目标，以供结构确 定。
纯化的或未纯化的再包被的轮状病毒颗粒的悬液，单独或与蛋白质分子例 如抗体或非蛋白质分子例如核酸复合的形式，均可施加至碳网格以供冷冻EM 成像。经被覆的碳网格被速冻(通常在液态乙烷中)，以将颗粒保存在冷冻含水 状态的悬液中。较大颗粒可通过冷冻固定来玻璃化。玻璃化的样品可在冷冻超 薄切片机中被切成薄片(通常40至200nm厚)，然后可将切片置于电子显微镜栅 格上用于成像。
获自图像的数据的质量可通过采用平行照明和更好的显微比对来改善，以 获得高达约
Figure BDA0000937042360000221
的分辨率。在该高分辨率下，能够从头开始建立完整原子结构 模型。然而，在所选或紧密相关的轮状病毒颗粒的原子分辨率的结构数据和所 选的异源蛋白或紧密同源物可用于有限的比较型建模时，较低分辨率成像可能 已足够(参见下文)。
为了进一步改善数据质量，可将显微镜小心地比对，以揭示在成像所用相 同的条件下记录的碳膜图像的傅里叶变换中超过
Figure BDA0000937042360000231
的可见的反差转换函数 (CTF)环。然后可采用软件例如CTFFIND来确定各显微镜的散焦值[23]。密度 图的最终的像素大小可采用，例如，烟草花叶病病毒(TMV)校准。
使用冷冻EM以研究轮状病毒颗粒的结构的有用的描述可见于参考文献24 和25。
图像分析和结构确定
获自冷冻EM的图像经分析以鉴定单一颗粒的显微照片。单一颗粒选择可 辅助以软件工具例如SIGNATURE[26]来完成。可采用计算机程序CTFTILT[23] 来测定各显微照片的散光失焦、样本倾斜轴和倾斜角。根据各颗粒在原图像中 的等同物获得其分离的散焦值提高了通过将轮状病毒颗粒的单一颗粒显微照 片平均化获得的冷冻EM密度图中的数据质量。
冷冻EM密度图中的已知原子模型的拟合是用于对复合物结构例如病毒颗 粒建模的常用方法。可用多种计算拟合工具，其范围包括蛋白质结构的简单刚 体定位，例如Situs[27]，Foldhunter[28]和Mod-EM[29]，到复杂且动态的柔性 拟合算法，如NMFF[30]，Flex-EM[31]，MDFF[32]和DireX[33，34]，其将已 知结构变为密度图。
当原子模型未知时，冷冻EM密度图可用于从来自计算机构建的一系列可 能的模型构建和/或评价结构模型(参见参考文献29，35，36，37和38)。相关的 模板结构必须是已知的，供于条件约束的对比建模，或，用于条件约束的从头 开始建模，待建模的折叠必须是相对较小的。例如，初始结构可采用IMIRS[39] 获得。进一步比对和重建可采用FREALIGN[40]使用已知轮状病毒结构和所述 异源蛋白或类似同源物的结构作为模板来进行。
有意义的结构和功能信息可直接获自密度图本身。例如，在
Figure BDA0000937042360000233
分辨率 下，一些二级结构元件在冷冻EM密度图中是可见的：α螺旋显示为圆柱形，而 β片层显示为薄、曲线板状。利用特征识别工具来描述蛋白质结构或推断个体 蛋白质的功能，这些二级结构元件可被可靠地鉴定并定量。在接近原子的分辨 率
Figure BDA0000937042360000232
处，α螺旋的螺距、β链的分离，以及其联接密度，可明确地被观察到 (参见例如，参考文献41、42、43和44)。
冷冻EM中的更始模型构建包括特征识别、序列分析、二级结构元件相关 性、Cα替换和模型优化。可采用多种软件应用，例如，EMAN用于密度图区段 化和操作[45]，SSEHunter[46]用于检测二级结构元件，在UCSF相机中观察[47] 和在Coot中原子操控[48，49]。
二级结构鉴定程序如SSEHunter提供半自动化的操作以检测和显示密度图 中肉眼可观察的二级结构元件[46]。序列和结构中二级结构元件的记录，联合 几何与生物物理信息，可用于将蛋白质骨架锚着在密度图中[41，43]。该序列 -结构相关性将密度图中观察到的二级结构元件与序列中预测的那些关联起来。 建模工具试剂盒GORGON将基于序列的二级结构预测与特征检测和几何建模 技术耦合起来，以产生初始蛋白质骨架模型[50]。自动化建模方法例如 EM-IMO(电子显微镜-重复模块优化)可采用冷冻EM图作为约束条件来建立、调 节和细化蛋白质模型的局部结构[51]。
一旦已通过二级结构元件确定了相关性，可向密度分配Cα原子，始于α螺 旋随后是β链和环。例如，通过利用Cα原子的清晰凸起，可采用晶体学程序O[52] 和/或Coot[48]中的Baton_build功能来建立Cα模型。Cα位置可交互式地调节，从 而使其最优化地拟合密度，同时保持合理的几何学并消除模型中的冲突。粗糙 的完全原子模型可采用CNS[53]以伪结晶方式细化。模型可采用计算建模软件 例如Rosetta[36]进一步优化。完全原子模型也可在其它计算工具例如REMO[54] 的协助下建立。模型的质量可通过肉眼比较该模型与密度图来确认。伪结晶R 因子/无R分析[55]提供对观察到的和计算得到的结构因子幅值之间的协同度的 检测，并且可用于确认所得的原子模型提供对冷冻EM密度图的良好拟合。蛋 白质模型几何学可通过PROCHECK[56]来验证。
用于免疫原设计的筛选方法
采用冷冻EM替代X射线结晶学促进了快速结构测定。相对于X射线结晶 学，冷冻EM对待分析的样品的纯度、同质性和质量的要求较不严苛。这些特 点使冷冻EM在疫苗(尤其是针对经历抗原漂移的病原体的疫苗)的免疫原设计 中更具吸引力。
获得更多的结构信息(尤其是关于与相同病原体或紧密相关的病原体的变 体共有的表位的结构信息)可允许免疫原的合理设计，其可用于提供抵抗相同 病原体或紧密相关的病原体的大量变体的广泛保护性的疫苗中。据信，此类所 谓“通用”疫苗比传统疫苗更具成本效益，因为它们使得在相同疫苗组合物中(例 如，在现有的脊髓灰质炎疫苗以及链球菌和脑膜炎球菌结合疫苗的情况中)包括 相同病原体或紧密相关的病原体，或考虑到前一季在病原体群体中发生的抗原 漂移(如在流感疫苗的情况中)而每年提供新疫苗组合物的做法变得多余。
关于针对不同病原体的疫苗接种的免疫原的合理设计涉及：鉴定相同病原 体的不同变体/亚型之间或紧密相关的病原体之间保守的免疫显性的蛋白质的 那些区域。轮状病毒颗粒用于在嵌合轮状病毒表面蛋白上展示异源蛋白的应用 使其能够在相对短的时间内快速测定大量结构。因此，本发明的方法可尤其有 利于鉴定免疫原性蛋白质的保守表位。
通过确定与抗体或对应的抗原-结合片段复合的免疫原的结构，其中，所述 抗体或对应的抗原-结合片段已被发现针对相同病原体的多种变体/亚型和/或针 对紧密相关的病原体而被引发，可鉴定该病原体和/或紧密相关的病原体的免疫 显性的免疫原中的保守区域。在一个实施方式中，本发明因此涉及一种用于获 得与抗体复合的免疫原的三维模型的方法，其中，所述方法包括如下步骤(i)用 包含所述免疫原的嵌合表面蛋白再包被轮状病毒DLP，以产生展示所述嵌合表 面蛋白的轮状病毒颗粒的悬液，(ii)向所述悬液添加特异性结合至免疫原的抗 体或抗体片段，其中，所述抗体或片段与所述嵌合表面蛋白形成复合物，(iii) 冷冻所述悬液，(iv)采用冷冻EM对所述轮状病毒颗粒成像以获得多张显微照片， 和(vi)分析所述多张显微照片以获得与所述抗体复合的免疫原的三维模型。所述免疫原通常对于所述轮状病毒颗粒是异源性的。与所述抗体复合的免疫原的三 维模型可用于确定被所述抗体识别的免疫原在表面上的表位。
该方法可用于鉴定被抗体结合的表位，所述抗体针对多种相关的病原体或 因抗原漂移而出现的病原体的变体具有广泛的中和活性。或者，该方法可用于 鉴定被抗体结合的表位，所述抗体能够识别干扰(例如)病毒型细胞侵入蛋白的 功能的表位，并可用于预防或抑制病毒繁衍。与蛋白质的特定三维构型结合的 抗体还可用作蛋白质制造过程中的质量控制试剂，例如，以排除包含大量变性 或错误折叠的蛋白质拷贝的蛋白质的生产批次。该方法可进一步用于鉴定当被 用作诊断试剂的抗体结合时特别有用的表位(例如，对于一组紧密相关的病原体 中的具体病原体具有特异性的表位)。
对于发现的响应相同病原体的多种变体/亚型的感染引发的和/或针对紧密 相关的病原体引发的一组抗体或其对应的抗原-结合片段，通过重复用于获得与 抗体复合的免疫原的三维模型的该方法，能够鉴定该免疫原的表面上的各抗体 表位。一旦该组中各抗体的表位已被鉴定，该信息可用于免疫原的合理设计。 例如，所述方法可用于鉴定一组抗体的表位，所述抗体已被发现针对相同病原 体的多种变体/亚型和/或针对紧密相关的病原体具有中和活性，从而设计针对 相同病原体的大量变体/亚型和/或紧密相关的病原体提供广泛中和活性的免疫 原。
