CN105506172B - 含检测gfod2的骨质疏松血液诊断试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含检测GFOD2的骨质疏松血液诊断试剂及其应用。发明人对9例骨质疏松患者外周血样本及6例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因GFOD2，分子验证结果证实GFOD2基因在骨质疏松患者外周血中低表达。本发明提示检测外周血中致病靶点基因将辅助临床骨质疏松的诊疗，为骨质疏松诊断、治疗及预测提供了新的解决方案。

Description

含检测GFOD2的骨质疏松血液诊断试剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及含检测GFOD2的骨质疏松血液诊断试剂及其应用。
背景技术
骨质疏松症(Osteoporosis)是由各种原因导致的骨量减少，骨组织微结构破坏，骨骼脆性增加，易于发生脆性骨折的一种全身性骨病。美国国立卫生研究院把骨质疏松症定义为“以骨强度下降而易于骨折为特征的骨骼***疾病。其主要病理表现为松质骨骨小梁变细、断裂和数量减少，皮质骨多孔、骨质结构紊乱。依据发病的原因不同，骨质疏松可分为:原发骨质疏松和继发骨质疏松两类。原发性骨质疏松，临床上比较多见，主要分为3种：妇女绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松症。继发性骨质疏松症主要由于以下因素引起：内分泌因素、过多使用激素类药物、营养因素、机体疾病因素以及其他因素。骨质疏松症本质上是一种骨重建障碍的疾病，导致的骨量减少(骨密度降低)、骨质结构改变和骨转换失衡构成了骨质疏松症的病理基础。研究骨质疏松病理的分子机制，探究异常表达的特异性基因与疾病之间的关系，有助于深入了解疾病的发病机制，有利于骨质疏松的早期诊断及预后。
为解决目前骨质疏松分子标记稀缺的问题，发明人对9例骨质疏松患者外周血样本及6例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因GFOD2。进一步，本发明进行了分子生物学方法证实了GFOD2与骨质疏松病的关系：GFOD2在骨质疏松患者外周血中低表达，与骨质疏松病具有很好的相关性。血清检测有创伤小、方法简便、结果可靠等优点，检测外周血中GFOD2为骨质疏松诊断、治疗及预测提供了新的解决方案。本发明提供的候选基因GFOD2可用于制备骨质疏松辅助诊疗制剂，有望成为骨质疏松临床治疗的潜在基因治疗靶点，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供GFOD2基因和/其表达产物在制备骨质疏松诊断和/或治疗制剂中的应用。
本发明的目的在于提供检测GFOD2基因和/其表达产物在制备骨质疏松诊断制剂中的应用。
进一步，骨质疏松诊断制剂检测外周血中GFOD2基因和/或其表达蛋白的表达情况。
为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因GFOD2，进一步通过分子生物学方法验证了GFOD2与骨质疏松的关系：GFOD2在骨质疏松患者外周血中低表达，与骨质疏松病具有很好的相关性，可用于制备治疗骨质疏松制剂和/或骨质疏松诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
本发明的目的在于提供GFOD2基因在制备骨质疏松诊断制剂中的应用。
进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测骨质疏松外周血中GFOD2基因的表达。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测***的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
所述的用于荧光定量PCR方法检测骨质疏松中GFOD2基因的产品含有一对特异性扩增GFOD2基因的引物；所述的基因芯片包括与GFOD2基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供GFOD2基因表达产物在制备骨质疏松诊断制剂中的应用。进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用免疫方法检测GFOD2蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测骨质疏松中GFOD2蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。
常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或外周血切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或外周血超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
进一步，所述检测GFOD2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的GFOD2单克隆抗体，优选abcam抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被GFOD2单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，所述检测GFOD2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的GFOD2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗GFOD2单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供一种检测骨质疏松的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因GFOD2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ IDNO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选康为世纪血液RNA提取试剂盒进行样本RNA提取。
本发明还检测了本试剂盒灵敏性，最小检出浓度为100copies/μl。
本发明目的是提供了一种骨质疏松检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测GFOD2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测骨质疏松的基因芯片，所述的基因芯片包括与GFOD2基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供一种治疗骨质疏松试剂，所述治疗骨质疏松试剂促进GFOD2基因的表达。进一步，所述的治疗骨质疏松试剂中含有促进GFOD2基因表达的载体。
进一步，所述治疗骨质疏松试剂是指可以促进GFOD2基因的表达的试剂。本领域人员熟知促进基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过DNA水平调控目的基因：包括但不限于增加GFOD2基因的拷贝数、转染含GFOD2基因的过表达载体；通过转录水平调控GFOD2基因：包括但不限于激活GFOD2基因的表达、激活调控GFOD2基因表达的启动子、抑制负调控GFOD2基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制GFOD2基因表达的抑制子进行干扰；通过转录后水平调控GFOD2基因：包括但不限于抑制促进GFOD2基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进GFOD2基因表达的microRNA；通过翻译后水平调控GFOD2基因：包括但不限于导入促进目的基因编码蛋白的分子、抑制负调控GFOD2基因表达的蛋白、促进GFOD2基因表达的因子及蛋白的表达。
