CN105506082A - 利用链转移型引物扩增核酸及融合探针的方法 - Google Patents

Abstract

合成起始位点多，灵敏度强与特异性强的利用链转移型引物扩增核酸的方法：(a)设计链转移型引物；(b)利用DNA聚合酶的核酸酶活性切割所述链转移型引物，经切割后引物形成链转移，作目标核酸的扩增；该目标核酸从5’末端向3’末端开始依次规定F2区域、F1区域和R1区域，从3’末端向5’末端开始依次规定F2c区域、F1c区域和R1c区域，所述F2与F2c、F1与F1c或R1与R1c区域，指两片段间呈反向互补；所述链转移型引物由R1加上F1片段而成；所述链转移指经上游F3引物介导的片段延伸至F2区域时，DNA聚合酶的外切酶活性切割链转移型引物，使链转移型引物内部的R1片段转移，结合下游R1c区域充当反向引物。本发明适用于核酸扩增。

Description

利用链转移型引物扩增核酸及融合探针的方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增，特别是利用链转移(StrandTransfer)原理扩增核酸，是可有效应用于生物医学领域扩增目标核酸的方法及相应的检测方法，具体包括链转移型引物(StrandTransferPrimer,STP)、链转移引物探针(StrandTransferPrimer&Probe,STPP)的设计方法，目标核酸分子扩增及相应的检测。

背景技术

DNA的合成应用于生物医学各领域。该合成的典型方法有如聚合酶链反应(PCR)。PCR使用上下游两个寡核苷酸引物和DNA聚合酶来产生双链产物。其中，引物与模板上下游的目标序列互补杂交，而DNA聚合酶通过添加脱氧核苷三磷酸(dNTPs)来延伸退火引物。用于RNA模板时，加上逆转录步骤即反转录PCR(RT-PCR)。核酸扩增的终产物可用于体外生物学操作。为实现特定的应用面，若进行实时检测的需要，已出现荧光定量PCR的解决方法。若进行核酸分子的突变、连接等，已出现重组PCR的设计方案。若进行整合分子或外侧序列的鉴定等，已出现Alu-PCR或反向PCR等形式。

为避免热循环，已根据聚合酶的特性及引物设计等开发出若干种等温目标扩增方法。比如链置换扩增、转录介导扩增、自主序列复制、滚环扩增、环介导等温核酸扩增等。这些扩增技术都有一定的局限性。如链置换扩增在扩增长目标序列时效率低，转录介导扩增和自主序列复制的起始材料仅限于RNA分子，环介导等温核酸产物呈长短不一的串联体结构等。

经典的PCR扩增等受到靶分子模板靶序列结构、多态性与长度的影响。在扩增复杂序列结构、多态性较为复杂模板或较长序列模板时，扩增效率不明确的因素很多。尤其是不易找到适合扩增的上下游匹配引物。本发明鉴于上述事实而提出链转移式引物设计以及用链转移引物扩增目标核酸以制成核酸检测探针，其目的在于提供补充和改善现有技术的一种新型的核酸扩增与检测技术。

发明内容

本发明要解决上述现有技术中核酸扩增面临的缺陷与问题，目的在于提供一种链转移型引物的设计及利用链转移型引物扩增目标核酸及制作核酸探针。

本发明利用链转移型引物扩增目标核酸的方法的技术方案，其特殊之处在于：

(a)设计链转移型引物；

(b)利用DNA聚合酶的核酸酶活性切割所述链转移型引物，经切割后引物形成链转移，进行目标核酸的扩增；

所述目标核酸，从5’末端向3’末端开始依次规定F2区域、F1区域和R1区域，从3’末端向5’末端开始依次规定F2c区域、F1c区域和R1c区域，所述区域指寡核苷酸片段，所述F2与F2c区域，F1与F1c区域，或R1与R1c区域，指两片段间呈反向互补；

所述链转移型引物由R1加上F1片段而成；所述链转移指经上游F3引物介导的片段延伸至F2区域时，DNA聚合酶的外切酶活性切割链转移型引物，使链转移型引物内部的R1片段转移，结合下游R1c区域充当反向引物。