或者，上述方法可用于将由响应免疫而引发的抗体识别的表位的库(repertoire)与现有的疫苗相对应。通过对应被这些抗体最常识别的表位，可 鉴定免疫显性的表位。该信息可有利地用于进一步优化现有的疫苗。例如，其 中，现有的疫苗由失活的病原体组成，该疫苗的优化形式可仅包含所述病原体 的免疫显性的部分(例如，以包含重组形式的鉴定的免疫显性的抗原或表位的亚 基疫苗形式)。对于采用这些技术获得的免疫显性的抗体表位的结构决定簇的了 解，能够被应用于制备已经工程改造以形成最有用的免疫显性的表位(例如广泛 中和表位)的抗原。
表位对应以协助免疫原设计的示例是本领域中已知的，但一般受限于免疫 原上的少量的表位，这是因为，获取免疫原-抗体复合物的结构数据的工作是通 过X射线结晶学进行的。通常，仅测试单一抗体(参见参考文献57，58和59)。本 发明首次允许采用高通量方法获得免疫原-抗体复合物的结构信息。本发明尤其 有利于与免疫原仅有弱相关性的抗体(因此体现了结晶法的主要困难)。
设计针对相同病原体的多种变体或紧密相关的病原体具有广泛保护性的 免疫原的多种方法是本领域中已知的。近年来，在设计针对流感病毒和HIV的 “通用”疫苗上展开了很多工作(参见参考文献60，61和62)。经修饰的免疫原的 合理设计已受限于缺乏结构数据以指导该进程的现状。采用轮状病毒颗粒来在 嵌合轮状病毒表面蛋白上展示异源蛋白使其能够快速测定蛋白质的氨基酸序 列的修饰如何影响其三维结构。改变蛋白质结构的氨基酸修饰可能会影响其形 成晶体的能力。因此，用于评估这些修饰的影响的结构信息可能不易获得，因 为经修饰的蛋白质可能在与未经修饰的蛋白质所处的相同条件下不结晶。因为 冷冻EM的应用不依赖于晶体的形成来确定蛋白质结构，并且，对于不同类型 的蛋白质不需要任何适应性的基础实验设置，使得对于经修饰的蛋白质的快速 结构表征成为可能。
一旦鉴定了相同病原体的大量变体/亚型和/或许多紧密相关的病原体中存 在的病原体的免疫原性蛋白质上的表位，该信息可用于设计通用疫苗。在一些 情况中，该可能需要对于免疫原的修饰，尤其是在包含共有表位的保守区域不 易触及天然蛋白质中的抗体的情况中，因为较差的表位可及性通常会转化成较 差的免疫原性。通过以该方式修饰免疫原：使其保留可被抗体识别的天然表位， 但使所述表位更为可及，该经修饰的免疫原可产生保护性地针对相同病原体的 广泛变体/亚型或紧密相关的病原体的抗体应答。除了对应亲和成熟的抗体的表 位之外，被这些抗体的未成熟祖先识别的表位，一旦由B-细胞库克隆实验衍化， 即可通过该技术被对应。该信息能够协助免疫原的设计，其选择性地扩增所需 的未成熟的祖先抗体，然后指导其亲和成熟化成为广泛且有力的中和抗体。
可采用本发明的方法测试已从天然免疫原修饰的候选免疫原(用以制备通 用疫苗或出于其它原因)的感兴趣的天然表位的存在。因此，在一个具体实施方 式中，本发明还涉及用于确定异源蛋白的两个变体之间的结构差异的方法，其 中，所述方法包括如下步骤：(i)用包含所述异源蛋白的第一变体的第一嵌合 表面蛋白再包被轮状病毒DLP，以产生展示第一嵌合表面蛋白的第一轮状病毒 颗粒的悬液，(ii)冷冻所述悬液，(iii)采用冷冻EM对第一轮状病毒颗粒成像， 以获得多张显微照片，(iv)分析所述多张显微照片以获得第一嵌合表面蛋白的 三维模型，(v)用包含所述异源蛋白的第二变体的第二嵌合表面蛋白重复步骤 (i)-(iv)，其中，除了第一变体和第二变体之间的差异之外，第一和第二嵌合表 面蛋白彼此相同，和(vi)比较第一嵌合表面蛋白的三维模型和第二嵌合表面蛋 白的三维模型，已确定所述异源蛋白的第一变体和第二变体之间的结构差异。 该方法可对相同异源蛋白的其它变体重复，以提供用于鉴定具有某些所需结构 特点的变体的筛选试验。
在一些情况中，可确定与识别表位的抗体复合的复合物中天然免疫原和多 种经修饰的免疫原的结构。将经修饰的免疫原的结构与天然免疫原做比较将有 助于选择最佳地保留天然表位用于进一步体内测试的候选免疫原。
免疫原性组合物
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒 在制备药物中的应用。具体是，包含本发明的嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒可 用于适合于人疫苗接种的免疫原性组合物中。例如，所述嵌合表面蛋白可被设 计以展示在给予患者时引发保护性免疫应答的异源蛋白。
嵌合病毒用于引发针对病原体源性的抗原的免疫应答的应用本领域熟知 的。常规上，该方法需要重新工程改造选择作为病原体源性的抗原的载体的宿 主病毒的基因组。所述方法具有多种限制。通常，病毒基因组经修饰以包含编 码抗原的病原体源性的基因。因此，所选病毒的基因组大小会限制可被表达的 病原体源性的抗原的大小。类似地，编码病原体源性的抗原的基因的***会干 扰病毒的繁衍，并限制可获得的产率。因此，嵌合病毒的制备需要针对各病原 体源性的抗原进行优化。
采用重组遗传学产生具有新表面蛋白的嵌合病毒，以通过***病原体源性 的抗原的编码区来改变宿主病毒的基因组，很可能会改变嵌合病毒的宿主范 围，从而，新生成的病毒的病原性方面会有不可预见的后果。因此已采用额外 的步骤来提供足够减毒的嵌合病毒，其无法在疫苗接种的对象中复制。
本发明克服了与传统方法相关联的问题，因为其允许制备可用于再包被轮 状病毒DLP的任何种类的嵌合表面蛋白。所述再包被的轮状病毒颗粒不包含病 原体源性的抗原的任何遗传信息。因此，在用所述再包被的轮状病毒颗粒初始 感染宿主细胞之后，不形成携带所述病原体源性的抗原的子代病毒。
两部分型衔接子***的应用还减少了优化步骤的数量。一旦制备了融合至 第一衔接多肽的经修饰的轮状病毒蛋白质，可将任何已知的病原体源性的抗原 融合至第二衔接多肽，其与第一衔接多肽形成稳定复合物。这消除了对于轮转 病毒进行遗传工程改造的任何需要。在大多数情况中，病原体源性的抗原的表 达和纯化不受病原体源性的抗原中存在的第二衔接多肽的影响，从而不需要对 现有的表达和纯化方法做出任何修改。可采用现有的用嵌合表面蛋白再包被轮 状病毒DLP的方案来制备包含嵌合表面蛋白的轮状病毒颗粒，所述嵌合表面蛋 白包含通过两部分型衔接子***连接至病原体源性的抗原的经修饰的轮状病 毒蛋白质。然后，可将这些轮状病毒颗粒纳入免疫原性组合物中，以针对病原 体源性的抗原引发免疫应答。
该疫苗平台特别有用于制备免疫原性组合物，其中，所述轮状病毒颗粒包 含三聚体嵌合表面蛋白，该三聚体嵌合表面蛋白含有异源性三聚体病毒细胞侵 入蛋白。三聚体病毒细胞侵入蛋白是许多病毒的免疫显性的表面抗原。例外的 情况有：乙型肝炎表面抗原和人***状瘤病毒L1蛋白质，上述两者均形成病毒 样颗粒，以及流感HA，其形成莲座丛，基于免疫显性的病毒表面抗原的亚基疫 苗通常无法获得临床有效的疫苗。通过在轮状病毒颗粒上以其天然构象展示这 些病毒表面抗原，可制备针对病毒引发保护性免疫应答的免疫原性组合物，其 中，所述表面抗原最初源自所述病毒。
三聚体病毒型细胞侵入蛋白的具体示例包括流感HA、HIV gp140、埃博拉 病毒糖蛋白、狂犬病病毒糖蛋白、山羊关节炎-脑炎病毒的Env蛋白、RSV F蛋 白、gB和任选的其与人单纯性疱疹病毒和HCMV的其它蛋白质的复合物。
轮状病毒颗粒
轮状病毒特别有用，因为存在具有确定的宿主范围的多种动物毒株。例如， 一些毒株特定用于奶牛，而其它毒株用于猴子。大多数动物毒株的抗原性与通 常感染人的那些毒株的抗原性不同，因此大多数无法导致人的疾病。因此，当 这些动物毒株被用于人疫苗接种的免疫原性组合物中的载体时，人对于能够干 扰针对嵌合表面蛋白的免疫应答的这些轮状病毒毒株通常不具有任何预先存 在的免疫力。此外，这些病毒在人中是天然减毒的。
此外，目前市场上有两种获批的减毒活轮状病毒疫苗：RotarixTM和 RotaTeqTM。RotarixTM包含减毒的人轮状病毒毒株RIX4414，其在原代绿猴肾细 胞(AGMK)中传了26代，并在Vero细胞中繁衍。RotaTeqTM包含分别标为G1、 G2、G3、G4和P1的五种人轮状病毒(HRV)-牛轮状病毒(BRV)重配毒株的组合， 其也在Vero细胞中繁衍。所有重配子均由表达人VP7或VP4蛋白质的BRV毒株 WC3(G6P7[5])基因组背景组成。
先前获批的基于恒河猴轮状病毒(RRV)的疫苗RotaShieldTM由RRV (G3P5B[3])和3种RRV-HRV重配轮状病毒组成。各重配子从RRV衍生10个基因， 和编码VP7蛋白的单一HRV基因，供于G血清型1、2或4特异性(G1P5B[3]， G2P5B[3]和G4P5B[3])。
此外，已建立单价牛(NCDV RIT4237G6P6)和猿(RRV毒株MMU18006 G3P5B)轮状病毒毒株用作疫苗的安全性。
采用这些疫苗毒株的免疫、临床安全性和制造经验可直接施用于本发明的 轮状病毒颗粒。例如，获批的轮状病毒疫苗中包含的任何一种轮状病毒均可被 用于制备DLP，供于用本发明的嵌合表面蛋白的再包被。
制备