本发明的目的在于提供上述治疗骨质疏松试剂在制备骨质疏松治疗制剂中的应用。
附图说明
图1是GFOD2基因在骨质疏松外周血及健康人外周血中相对表达量图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1高通量测序及分析
样本来源于北京协和医院，均征得试验对象知情同意。分别收集9例骨质疏松病例外周血样本及6例健康人对照外周血样本，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因GFOD2。
实施例2骨质疏松患者外周血及健康人外周血GFOD2基因表达情况
一材料和方法
1、材料
收集74例骨质疏松患者外周血及46例健康人外周血，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1骨质疏松患者外周血及健康人外周血总RNA的提取
采用康为世纪血液RNA提取试剂盒(货号CW0538)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作见说明书。
RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2 GFOD2检测引物设计与合成
根据PCR引物设计原则，应用Premier 5.0和增强版的OligoArchitectTM软件进行引物设计。
GFOD2(NM_030819)的上、下游引物序列分别为：
上游引物：5'-CTTGCTTTATTAAGTGAG-3'；SEQ ID NO.1
下游引物：5'-TTTCTGAATTATTTATTAACAT-3'；SEQ ID NO.2
产物长度为119bp。
内参β-actin(NM_001101)上、下游引物序列分别为：
上游引物：5'-TAATCTTCGCCTTAATACT-3'；SEQ ID NO.3
下游引物：5'-CCTTCATACATCTCAAGT-3'；SEQ ID NO.4
产物长度为103bp。
2.3定量标准曲线的建立
标准DNA模板的制备
按照说明书，从外周血中利用康为世纪血液RNA提取试剂盒(货号CW0538)提取总RNA，接着用康为世纪SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤如下：
1.将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.配置反应体系，总体积为20μl：终浓度为50pg-5μg的RNA模板、2μl Primer Mix、4μl dNTP Mix、4μl RT Buffer、1μlSuperRT，加RNase-Free Water补平到20μl。
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4. 42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2×Taq MasterMix(货号CW0682)进行常规PCR，反应体系和条件如下：2×Taq MasterMix 25μl、上下游引物各2μl、cDNA0.5μg、补平至50μl。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；最后72℃延伸2min。
取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在108-102copies/μl)。
2.3敏感性实验
取重组质粒按比例稀释为108、107、106、105、104、103、102个拷贝/μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为108-102copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。
2.4 qRT-PCR检测GFOD2基因表达量
取上述74例骨质疏松患者外周血和46例健康人外周血用康为世纪血液RNA提取试剂盒(货号CW0538)提取总RNA，进而用UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)进行RT-PCR。具体步骤：
1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzyme Mix 0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4.将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应：反转录：45℃10min；95℃10min预变性，接45个循环：95℃15s，60℃60s。
对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows 11.5软件，相关数据采用χ2检验和Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软件来计算。
二结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式，比较GFOD2基因在骨质疏松外周血和健康人外周血中的表达水平。结果显示(具体见图1)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中GFOD2在骨质疏松患者外周血中的表达水平低于健康人外周血，前者约为后者的十分之三，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析GFOD2在骨质疏松外周血中低表达的结果。
实施例3一种检测骨质疏松的检测试剂盒及使用方法
RNA提取试剂：超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)
荧光定量试剂：UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)
荧光定量PCR反应体系及方法：
RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzyme Mix 0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。
反应调节：反转录：45℃10min；95℃10min预变性，接30-40个循环：95℃15s，60℃60s。
本发明采用高通量测序筛选出骨质疏松致病相关基因GFOD2，结合分子生物学实验验证，证实了GFOD2在骨质疏松疾病中具有重要的作用。本发明为骨质疏松临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

Claims (7)

1.检测GFOD2基因和/或其表达产物的试剂在制备骨质疏松诊断制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨质疏松诊断制剂检测外周血中GFOD2基因和/或其表达蛋白的表达情况。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测GFOD2基因的表达。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用荧光定量PCR方法检测GFOD2基因的产品含有一对特异性扩增GFOD2基因的引物；基因芯片包括与GFOD2基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增GFOD2基因的引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨质疏松诊断制剂采用免疫方法检测GFOD2蛋白的表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测GFOD2蛋白表达的为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。
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