所述目标核酸来自生物样品中的宿主或病原体核酸。

本发明利用链转移型引物融合核酸探针(STPP)其特殊之处在于所述链转移型引物的3’侧F1设计成荧光探针，使用STPP的方法可用于实时核酸检测。

本发明所述链转移型引物或探针可以正向或反向设计，链转移型引物及或探针内部加入外源序列、人工序列或是碱基修饰，以及多重链转移型引物及或探针。

本发明扩增核酸的方法在于：(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有外切酶反应活性的DNA聚合酶、至少一种链转移引物，制备反应混合液；(b)将所述反应混合液进行温度循环，以使DNA聚合酶作用下的互补链延伸以生成反应产物。

应用链转移引物比常规的PCR引物提供更多的合成起始位点，使灵敏度增强；能鉴别序列变异，使特异性增强；可应用于序列信息不明或者较难扩增序列结构的目标核酸。

本发明的技术要点在于组合常见DNA聚合酶的外切酶活性，及链转移式引物与探针的设计，替代传统核酸过程中上游正向、下游反向引物的介导过程。

本发明所述链转移型引物，包括任何一种在引物的3’末端或3’-末端侧配置有模板互补区域、5’末端或5’-末端侧配置有相对于3’端模板下游的互补区域、能在本发明的方法中用于核酸链延伸、能被外切核酸酶切割、及或链置换效应进行置换的寡核苷酸引物。其中，3’-末端侧指的是从引物中央到3’末端的部分，5’-末端侧指引物的中央到5’-末端的部分。即，链转移引物是一种拼接寡核苷酸引物。链转移引物的3’-区为F1，与模板F1c区域互补；5’-区为R1，与下游模板R1片段互补链互补(图1)。

R1与F1构成链转移引物的基本结构。DNA聚合酶中的外切核酸酶或链置换酶活性识别，切割或置换该引物处延伸的DNA链(引物延伸链)，其作用位点的核糖核苷酸位于R1与F2的连接处。如当链转移引物中的F1片段与模板退火延伸时，DNA聚合酶作用于与模板核酸退火的F1片段5’端，经切割产生游离R1片段。R1经链转移后成为下游引物(图2)，继续进行聚合反应。

本发明所用到的链转移引物有R1F1的通用结构，在此结构上的进一步拓展，诸如链转移引物呈5'→3'正向或3’→5’反向，链转移引物内部加入外源序列(启动子序列、接头子序列、适配子序列)、人工序列(标签序列)或是碱基修饰、核酸类似物等，均在本发明范围内。所述的链转移引物可应用于PCR反应或等温扩增反应等，均在本发明范围内。

木发明对使用的链转移引物核苷酸的长度没有特别的限制，只要在3’末端或3’末端侧及5’末端或5’末端侧均有模板互补序列，可应用于链转移反应。R1或F1的长度推荐约12个核苷酸～约40个核苷酸。

上述链转移引物是本发明的基本结构，此结构已是扩增反应所用引物的充要条件。为提高扩增效率，可以加入多重链转移引物，如引入2个链转移引物(图3)直至n个链转移引物(图4)。在此基础结构上增加的引物结构均在本发明范围内。

本发明使用的外切核酸酶只要能应用于本发明的方法中，并不限制为具体的某一种。任何能识别所述的链转移引物进行切割而形成链转移的外切核酸酶均可用于本发明，比如λ噬菌体核酸外切酶(λexo)以及T7噬菌体基因6核酸外切酶等。常见的DNA聚合酶具有5'→3'外切核酸酶活性外切核酸酶活性。

本发明所用到的DNA聚合酶是指利用DNA链作为模板合成新DNA链的酶。具有5-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶可以用于本发明，也可使用同时具备5-3'外切核酸酶活性与链置换活性的DNA聚合酶。

所述链置换活性应用的结果，是在基于模板核酸序列的DNA复制的过程中，置换DNA链以释放已与模板链退火的互补链。

任何具有上述活性的DNA聚合酶可应用于本发明。其例子包括来源于大肠杆菌DNA聚合酶-I的大片段、水生栖热菌yT1株的TaqDNA聚合酶；ThermusthermophilusHB8中的TthDNA聚合酶等。

本发明扩增目标核酸的方法包括使用具有外切酶活性的DNA聚合酶去进行引物链转移反应。在该转移反应中，经外切酶切割形成反向引物，转移至模板双链核酸相应互补片段，经DNA聚合酶催化，合成与该模板互补的引物延伸链(图2)。链转移反应也即指：链转移引物经具所述DNA聚合酶处理，生成与该模板延伸链互补的寡核苷酸片段。在延伸链合成的过程中，上述寡核苷酸片段不断转移至模板下游，充当引物介导扩增的循环。