包含在所述免疫原性组合物中的经修饰的轮状病毒颗粒可采用任何上述 方法制备。天然轮状病毒颗粒可经繁衍和纯化。然后，可使纯化的轮状病毒颗 粒脱壳以制备DLP，其可随后用包含病原体源性的抗原的嵌合表面蛋白再包被。
通常，将融合至第一衔接多肽的经修饰的轮状病毒蛋白质添加至DLP，以 形成轮状病毒颗粒。任选地，进一步地添加的轮状病毒蛋白质与所述轮状病毒 表面蛋白一起形成天然轮状病毒颗粒的外层。然后，使轮状病毒颗粒与融合至 第二衔接多肽的病原体源性的抗原孵育，所述第二衔接多肽与第一衔接多肽形 成稳定复合物，以提供所述嵌合表面蛋白。
制剂
本发明的免疫原性组合物可以试剂盒的形式提供，所述试剂盒包含含有冻 干的轮状病毒颗粒的第一容器，和含有用于临时重悬冻干的轮状病毒颗粒的溶 液的第二容器。冻干的轮状病毒颗粒可包含一种或多种冻干保护剂例如蔗糖、 右旋糖、山梨醇和氨基酸，以使所述轮状病毒颗粒在冻干过程中稳定。
或者，所述免疫原性组合物可在包含悬液中的轮状病毒颗粒的单一容器。 其中，所述免疫原性组合物用于注射，其可在注射器中提供。
各溶液可包含一种或多种赋形剂。
所述溶液通常基于水。因此，纯化的水可形成主要赋形剂。例如，稀释轮 状病毒颗粒以获得所需最终浓度通常将会采用注射用水(WFI)进行。
所述溶液通常包含缓冲剂。因此，其它赋形剂包括缓冲剂和pH调节剂，例 如柠檬酸钠、磷酸二氢钠一水合物，和氢氧化钠。可添加抗酸剂例如碳酸钙以 防止病毒在移动通过胃时失活(如果免疫原性组合物是口服给予的话)。还可包 含酸度调节剂例如己二酸二钠，优选地，替代抗酸剂。
在一些情况中，增稠剂例如黄原胶可作为其它赋形剂存在。
也可存在表面活性剂，具体是非离子表面活性剂例如聚山梨醇酯80。
其它赋形剂包括蔗糖、山梨醇、无机盐、氨基酸和维生素。
组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360 mOsm/kg，更优选为280-320mOsm/kg。
本发明组合物的pH通常为5.0-7.5，更一般为5.0-6.0(最佳稳定性)。
本发明组合物优选每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准度量，1EU等于0.2 ng FDA参比标准内毒素EC-2‘RSE’)，优选每剂量<0.1EU。
本发明组合物优选地不含谷蛋白。此外，本发明的组合物优选无菌组合物。
给药
所述免疫原性组合物可用于刺激粘膜免疫应答。因此，可经口服或气管内 递送所述免疫原性组合物。可选择给予的其它途径，例如肌内注射，这取决于 包含在本发明免疫原性组合物中的经修饰的轮状病毒颗粒的表面上展示的病 原体源性的抗原。
概述
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅 由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。 需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
术语“约”相关于数值x，表示，例如，x±10％或x+所述值的两个标准偏差。 在某些实施方式中，“约”被理解为特定技术领域中的可接受的变化量和公差。 除非上下文中清楚地说明，本文中的所有数学术语均应理解为被“约”修饰。 术语“抗体”包括抗体片段，例如抗原-结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)等。 抗体(或“抗体部分”)的术语“抗原-结合部分”包括保留特异性结合抗原的能力的 抗体的片段。已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段行使。术语抗 体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的示例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、 CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫桥连接 的两个Fab片段的二价片段；(iii)VH和CH1组成的Fd；(iv)由抗体单臂VL和VH结 构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段[63]；和(vi)分离的互补决定 区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，分别由不同基因编码， 但可通过重组方法，利用合成接头使其连接成为一条蛋白链，其中VL和VH区配 对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，参考文献64和65。。此类单链 抗体也应该为术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖。
除非上下文中有明确的说明，本文中所用的“或”理解为包含且能与“和/或” 互换使用。
除非上下文中有明确说明，“一个/种”和“所述”理解为包括单数和复数的情 况。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何 特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种 组分相互合并，然后可将组合与第三种组分合并等。
将动物(特别是牛)材料用于培养细胞以制备用于给予动物(尤其是人类) 的材料时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，具体是未患牛海绵状脑病 (BSE)的来源。总体而言，当制备给予动物(尤其是人)的产品时，优选在完全 不含动物源性的物质的情况下培养细胞。
当细胞底物用于重组或反向遗传学方法时，优选批准用于人类疫苗生产的细 胞底物，例如Ph Eur(《欧洲药典》)总纲5.2.3[66]所述的细胞底物。
优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))中设置 的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相 同性，其中参数为缺口开放罚分＝12、缺口延伸罚分＝1。
附图说明
图1：对(A)轮状病毒VP7蛋白和(B)所述异源蛋白进行的修饰的示意图。HR1 和HR2形成两部分型衔接子***的部分，所述两部分型衔接子***用于将所述 异源蛋白非共价地结合至轮状病毒VP7蛋白。所述异源性信号肽序列所起的作 用是实现所选表达***中的高表达水平。亲和标签使纯化简易。蛋白酶识别位 点P1可用于在纯化之后移除亲和标签A1。第二组亲和和蛋白酶识别位点(A2和P2) 可被合适的接头序列替代，并且可以起到间隔子序列的作用，这可能是展示较 大异源蛋白所需的。三聚化标签是任选的，并且可用于协助一些异源蛋白的三 聚体形成，这随后促进对于三聚体轮状病毒VP7蛋白的结合。所述三聚化标签， 尤其是基于卷曲螺旋的三聚化标签(例如GCN4)，也可作为结构模块以延伸异源 蛋白的可用空间，所述异源蛋白在用经修饰的轮状病毒VP7蛋白再包被的轮状 病毒颗粒的表面上展示。
图2：由经修饰的三聚体轮状病毒VP7蛋白和三聚体异源蛋白形成的复合物 的示意图。轮状病毒VP7蛋白通过两部分型衔接子***非共价地结合至所述异 源蛋白，其中，所述衔接子***的一部分(HR2)连接至所述轮状病毒VP7蛋白， 而所述衔接子***的另一部分(HR1)连接至所述异源蛋白。HR1和HR2形成六螺 旋束状物，导致用于将所述异源蛋白非共价地连接至轮状病毒VP7蛋白的稳定 复合物。所述嵌合表面蛋白可通过体外再包被DLP而成为所述轮状病毒颗粒外 层的组分。
图3：电子显微镜照片：(A)纯化的DLP、(B)用轮状病毒VP7蛋白再包被的 DLP，和(C)用展示作为异源蛋白的流感病毒HA的VP7蛋白再包被的DLP。在拍 照之前，对颗粒负染。
图4：(A)SDS-PAGE之后考马斯染色的丙烯酰胺凝胶。泳道1显示分子量 标志物(MW)。泳道2采用用于再包被反应(DLP)的纯化的DLP上样。泳道3采用 用于再包被DLP的纯化的VP7-HA蛋白质复合物(pro)上样。泳道4采用用于再 包被反应的DLP、经修饰的VP7蛋白和HA蛋白质的输入混合物(inp)上样。泳道 5-7采用CsCl梯度上的再包被的颗粒的纯化之后观察到的条带(条带1和2和上方 条带)上样。泳道8-14以泳道1-7的相同顺序，采用相同样品上样，但在SDS-PAGE 之前不向样品添加还原剂。(B)轮状病毒DLP用CsCl梯度上的VP7-HA蛋白质复 合物再包被。条带1和2和以及上方条带对应于图A中于泳道5-7中上样的样品。其中再包被的颗粒和DLP的位置通常会按照虚线箭头指示的那样迁移.
图5：用(A)展示HA、(B)展示带有结合的抗体CR6261的ScFv片段的HA，和 (C)展示带有结合的抗体CR6261的Fab片段的HA的，经修饰的VP7蛋白再包被的 轮状病毒DLP的三维重建截面图。CR6261识别接近膜的HA1/HA2茎中的高度保 守的螺旋区。所述重建基于对再包被的DLP进行的冷冻EM所获取的图像。
图6：DLP(白)在用经修饰的轮状病毒VP7蛋白和流感病毒HA作为经修饰的 异源蛋白再包被的DLP的三维重建上的叠加。所述重建基于对再包被的DLP进 行的冷冻EM所获取的图像。
图7：展示结合至抗体CR6261的Fab片段的流感病毒HA的轮状病毒颗粒的 三维重建的细节。所述轮状病毒颗粒通过用包含衔接子序列(HR2)的经修饰的 VP7蛋白再包被DLP来制备。HA蛋白质通过C末端融合HR1七肽重复序列非共 价结合至经修饰的VP7蛋白，其与VP7蛋白的HR2七肽重复序列形成六螺旋束状 物。CR6261在各HA亚基(HA1和HA2)的近膜端结合。所述重建基于对再包被的 DLP进行的冷冻EM所获取的图像。
具体实施方式
实施例1：用于经修饰的重组VP7、HA和HIV gp140蛋白质的表达载体的构 建
通过标准方法，将恒河猴轮状病毒(RRV)G3毒株的野生型VP7基因克隆进 入pFastBacDual载体(InvitrogenTM)的BamH I和Not I限制性位点之间。在VP7编 码序列的起始密码子之前的5’端设计Kozak序列(GCCACC；SEQ ID NO:19)。 VP7编码序列的修饰通过反向PCR进行。设计合适的退火温度的引物，其在所 述引物的末端处包含相关修饰。图1A显示向轮状病毒编码序列添加的各种修 饰。
由经修饰的VP7编码序列编码的最终蛋白质具有如下特征：前21个氨基酸 编码蜜蜂蜂毒肽信号序列，供于在昆虫细胞中表达经修饰的蛋白质。已移除VP7 蛋白信号肽。可按需使用其它信号序列，例如，人组织纤溶酶原激活物(htPA) 的HIV共有信号序列或信号肽，供于在人细胞中表达。(b)氨基酸残基22至33 形成任选的亲和标签(Strep标签II加接头，用于更高效的信号肽切割)，供于蛋 白质纯化目的，并且可被任何其它亲和标签，例如His标签、HA标签、FLAG 标签等替代。(c)氨基酸残基34至40，形成TEV蛋白酶识别序列，用于切割亲和 标签，并且可被任何其它蛋白酶的识别序列替代，例如PreScissionTM蛋白酶 (即鼻病毒3C蛋白酶)、因子Xa、肠激酶、凝血酶、弗林蛋白酶等。(d)氨基酸 残基41至136是恒河猴轮状病毒VP7N末端部分的序列(VP7氨基酸残基51至 146)。(e)氨基酸残基137是单氨基酸接头，并且可被另一种合适的接头序列替代。 (f)氨基酸残基138至165是HIV gp41HXB2毒株的C-七肽重复部分，并且可被来 自另一种逆转录病毒、副粘病毒等的七肽重复序列替代，只要替代序列与经修 饰的HA或gp140蛋白质构建体中所用的七肽重复序列相容即可(参见下文)。(g) 氨基酸残基166至187是因子Xa蛋白酶识别序列，其之后是侧接接头的蛋白质C 标签；该修饰是任选的，并且可被其它序列替代，例如，所谓表位或简单接头 序列例如GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:20)或GGSGGSGGSGGSGGSGG (SEQ ID NO:21)。表位的存在可有利于包装识别所述表位的抗体片段，以进一 步使用于结构研究目的的展示的组装子(包括所述异源蛋白)稳定化。如先前所 述，结构研究的设计是一个比现存抗原的设计更加复杂的过程。(h)氨基酸残基 188至367是恒河猴轮状病毒VP7的C末端部分(VP7氨基酸残基147至326)。由该 经修饰的编码序列编码的经修饰的VP7蛋白具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
制备替代性的构建体，其包含前述段落中所述的修饰中的一些。例如，这 些构建体中的一些包括额外的表位标签，其被抗HIV抗体2F5识别(例如SEQ ID NO:29和31)。在其它构建体中，HIV gp41HXB2毒株的C-七肽重复被尼帕病毒 的C-七肽重复替代(例如SEQ IDNO:32-41)。七肽重复序列的长度在一些构建体 (例如SEQ ID NO:27和28)中不同。类似地，在一些构建体中缩短了连接C-七肽 重复序列和VP7蛋白编码序列的剩余部分的接头(参见例如，SEQ ID NO:24-26)。 不同的变体示于表1。SEQ ID NO:22的经修饰的VP7蛋白序列作为参照序列纳 入。从N末端至C末端显示表1中的序列。
表1
Figure BDA0000937042360000341
Figure BDA0000937042360000351
Figure BDA0000937042360000361
Figure BDA0000937042360000371
由载体和经修饰的基因组成的DNA通过PCR生成。PCR产物通过凝胶纯化， 并经历T4多聚核苷酸激酶处理以产生磷酸化端。然后对所得的DNA进行钝端连 接，通过室温下将DNA与合适的量的T4连接酶孵育2小时或孵育过夜来进行。 然后，连接产物用Dpn I在37℃处理30分钟，然后用于通过标准方案转化DH5α 细胞。
通常，挑取三至四个集落，并使细胞培养物过夜生长以采用Miniprep试剂 盒(QiagenTM)制备质粒DNA。质粒通过琼脂糖凝胶电泳检测，并通过DNA测序 确认正确序列。具有正确序列的质粒用于通过标准操作转化DH10Bac感受态细 胞。挑选两至三个白色集落用于各构建体，使细胞培养物过夜生长用于通过异 丙醇/乙醇沉淀提取重组杆粒DNA(溶液I:15mM Tris，pH 8.0，10mM EDTA和100 μg/mL RNA酶A；溶液II:0.2M NaOH和1％SDA；以及溶液III:3M乙酸钾，pH 5.5；全部无菌过滤)。纯化的杆粒采用M13引物通过PCR检测，并且，正确的 DNA被用于转染6孔板中的单层sf9细胞，各空接种有1百万个细胞。在转染后5 天收获P1病毒，并通过用0.05～0.1％P1病毒感染sf9细胞(密度为1.5～2百万/mL) 来产生P2病毒。感染后5～7天收获P2病毒并用于蛋白质表达。
如上所述的经修饰的VP7蛋白构建体可用于展示形成三聚体的异源蛋白和 对应的经修饰的形成三聚体的异源蛋白(参见图1B，合适的修饰的示意图)。如 图2所示，经修饰的VP7蛋白的HR2七肽重复序列和对应的经修饰的形成三聚体 的异源蛋白的HR1七肽重复序列通过六螺旋束状物形成稳定的复合物，其表面 作为衔接子供于将所述异源蛋白非共价地固定在轮状病毒VP7蛋白上。选择甲 型流感血凝素(HA)蛋白质和HIV-1的gp140融合蛋白作为用于形成三聚体的异 源蛋白的示例。
通过连接非依赖性克隆(LIC)方法将甲型流感病毒H1N1(所罗门群岛2006) 的HA基因克隆进入pFastBac LICTM载体(Life TechnologiesTM)。pFastBac LICTM载体通过将LIC位点***pFastBac1载体(Invitrogen)来生成。在所述编码序列之 前的起始密码子的5’端设计Kozak序列(SEQ ID NO:19)。HA基因的编码序列的 修饰通过反向PCR引入。
由经修饰的HA编码序列编码的最终蛋白质具有如下特征：(a)前38个氨基 酸编码杆状病毒gp64信号肽，供于在昆虫细胞中表达经修饰的蛋白质。已移除 HA蛋白信号肽。可按需使用其它信号序列，例如，tPA的HIV共有信号序列或 信号肽，供于在人细胞中表达。(b)氨基酸残基42至47形成任选的亲和标签(His 标签加接头，用于更高效的信号肽切割)，供于蛋白质纯化目的，并且可被任何 其它亲和标签，例如strep标签、HA标签、FLAG标签等替代。(c)氨基酸残基 48至54形成TEV蛋白酶识别序列，供于切割亲和标签。还纳入接头序列。TEV 蛋白酶识别序列可被任何其它蛋白酶的识别序列替代，例如PreScissionTM蛋白 酶(即，鼻病毒3C蛋白酶、GE HealthcareTM，生命科学公司)、因子Xa、肠激酶、 凝血酶、弗林蛋白酶等。(d)氨基酸残基55至381是甲型流感所罗门群岛2006毒 株的血凝素的HA1部分的序列，其可按需被修饰/突变，或被如下所示的任何其 它流感毒株的对应部分替代。(e)氨基酸残基382至386是HA1和HA2之间工程改 造的肠激酶的识别序列，供于切割目的。该位点是任选的，并且可被因子Xa、 TEV蛋白酶等的识别序列合适地替代。(f)氨基酸残基387至565是HA的HA2部分 的序列。(g)氨基酸残基566至595是来自细菌噬菌体T4噬菌体次要纤维蛋白 (Fibritin)(Foldon)的三聚化标签，其为任选的，并且可被任何其它三聚化标签或 接头序列替代。(h)氨基酸残基596至629是HIV gp41HXB2毒株的N-七肽重复的 部分，并且可被其它合适的七肽重复序列替代，例如来自任何其它逆转录病毒、 副粘病毒等。用于描述经修饰的HA编码序列的HA氨基酸序列的编号按照 GenBank ID ABU50586.1(通过引用纳入本文，优先权申请的申请日可获得的版 本)。该构建体的氨基酸序列示于SEQ ID NO:46。