本发明扩增核酸方法可用于核酸的检测、标记和重组等。

本发明核酸扩增方法可使用荧光探针技术进行核酸的实时定量检测。目前已有多种荧光探针可采用。例如水解(Taqman)探针。这类探针由供体和受体分别标记的DNA寡聚核苷酸组成。探针被设计为结合到扩增产物的一条链上的特定区域。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。当扩增时，探针裂解(水解作用)后，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，可监测荧光信号。图4具体示意链转移引物介导的扩增结合水解探针检测技术。

本发明也可组合分子信标、荧光能量共振探针、蝎子探针等进行核酸检测。也可采用非特异染料作为荧光标记。不作为对本发明的限制。

本发明同时提供一种链转移型引物与探针融合的检测策略。当F1定义为荧光探针时，构成新的实时荧光检测体系(图5)。此结构命名为STPP。

本发明所述STPP的荧光标记，即共价连接的荧光染料。具体地，荧光标记可以选自以下染料：FAM、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET,TAMRA,JOE、ROX,BODIPYTMR、德克萨斯红、AlexaFluor和PET等。荧光淬灭基团可选用DABCYL、BHQ1、BHQ2等。

本发明可以在DNA或RNA靶分子模板上直接实施。

本发明亦以实例方式提供了用于迅速且正确检测病原体分子及宿主分子的方法。

本发明的有益效果主要在于应用链转移引物比常规的PCR引物提供更多的合成起始位点，使灵敏度增强，能鉴别序列变异，使特异性增强。本发明的有益效果还可通过尤其是下文中指出的各方法和组合来实现和获得。

附图说明

图1显示本发明方法链转移引物的示意图。

图2显示本发明方法链转移引物介导的扩增反应示意图。

图3显示本发明方法多个链转移引物的示意图。

图4显示本发明方法链转移引物介导的扩增反应结合荧光探针检测示意图。

图5显示本发明方法链转移引物探针的设计。

图6显示本发明方法链转移引物探针的检测示意图。

具体实施方式

本实施方式中，将待检测的核酸模板称为靶分子，其碱基序列为靶序列。可能含有靶分子的受试品为样本。

作为本发明对象的样本没有特别限定，例如可使用源于受试者的全血、血清、血浆、白细胞、尿、粪便、***、唾液、组织粘膜、培养细胞、痰液或组织等。所述的受试者可以是人、动植物以及病毒、细菌、真菌、衣原体、螺旋体、立克次体和支原体等微生物。由样本中提取出核酸成分，提取方法没有特别限定。

如图1所示是链转移引物的示意图；本发明方法中，所述靶分子从5’末端向3’末端开始依次规定F2区域、F1区域和R1区域，从3’末端向5’末端开始依次规定F2c区域、F1c区域和R1c区域，所述区域泛指寡核苷酸片段。所述F2与F2c区域，F1与F1c区域，或R1与R1c区域等，指两片段间呈反向互补。

本发明方法中，所述链转移型引物是指5′侧F1与3′侧R1构成的基本结构。R1长度推荐18～25碱基，F1长度推荐15～27碱基，F2长度推荐18～25碱基。R1与F1的接合部可有0～2个重叠碱基，优选G碱基重叠。F2至R1区域可规定大于等于一种的链转移型引物。

本发明方法中，各引物的解链温度(Tm)描述为：F2与R1的Tm匹配。链转移引物内F1片段的解链温度优选稍大于F2；此处的匹配是指两者Tm之间不超过±5℃，优选为±2℃。F2引物与链转移引物浓度的比例范围：1:1～1:5。本方法中使用的DNA聚合酶可以是耐热DNA聚合酶Taq、Tth酶等。

下列实例是进一步对本发明的说明，不应当作对本发明的限制。

实施例1HIV-1Gag部分片段的核酸扩增

以HIV-1的检测为例，说明本发明涉及链转移引物的应用。所采用的样本为HIV-1病毒持续复制的H9细胞株，旨在对本发明方法的应用进行举例。Gag基因编码HIV-1病毒的壳粒，通常是HIV-1的检测靶标。从Genbank获取Gag序列，具体引物信息：