制备替代性的构建体，其包含前述段落中所述的修饰中的一些。例如，替 代性的构建体中省去了三聚化结构域(例如SEQ ID NO:48和49)。在一些构建体 中，肠激酶识别序列被因子Xa识别序列(例如SEQ ID NO:52)替代。该构建体不 包括HA编码序列和C-七肽重复序列之间的接头。在其它构建体中，三聚化结构 域和肠激酶识别序列均被省去(SEQ IDNO:51)。尼帕病毒的N-七肽重复有时用 于替代HIV gp41HXB2毒株的N-七肽重复(参见例如，SEQ ID NO:47和49)。七 肽重复序列的长度在一些构建体(例如SEQ ID NO:54，56和58)中有变化。在其 它构建体中，连接HA编码序列与N-七肽重复序列的接头的长度有变化(参见例 如，SEQ ID NO:56和58)。H3Wisconsin 2005的经修饰的HA基因(参见SEQ ID NO:60和61)和H5Vietnam 2004(参见SEQ ID NO:62和63)是通过GeneArtTM (Life TechnologiesTM)优化并合成的密码子，然后将其纳入经修饰的构建体中。 用于这些构建体的描述中的HA氨基酸序列的编号分别根据GenBank ID AAT73274.1和ACV49644.1(通过引用纳入本文，优先权申请的申请日可获得的 版本)。这些经修饰的HA编码序列的结构示于表2。SEQ ID NO:46的经修饰的 HA蛋白质序列作为参照序列纳入。从N末端至C末端显示表2中的序列。
表2
Figure BDA0000937042360000391
Figure BDA0000937042360000401
Figure BDA0000937042360000411
这三个经修饰的HA基因各自亚克隆进入pFastBacDualTM(Life TechnologiesTM)的Sal I和Not I位点之间。在如上关于VP7描述的那些类似操作 之后，产生携带经修饰的HA基因的重组杆状病毒。
HIV-1进化枝A 1992Uganda 037.8血清型和进化枝C 1997的经修饰的 gp140基因是通过GeneArtTM(Life TechnologiesTM)优化并合成的密码子。经修饰 的基因亚克隆进入pFastBacDualTM(Life TechnologiesTM)的Sal I和Not I位点之 间。
由HIV-1进化枝A毒株的经修饰的gp140编码序列编码的最终蛋白质具有如 下特征：(a)前21个氨基酸编码蜜蜂蜂毒肽信号肽，供于在昆虫细胞中表达经 修饰的蛋白质。gp140信号肽已被移除。可按需使用其它信号序列，例如，tPA 的HIV共有信号序列或信号肽，供于在哺乳动物/人细胞中表达。(b)氨基酸残 基22至29形成任选的亲和标签(His标签加接头，用于更高效的信号肽切割)，供 于蛋白质纯化目的，并且可被任何其它亲和标签，例如strep标签、HA标签、FLAG 标签等替代。(c)氨基酸残基30至36，形成TEV蛋白酶识别序列，用于切割亲和 标签，并且可被任何其它蛋白酶的识别序列替代，例如PreScissionTM蛋白酶 (即鼻病毒3C蛋白酶，GE HealthcareTM，生命科学公司)、因子Xa、肠激酶、凝 血酶、弗林蛋白酶等。(d)氨基酸残基37至685是HIV毒株1992Uganda 037.8的 gp140编码序列，其能够按需被修饰/突变，或被任何其它HIV/SIV毒株的对应 部分替代。(e)氨基酸残基686至694是接头，并且可被任何合适的其它接头序列 替代。(f)氨基酸残基695至721是来自细菌噬菌体T4噬菌体次要纤维蛋白 (Fibritin)(Foldon)的三聚化标签，其为任选的，或者可被任何其它三聚化标签或 接头序列替代。(g)氨基酸残基722至755是HIV gp41HXB2毒株的N-七肽重复的 部分，并且可被其它合适的七肽重复序列替代，例如来自任何其它逆转录病毒、 副粘病毒等。该构建体的氨基酸序列示于SEQ ID NO:64。
制备替代性的构建体，其包含前述段落中所指示的可能的修饰中的一些。 例如，这些构建体中的一些不包括三聚化标签，并且gp140编码区和N-七肽重 复之间的接头序列已被缩短(例如SEQ ID NO:66和67)。其它构建体通过信号肽 的替代而适应于在哺乳动物细胞中表达(例如SEQ ID NO:65和67)。在一些构建 体中，HIV gp41HXB2毒株的N-七肽重复已被尼帕病毒(SEQ ID NO:68-71和 76-79)的N-七肽重复替代，在其它构建体中，来自HIV-1进化枝A 1992Uganda 037.8血清型的gp140编码序列已被来自HIV-1进化枝C 1997的gp140编码序列替 代(SEQ ID NO:72-79)。进化枝A和C gp140的编号分别根据GenBank IDAAB05027.1和AF286227.1(其通过引用纳入本文，优先权申请的申请日可得的 版本)。
不同变体示于表3。SEQ ID NO:64的经修饰的gp140蛋白质序列也作为参照 序列纳入。从N末端至C末端显示表3中的序列。
表3
Figure BDA0000937042360000421
Figure BDA0000937042360000431
Figure BDA0000937042360000441
实施例2：稳定VP7-HA复合物的制备
为了生成HA-VP7复合物，Hi5细胞在5.0％热失活的FBS(西格玛-奥德里奇) 的存在下以2x106/mL的密度被0.5％VP7杆状病毒和1.0％HA杆状病毒感染。 感染后5天通过以4000×g离心45分钟沉淀细胞来收获培养基。上清液针对8升的 1x TNC(20mM Tris，pH8.0，100mM NaCl和1.0mM CaCl2；补充有0.02％叠 氮化钠)渗滤，该渗滤采用科进M切向流过滤***(密理博(Millipore))中的10 KDa截止值的滤器进行。缓冲剂交换的样品补充有1.0mM PMSF，并通过以 10,000RPM在JA10转子(BeckmanTM)中离心1小时来澄清化。通过
Figure BDA0000937042360000442
柱(IBATM)，随后通过NiNTA柱(QiagenTM)和Superose 6柱(AmershamTM)处理，从 上清液纯化蛋白质复合物。
纯化的HA-VP7复合物用0.002％(w/w)肠激酶在4℃处理48小时。将HA0切 割成HA1和HA2的结果通过SDS-PAGE检测。肠激酶通过添加1x无EDTA的完 全蛋白酶抑制剂片剂来失活。样品以0.2～0.5mM的终浓度补充有氧化还原缓冲 剂(10:1摩尔比的GSH和GSSG)和并用TEV蛋白酶(1/50～200，w/w)在室温处理 4小时或在4℃处理过夜。标签的移除也通过SDS-PAGE检测。
实施例3：稳定HIV gp140-VP7复合物的制备
将分别编码SEQ ID NO:22、26、32和36和SEQ ID NO:64、66、68和70的 经修饰的VP7和gp140基因亚克隆进入pVRC8400和pVRC-IRES-Puro载体的Sal I 和Not I之间，供于在哺乳动物细胞中表达。用于VP7基因的信号肽被改成人tPA 信号肽，并且用于gp140基因的信号肽被改成HIV共有信号肽序列。所得的经修 饰的VP7蛋白和经修饰的gp140蛋白质分别具有SEQ ID NO:42-45和SEQ ID NO: 65、67、69和71的氨基酸序列。测试经修饰的VP7蛋白和经修饰的gp140蛋白质 的如下组合的共表达和复合物形成：SEQ ID NO.42+65,SEQ IDNO.42+67, SEQ ID NO.43+65,SEQ ID NO.43+67,SEQ ID NO.44+69,SEQ ID NO.44 +71,SEQ ID NO.45+69,SEQ ID NO.45+71.
HIV gp140-VP7复合物通过用携带gp140-HR1基因的质粒和携带VP7-HR2 基因的另一种质粒共转染293T细胞来表达。瞬时转染通过如下标准方案采用聚 氮丙啶(PEI，25KDa，线性或支化)来进行。对于较高的蛋白质产率，针对嘌呤 霉素选择稳定细胞系。简言之，70％融合的293T细胞用
Figure BDA0000937042360000451
2000
Figure BDA0000937042360000452
和pVRC-IRES-puro形式的两种质粒的混合物(lipofectoamine与总 DNA的质量比为2:1)转染，转染按照标准操作进行。转染后20小时，培养基用 补充有10％胎牛血清(Atlas)、1％GlutaMAXTM
Figure BDA0000937042360000453
100单位/mL青霉素/ 链霉素
Figure BDA0000937042360000454
和2μg/mL嘌呤霉素
Figure BDA0000937042360000455
的DMEM
Figure BDA0000937042360000456
更换。通过每 三至四天更换培养基来保持培养基新鲜，直至集落形成(肉眼可见)。个体集落 经挑取并在24孔板中培养，供于小规模表达测试。同时携带两种基因的集落基 于在western印迹上检测两种蛋白质来选择。具有最高复合物产率的集落经扩 大并在液氮中以储液形式保存。细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖，而蛋白 质表达可采用贴壁或悬浮细胞培养物在补充有5％热失活FBS
Figure BDA0000937042360000457
的293Freestyle培养基
Figure BDA0000937042360000458
中进行。5天后通过以4000×g离心45分钟沉降细 胞来收获培养基。渗滤和蛋白质纯化以与就HA-VP7复合物所述相同的操作进 行。
实施例4：Fabs和Fvs制备
单克隆抗体CR6261识别接近膜的流感HA蛋白质茎中的高度保守的螺旋区 [67]。供于CR6261sHgL Fab片段的结构因子和配合物保藏在蛋白质数据银行 (Protein DataBank)的登录号4EVN下(通过引用纳入本文，优先权申请的申请日 可得的形式)，并且已于先前描述[68]。
将多克隆抗体CR6261的抗原-结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)的编码 序列克隆进入pVRC-IRES-Puro载体的Sal I和Not I之间，按照上述标准操作进 行。人tPA信号肽用于在哺乳动物表达***中的这些构建体中高效表达。最终 构建体的氨基酸序列示于SEQ ID NO:81-83。还制备用于在细菌细胞中表达的 多克隆抗体CR6261的scFv(参见SEQID NO:80)。
Fab通过在旋转瓶中瞬时转染293T细胞来表达。对于各旋转瓶，携带重链 和轻链基因的125μg的各纯化的质粒DNA混合在12.5mL的未补充的DMEM
Figure BDA0000937042360000461
中，并在通风橱中孵育15分钟。PEI(500μg，线性或支化)也在12.5mL 的未补充DMEM中稀释，并在通风橱中孵育15分钟，然后逐滴添加并均匀混合 成DNA混合物。总计25mL的混合物在通风橱中另孵育15分钟，以允许DNA-PEI 复合物形成，然后添加至旋转瓶中的50至70％融合度的细胞。细胞用DNA-PEI 复合物在37℃孵育超过5小时，然后，培养基用补充有100单位/mL青霉素/链霉 素的250mL的293FreeStyleTM培养基
Figure BDA0000937042360000462
更换。转染后5天收获培养基，然 后，Fab采用
Figure BDA0000937042360000463
Lcκ或Lcλ亲和树脂，然后通过在S200柱 (AmershamTM)上进行尺寸排阻色谱来纯化。
ScFv在293T细胞中以分泌蛋白质形式表达，或在大肠杆菌中以内含体形式 表达，然后从中提取蛋白质并使其重新折叠。然后进行与上述相同的瞬时转染 操作，供于哺乳动物细胞表达。对于大肠杆菌表达，蛋白质表达采用1mM IPTG 以0.6～0.8O.D.600nm的细胞密度诱导约5小时。细胞经收获，用1x PBS清洗， 并通过冰上声处理裂解。通过以20000×g离心15分钟来移除细胞的可溶部分之 后，提取内含体。将内含体溶解于100mM Tris pH7.5、8M脲和10mMβ-巯基 乙醇中，通过离心(40000×g 20分钟)澄清化，并在NiNTA柱上纯化上清液。将 洗脱的样品(同样是变性形式)在4℃逐滴稀释进重新折叠缓冲剂(100mM TrispH 7.5，1M精氨酸，500mM NaCl，10％甘油和1mM EDTA)至低于0.1mg/mL 的蛋白质终浓度。重新折叠的样品针对20mM Tris，pH 7.5，100mM NaCl透析 四次(每次20体积)。然后，透析的样品通过在JA10转子(BeckmanTM)中以10,000 rpm离心来澄清化，并且使上清液通过NiNTA柱以浓缩蛋白质。然后，洗脱的 部分经合并、浓缩并在S200尺寸排阻柱(AmershamTM)上进一步纯化。
实施例5：DLP制备
恒河猴轮状病毒血清型G3通过感染MA-104细胞来扩增。简言之，MA104 细胞在补充有10％胎牛血清(HyCloneTMLaboratories)、10mM HEPES，pH 7.0、 2mM L-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素/链霉素的M199培养基
Figure BDA0000937042360000464
中生长。 细胞经保持并增殖至10-层细胞培养箱(CorningTM)或旋转瓶。当细胞变得融合 时，培养基用补充有1μg/mL猪胰腺胰蛋白酶
Figure BDA0000937042360000465
的无血清MA199 更换，供于轮状病毒接种和扩增。感染的MA104细胞的培养基在感染后约36～42 小时收获，并贮存于-80℃以备后续使用。
感染的MA104细胞的冷冻培养基在4℃融化过夜。细胞碎片通过以3000×g 低速约10分钟来清除。所得上清液过滤通过
Figure BDA0000937042360000471
滤纸以移除残余的细胞 碎片，然后，使其在真空下进一步通过0.45μm ExpressPlus滤器单元 (MilliporeTM)。然后，病毒颗粒通过在45Ti转子(BeckmanTM)中于4℃以45,000 rpm离心1小时来成团。
将团块重悬于总计10mL的1x TNE缓冲剂(20mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl和1mMEDTA)，短暂超声，并用Freon 113
Figure BDA0000937042360000472
提取两次。 回收水相并在
Figure BDA0000937042360000473
离心过滤装置(100KDa截止值)以3000×g离心约10分钟 来浓缩成约1mL。浓缩的样品通过上下吹打数次来重悬，并以1x TNE在进行的 CsCl梯度上成层(1.26至1.45g/mL密度，由折射计测定)。样品以55000rpm在SW 55Ti转子(BeckmanTM)中于4℃离心约2小时。收集DLP条带，并使其在4℃下对 补充有0.02％叠氮化钠的1x TN缓冲剂(20mM Tris，pH 8.0，100mMNaCl)透 析。
DLP经负染并用电子显微镜(EM；图3A)观察。
实施例6：用HA-VP7复合物再包被DLP
将获自实施例5的DLP和实施例1中制备的经修饰的轮状病毒VP7蛋白混 合，并在5～10mM CaCl2存在下在4℃孵育至少1小时。所得颗粒经负染并用EM 观察。观察到被覆各颗粒的单一VP7层，证实了该经修饰的VP7蛋白能够再包 被DLP(图3B)。
用获自实施例2的HA-VP7复合物再包被DLP在4℃进行至少1小时，通过在 5～10mMCaCl2存在下将其以1:1.5至1:2的摩尔比混合来进行再包被。再包被的 轮状病毒颗粒经负染并用EM观察。除了被覆DLP的单一VP7层以外，还观察到 环绕该再包被的颗粒的另一层，表示HA-VP7复合物在DLP表面上的正确组装 (图3C)。