Gag-F2:ACATAGCAGGAACTACTA(SEQIDNO:1)

Gag-STP:TAAGAATGTATAGCCCTACCAGCAGGAACAAATAGGATGGAT(SEQIDNO:2)

反应模板从已定标的H9细胞抽提DNA。PCR反应包含1×PCRbuffer(Takara)，0.1U/μLHotStarTaqpluspolymerase(Qiagen)，200μmol/LdNTP，0.3umol/LGag-F2，0.2umol/LGag-STP，10ng模板。反应程序：95℃5min变性后，95℃15s、60℃45s共计45循环。反应后，反应混合液取5uL，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到阳性扩增条带。

实施例2STAT1分子的扩增

以STAT1分子的扩增为例，说明本发明对宿主分子的应用。从293T细胞提取DNA。所采用的阳性对照为pcDNA-STAT1质粒。

STAT1的核苷酸序列从GenBank获取(检索号NM_007315)，具体引物信息：

STAT1-F2-1:AAGGACAAGGTTATGTGTATAG(SEQIDNO:3)

STAT1-STP:GAGAACACGAGACCAATGTCAAGAGCCTGGAAGATT(SEQIDNO:4)

PCR反应包含1×PCRbuffer(Takara)，0.1U/μLHotStarTaqpluspolymerase(Qiagen)，200μmol/LdNTP，0.3umol/LSTAT1-F2-1，0.2umol/LSTAT1-STP，10ng模板。反应程序：95℃5min变性后，95℃15s、60℃45s共计45循环。反应后，反应混合液取5uL，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到阳性扩增条带。

实施例3链转移引物探针法的组合应用检测

本实施例中，与实施例2同样使用人STAT1基因作为靶分子核酸，进行链转移引物合并探针法的检测举例。本实施例中使用的合成核苷酸引物如下所示。

STAT1-F2-2:GCTGTTACTCAAGAAGATG(SEQIDNO:5)

STAT1-STPP:

TAATGATGAACTAGTGGAGTA(FAM)ATAGAGTTGCTGAATGTCACTGAAC(BHQ-1)(SEQIDNO:6)

上述探针中FAM表示该探针黑体A碱基使用FAM荧光报告基团标记，BHQ1表示3’端用BHQ1淬灭基团标记。如前所述，荧光发射基团与淬灭基团可以根据需要而改变。

PCR反应包含1×PCRbuffer(Takara)，0.1U/μLHotStarTaqpluspolymerase(Qiagen)，200μmol/LdNTP，0.3umol/LSTAT1-F2-2，0.2umol/LSTAT1-STPP，10ng模板。反应程序：95℃5min变性后，95℃15s、60℃45s共计45循环。

使用293T细胞抽提的DNA作为模板，同时设立阳性、阴性与空白对照。使用ABI-7500荧光定量PCR仪器，每一延伸末期读取荧光信号。本发明方法能够实时检测出STAT1分子的表达。检测灵敏度可达25拷贝/ml，并具有良好的特异性。

Claims (4)

1.利用链转移型引物扩增核酸的方法，其特征在于：

(a)设计链转移型引物；

(b)利用DNA聚合酶的核酸酶活性切割所述链转移型引物，经切割后引物形成链转移，进行目标核酸的扩增；

所述目标核酸，从5’末端向3’末端开始依次规定F2区域、F1区域和R1区域，从3’末端向5’末端开始依次规定F2c区域、F1c区域和R1c区域，所述区域指寡核苷酸片段，所述F2与F2c区域，F1与F1c区域，或R1与R1c区域，指两片段间呈反向互补；

所述链转移型引物由R1加上F1片段而成；所述链转移指经上游F3引物介导的片段延伸至F2区域时，DNA聚合酶的外切酶活性切割链转移型引物，使链转移型引物内部的R1片段转移，结合下游R1c区域充当反向引物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目标核酸来自生物样品中的宿主或病原体核酸。

3.利用链转移型引物融合探针的方法，其特征在于所述链转移型引物的3’侧F1设计成荧光探针。

4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述链转移型引物及探针为正向或反向设计，，链转移型引物内部加入外源序列、人工序列或是碱基修饰，以及使用多重链转移型引物及或探针。