为了证实该额外的层是由HA蛋白质形成的，将再包被的颗粒上样至以1x TNC进行的CsCl梯度(密度1.25g/mL至1.45g/mL)，并在SW60转子(BeckmanTM) 中以58,000rpm离心2小时。所得的条带经收集、对于1x TNC透析，并通过 SDS-PAGE检测。作为对照，用于再包被反应的DLP，HA-VP7复合物和两者的 混合物也在该凝胶的分开泳道中上样。分离之后，观察到对应于DLP的VP2和 VP6蛋白、VP7蛋白和HA蛋白的分离的条带以与再包被的颗粒相对应的正确的 化学计量学存在于样品中(图4)。这证实，环绕该再包被的颗粒的额外的层完全由HA蛋白质组成。
实施例7：HA-VP7-抗体复合物的重建的三维图像
高分辨率冷冻EM具有替代X射线结晶学的潜力，作为用于分析较大的分子 复合物的备选方法，尤其是其中需要对大量分子复合物进行快速结构说明的领 域。一个此类领域是流感疫苗设计，其中，抗原漂移会导致免疫显性表面抗原， HA蛋白质的序列快速变化。先前已鉴定了广泛保护性多克隆抗体，并且这些抗 体中有许多识别不经历快速变化的保守表位。为了研究其作为抵抗新生流感毒 株的保护剂的合适性，我们需要针对不同的HA蛋白质变体来筛选这些广泛中和 抗HA抗体。
测试了采用冷冻EM分析的所述方法的可行性。DLP用单独的或如实施例6 所述的HA-VP7复合物形式的经修饰的VP7蛋白再包被。HA-VP7-抗体再包被的 颗粒通过如下方式获得：将纯化的HA-VP7复合物与实施例4中制备的多克隆抗 体CR6261的Fab或scFv以1:1.5～2.0的摩尔比混合。在4℃下孵育所述混合物30分 钟。通过在孵育阶段终末时在Superose6柱上加载该混合物来纯化该复合物。然 后，按照与实施例6中所述相同的操作，用纯化的复合物再包被DLP。或者，在 CsCl梯度纯化步骤之前或之后，将所述抗体片段以1:1.2～1.5的摩尔比直接添加 至用HA-VP7复合物再包被的颗粒。
冷冻栅格用VitrobotTM自动化的活塞(FEI)制备。Quantifoil Holey碳栅格发 光放电，并在使用前留置于室温过夜。对于各栅格，将浓度等同于约5mg/mL 轮状病毒DLP的4μL样品施加至珊格的侧表面。在***过程中，室湿度保持在 接近100％和并且温度保持在约22℃。然后，使栅格各侧用滤纸印迹4秒，随后 立即***液态乙烷供于玻璃化。然后，将栅格贮存在液氮中，随后用于数据收 集。
在以300kV操作的TecnaiTMF30电子显微镜(FEI)上收集数据。采用标准操 作比对光学***(波束位移、波束倾斜、臂间高度、枢轴点、旋转中心、像散性 等)。图像获取操作涉及：寻找所需的图像区域，调节失焦(在0.6和3.0μm之间)， 测试栅格漂移率(低于
Figure BDA0000937042360000481
/秒)，和最后的图像曝光。采用程序SerialEM(冷冻电 子显微镜设备，博达-科罗拉多大学)来半自动化地进行这些操作。在K2 SummitTM直接检测相机(GatanTM)上，采用超高分辨率模式(像素大小：
Figure BDA0000937042360000482
) 来以影片形式记录数据。采用参考文献24的“影片”方案。样品上的量率是约3 个电子/
Figure BDA0000937042360000483
/秒。各帧记录0.5二次曝光，并且最终影片以累积的约36个电子/
Figure BDA0000937042360000484
的量由24帧组成。
基于图像互相关，采用IMOD(冷冻电子显微镜设备，博达-科罗拉多大学) 脚本比对各影片的帧。将比对的帧简单平均化用于初始图像处理。虽然分辨率 随后改善，然而，采用各影片的前13帧(或最佳系列帧)的平均化图像(其将对应 于约20个电子剂量)。颗粒图像采用EMAN2图像处理包[69]的e2boxer.py挑取。 具有明显缺陷、像差、异常对焦、污染、重叠或大幅样品漂移的图像在检视之 后手动排除。采用EMAN2图像处理包[69]的proc2d，利用颗粒坐标来切出具有 1600×1600像素维度的个体颗粒的图像栈。失焦值采用程序CTFFIND3[23]确 定。
结构细化与重建采用程序FREALIGN[40]进行。初始定题搜索采用4x分箱 数据进行，并且以先前计算的VP7再包被的颗粒(7RP)图(参见参考文献1)作为 3维参照。由***搜索(模式3)以1°间隔角确定的切出的颗粒的初始比对参数进 一步针对最后一次重建(模式1)细化，直至分辨率上没有进一步的提高。在比对 过程中，施加介于220和
Figure BDA0000937042360000491
之间的径向壳体遮罩物，以使保持对应于轮状病 毒部分的密度，并排除对应于RNA和HA纤突的密度。图像还经低通过滤(至多
Figure BDA0000937042360000492
)以避免比对过程中可能的过拟合(overfitting)。然后，采用比对参数 来计算整个颗粒的重建(在
Figure BDA0000937042360000493
的径向壳体内，或对于蛋白质内容物在220和
Figure BDA0000937042360000494
的半径之间)。
随后，在与对4x分箱数据所用类似的策略之后，采用2x分箱的图像和后续 未分箱的图像来进一步细化比对参数，即，初始***搜索(模式3)，随后进行多 个循环的有角和定位细化(模式1)直至不再观察到分辨率的进一步提高。在各细 化阶段，施加介于220和
Figure BDA0000937042360000495
的壳遮罩物，并将数据限制在最可靠的分辨率(对 于2x分箱数据高达
Figure BDA0000937042360000496
且对于未分箱数据高达
Figure BDA0000937042360000497
)。计算
Figure BDA0000937042360000498
的径向壳体内 的整个颗粒的重建。
图5A显示仅用经修饰的VP7蛋白再包被的轮状病毒DLP的三维重建的截面 图。图5B显示，采用实施例6中所示的HA-VP7复合物再包被的轮状病毒DLP的 三维重建的截面图。图6显示向示于图5B的再包被的颗粒的三维重建上叠加 DLP。图5C显示用经修饰的VP7蛋白再包被的轮状病毒DLP的三维重建的截面 图，展示结合有抗体CR6261的ScFv片段的HA。
为了评估细化的可靠性，通过遮罩颗粒的不同区域来进行不同组的细化， 并采用比对参数来计算不包括在细化过程中的省略区域的重建。例如，采用通 过细化HA部分(通过施加介于425和
Figure BDA0000937042360000501
之间的壳遮罩物)获得的比对参数来 计算轮状病毒部分的重建(通过施加介于220和
Figure BDA0000937042360000502
之间的壳遮罩物)。所得的 图具有清晰显示VP2、VP6和VP7的密度，表明最小的模型偏差。轮状病毒VP6 和VP7层的T＝13拟等价排列清晰延伸至衔接子和所述颗粒的HA部分。未施加局 部13倍平均化，但可进行该操作以进一步提高分辨率。采用UCSF相机[47]将 轮状病毒VP2、VP6和VP7，六螺旋束状物，HA，和Fabs刚性体拟合成电子密 度图。
可通过进一步细化前述段落中所述的由冷冻EM获得的重建而获得的细节 水平的示例示于图7。显示展示流感病毒HA的轮状病毒颗粒的三维重建，所述 流感病毒HA结合至抗体CR6261的Fab片段。一些二级结构可在计算的图中观察。 如同预期，观察到CR6261的可变结构域与HA1和HA2均有相互作用。
实施例8：采用固定在轮状病毒DLP上的HA-VP7蛋白复合物进行的免疫研 究
以3周间隔用三种不同的制剂(各配制在100μl的含钙缓冲剂中)之一对雌 性6-8周龄的BALB/c小鼠肌内(IM)免疫3次。第1组接受配制的固定在轮状病毒 DLP上的HA-VP7蛋白复合物，第2组接受纯化的HA，而第3组接受与VP7-再包 被的DLP混合的纯化的HA。第4组小鼠拟注射100μl缓冲剂。实验可包括用于 所述各组的不同剂量。等量的抗原可用于将免疫应答与不同形式的等剂量抗原 做比较。或者，等量的总蛋白可用于将免疫应答与不同量的总蛋白做比较。
一个或多个组可包含佐剂。佐剂可特别有利于刺激接受纯化的HA抗原的 第2组中的小鼠中的免疫应答。
各疫苗组包括八只小鼠，并且“单独缓冲剂”对照组包括五只小鼠。在给予 第一次注射起第-1、20、41、56和84天取血。
监测免疫后小鼠的体重变化，注射位点反应，和其它临床观察结果。针对 给予的抗原的抗体应答采用本领域已知用于分析抗体特异性(例如针对HA和轮 状病毒蛋白质(包括VP7蛋白)的ELISA试验和竞争ELISA试验)和中和活性(例 如,流感凝集反应抑制试验，参见例如，参考文献70和71)的方法分析。
结果显示，对于固定于轮状病毒DLP上的HA-VP7蛋白复合物的免疫应答显 著高于纯化的HA，包括配有佐剂的纯化的HA。竞争性ELISA显示，对于HA-VP7 蛋白复合物的抗体应答主要针对该复合物的HA部分，而非该复合物的VP7或轮 状病毒部分。结果显示，采用固定于轮状病毒DLP上的HA-VP7蛋白复合物免疫 获得的中和抗体效价显著高于纯化的HA，包括配有佐剂的纯化的HA。这些结 果显示，相比于不固定在VP7包被的DLP上的flu抗原，固定在轮状病毒VP7包 被的DLP上的flu抗原的免疫原性提高。
全部动物实验均按照实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)的方案进行。
实施例9：采用或不采用佐剂，利用固定于轮状病毒DLP上的HA-VP7蛋白 复合物的免疫研究
于第0、21和42天，用0.3-15μg的纯化的抗原H1N1血凝素(HA)蛋白质复合 物(如下表4所示)，通过在后四头肌两次双侧50μl肌内注射来免疫雌性BALB/c 小鼠。
免疫之前1-2小时，复合物用PBS或佐剂配制。配制的亚基疫苗保持在冰上 直至给予。
监测免疫后小鼠的体重变化，注射位点反应，和其它临床观察结果。通过 在第20天(初免后3周)和第41天(第二次免疫后3周)的眼球后窦出血来从动物获 得血清样品，并在第63天(第三次免疫后3周)通过使安乐死的动物出血来获得血 清样品。
对于给予的抗原的抗体应答采用本领域中已知的方法(例如ELISA试验，中 和试验)分析。结果显示，对于固定于轮状病毒DLP上的HA-VP7蛋白复合物的 免疫应答显著高于纯化的HA(包括配有佐剂的纯化的HA)，或虽用VP7包被的 DLP配制但不固定在VP7包被的DLP上的纯化的HA。
全部动物实验均按照实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)的方案进行。
表4
Figure BDA0000937042360000511
Figure BDA0000937042360000521
A/Sol单批是脂质-寡聚化三聚化的重组HA。
7RP是VP7再包被的颗粒，不含HA。
HA+7RP是VP7再包被的颗粒(其上不固定HA)+三聚化的重组HA。
HA-7RP是VP7再包被的颗粒，其上固定三聚化的重组HA。
A/Sol HA是三聚化的重组HA。
本文中所引和所列的各参考文献、专利和专利申请均独立地通过引用其全 文纳入本文。本文中引用的各登录号以本申请的优先权申请的申请日可获得的 版本为准通过引用纳入本文。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的 范围和构思内。
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Claims (14)

1.一种嵌合表面蛋白的复合物，其中包含连接至异源蛋白的轮状病毒表面蛋白VP7，其中，所述轮状病毒表面蛋白VP7通过两部分型衔接子***非共价连接至所述异源蛋白，其中，所述衔接子的一部分包含第一衔接多肽，所述第一衔接多肽任选地通过接头序列融合至所述轮状病毒表面蛋白VP7，所述衔接子的另一部分包含第二衔接多肽，所述第二衔接多肽任选地通过接头序列融合至所述异源蛋白，所述第一衔接多肽和所述第二衔接多肽彼此相互作用以形成稳定的复合物，所述嵌合表面蛋白的复合物能够体外再包被双层颗粒而成为轮状病毒颗粒外层的组分。
2.如权利要求1所述的嵌合表面蛋白的复合物，其特征在于，第一衔接多肽和第二衔接多肽包含七肽重复序列。
3.一种轮状病毒颗粒，其包含如权利要求1所述的嵌合表面蛋白的复合物。
4.一种药物，包含如权利要求3所述的轮状病毒颗粒。
5.一种核酸组合物，其包含：
(a)编码经修饰的轮状病毒表面蛋白的开放阅读框，所述经修饰的轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白VP7、第一衔接多肽，所述第一衔接多肽通过任选的接头序列融合至所述轮状病毒表面蛋白VP7；和
(b)编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含异源蛋白、第二衔接多肽，所述第二衔接多肽通过任选的接头序列融合至所述异源蛋白；
所述第一衔接多肽和所述第二衔接多肽彼此相互作用以形成稳定的复合物；
任选地，其中，所述开放阅读框操作性地连接至启动子序列。
6.如权利要求5所述的核酸组合物，其特征在于，所述衔接多肽包含七肽重复序列。
7.一种试剂盒，其包含：
(a)第一核酸和第二核酸，所述第一核酸编码经修饰的轮状病毒表面蛋白，所述经修饰的轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白VP7和第一衔接多肽，所述第二核酸包含编码第二衔接多肽和多克隆位点的核苷酸序列，并且其中，在所述多克隆位点中***异源蛋白的编码区产生编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含所述异源蛋白和第二衔接多肽；或
(b)第一核酸和第二核酸，所述第一核酸编码经修饰的轮状病毒表面蛋白，所述经修饰的轮状病毒表面蛋白包含轮状病毒表面蛋白VP7和第一衔接多肽，所述第二核酸编码包含异源蛋白和第二衔接多肽的融合蛋白；
其中，所述第一衔接多肽和所述第二衔接多肽能够形成稳定的复合物，
任选地，其中，所述试剂盒还包含轮状病毒颗粒，其中所述颗粒源自与所述轮状病毒表面蛋白VP7相同的轮状病毒物种，或来自不同的轮状病毒物种。
8.一种制备权利要求3的轮状病毒颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括：在培养基中生长的细胞内繁衍包含外层的轮状病毒颗粒，从所述培养基纯化所述轮状病毒颗粒，从所述轮状病毒颗粒移除外层以获得轮状病毒双层颗粒(DLP)，和，用权利要求1或2所述的嵌合表面蛋白的复合物再包被所述轮状病毒DLP，以产生权利要求3所述的轮状病毒颗粒。
9.一种制备权利要求3的轮状病毒颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括：在培养基中生长的细胞内繁衍包含外层的轮状病毒颗粒，从所述培养基纯化所述轮状病毒颗粒，从所述轮状病毒颗粒移除所述外层以获得轮状病毒DLP，和，用第一融合蛋白再包被所述轮状病毒DLP，所述第一融合蛋白包含形成三聚体的轮状病毒表面蛋白VP7、七肽重复序列和任选的接头序列，以及，将所述再包被的轮状病毒DLP与第二融合蛋白混合，所述第二融合蛋白包含形成三聚体的异源蛋白、七肽重复序列和任选的接头序列，以产生权利要求3所述的轮状病毒颗粒。
10.一种制备权利要求3所述的轮状病毒颗粒的方法，所述方法包括：将包含第一融合蛋白的轮状病毒颗粒和第二融合蛋白混合，所述第一融合蛋白包含形成三聚体的轮状病毒表面蛋白VP7、七肽重复序列和任选的接头序列，所述第二融合蛋白包含形成三聚体的异源蛋白、七肽重复序列和任选的接头序列。
11.一种用于测定异源蛋白的结构的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(i)用权利要求1所述嵌合表面蛋白的复合物再包被轮状病毒DLP以产生展示所述嵌合表面蛋白的复合物的轮状病毒颗粒的悬液，(ii)冷冻所述悬液，(iii)采用冷冻EM对所述轮状病毒颗粒成像以获得多张显微照片，和(iv)分析所述多张显微照片以获得所述嵌合表面蛋白的复合物的三维模型。
12.一种用于测定与某一分子复合的异源蛋白的结构的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(i)用权利要求1所述的嵌合表面蛋白的复合物再包被轮状病毒DLP以产生展示所述嵌合表面蛋白的复合物的轮状病毒颗粒的悬液，(ii)向该悬液添加特异性结合至所述异源蛋白的分子，其中，所述分子与所述嵌合表面蛋白的复合物形成复合物，(iii)冷冻所述悬液，(iv)采用冷冻EM对所述轮状病毒颗粒成像以获得多张显微照片，和(vi)分析所述多张显微照片，以获得与所述分子复合的所述嵌合表面蛋白的三维模型。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述分子是蛋白质分子。
14.如权利要求13所述的方法，所述蛋白质分子是(a)抗体或其片段，其中，所述抗体或片段特异性结合所述异源蛋白；或(b)细胞表面受体，其中，所述异源蛋白是病毒型细胞侵入蛋白，且所述蛋白质分子被所述病毒型细胞侵入蛋白所结合。
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