CN105503632B - 一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用，所述半抗原为通式(Ⅳ)所示的化合物，抗原为半抗原与载体蛋白偶联而成的结晶紫和孔雀石绿抗原，应用本发明制备抗原和抗体可制成酶联免疫试剂盒。本发明的优点包括：生产过程安全简单、温度要求条件不严苛，产物性质稳定，成本低；鉴于半抗原、抗原及其相应的抗体结构，制成的酶联免疫检测试剂盒对孔雀石绿和结晶紫的灵敏度高，交叉反应率达95％以上。

Description

一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原 的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、抗原制备方法。
背景技术
结晶紫和孔雀石绿均为有毒的三苯甲烷类化学物，是杀菌和杀寄生虫的化学制剂，可致癌。目前结晶紫和孔雀石绿的残留检测主要方法是采用气相色谱(GC)，气相质谱(GCMS)，液相色谱(HPLC)或液相质谱(LCMS)，以上方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场检测。免疫分析检测技术是近年来在环境及食品检测等领域开发出来的一种新型快速准确检测方法，现已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，也为结晶紫和孔雀石绿的检测提供了新的途径。
结晶紫和孔雀石绿分子本身没有可与载体蛋白结合的可供活化的功能基团，因此无法直接制备人工抗原，需先通过化学方法设计出其半抗原，再进一步与载体蛋白结合获得具有免疫性的完全抗原。由此产生了酶联免疫法这一检测手段。
在中国发明专利申请公布号为“CN103288661A”，公布日为2013年9月11日，名为《一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用》的文件中，公开了一种孔雀石绿半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时公开了所述孔雀石绿半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法和应用。此专利在制备半抗原化合物的过程中需要引入琥珀酸酐，合成的半抗原为酯类结构，此结构稳定性较差，容易发生水解，使抗原失活，不利于保存，无法满足生产需求；
在专利公告号为“CN101451999A”的专利文件中，半抗原的合成需用到醋酐，三氯化铝和溴素，其中醋酐为易制毒化学品，不易购得，而三氯化铝和溴素均为高活性化学品，环境污染严重，且对人体伤害较大。
在专利公告号为“CN101948531A”的专利文件中，以副品红为半抗原，但此结构存在三个氨基，在与蛋白偶联时会出现一个半抗原分子偶联一个，两个或三个蛋白分子的可能，同时也会出现蛋白分子上一个，两个或三个活性基团偶联一个半抗原分子的可能，使得合成的全抗原批间差较大，无法满足生产要求。
在专利公告号为“CN104569372A”的专利文件中，合成的半抗原需用到醋酸钯，此催化剂不仅价格昂贵，而且反应需要在无水无氧的条件下进行，催化剂在储存和反应过程中均易失活，在生产中存在极大风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用，以解决现有技术中制备的原料存在安全隐患，半抗原稳定性差，抗原批间差较大、成本造价高的问题，同时保证对孔雀石绿、结晶紫的高交叉反应率。
为达到上述目的，本发明提供技术如下：
一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原，所述可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原的结构通式如下：
其中n的取值范围为1-5中任意一个整数。
一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原的制作方法，包括如下步骤：
(a)：将4-甲胺基苯甲醛与通式(Ⅰ)所示化合物在无水乙醇和缚酸剂的条件下进行取代反应获得通式(Ⅱ)所示化合物，
通式(Ⅰ)为：
通式(Ⅱ)为：
(b)：将通式(Ⅱ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加入N，N—二甲基苯胺和氯化锌，进行缩合反应，获得通式(Ⅲ)所示化合物，
通式(Ⅲ)为：
(c)：将通式(Ⅲ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加强碱溶液至PH值为10-11，反应获得通式(Ⅳ)所示的半抗原，
通式(Ⅳ)为：
其中，通式(I)中n的取值范围为1-5中任意一个整数，通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)中的n取值与通式(Ⅰ)一致，通式(I)中R为Cl，Br或I中的任意一种。
一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原的制作方法，按下面比例和步骤制作：
(a)把4-甲胺基苯甲醛和通式(Ⅰ)所示化合物以摩尔比为1：1～1.5的量溶于无水乙醇中，加入K2CO3，K2CO3与4-甲胺基苯甲醛的摩尔比为0.5～1：1，然后80～90℃回流2～5h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，再用乙酸乙酯萃取，减压去溶剂，石油醚结晶，得到通式(Ⅱ)所示化合物，
(b)将通式(Ⅱ)所示化合物溶于无水乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺和氯化锌，上述两者的用量均为通式(Ⅱ)所示化合物摩尔量的2.5倍当量，80～90℃回流15～26h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)，得到通式(Ⅲ)所示化合物，
(c)将通式(Ⅲ)所示化合物溶于无水乙醇中，加入氢氧化锂溶液(6mol/L)至PH值为10-11，室温反应15～26h，加入纯化水，用1M的稀盐酸调PH值至4～5，加入乙酸乙酯萃取2次；合并有机相，减压去溶剂得产物通式(Ⅳ)所示的半抗原，
一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原，是将通式(Ⅳ)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物，其通式为：
其中n的取值范围为1-5中的任意一个整数。
一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原的制备方法，按以下比例进行操作：
(1)取半抗原，溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，半抗原、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为5：4：3，室温下搅拌4-8h，即可得到半抗原活化酯；
(2)称取载体蛋白，载体蛋白与半抗原的重量比为3：1，使其充分溶解在PBS(0.01mol/L)中，在搅拌下将半抗原活化酯反应液逐滴缓慢滴加至载蛋白溶液中，并在室温下搅拌16-24h；
(3)用PBS(0.01mol/L)室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
进一步地，常用载体蛋白可采用牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HAS)和血蓝蛋白(KLH)中的任意一种。
一种结晶紫和孔雀石绿单克隆抗体的制备方法，步骤如下：
第一步：以可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠；
每只鼠免疫剂量为50～100ug，免疫间隔3周，免疫3次；
第二步：采小鼠尾部静脉血检测血清效价，如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100ug免疫原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合；
第三步：融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养；
第四步：用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；
第五步：将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
一种酶联免疫检测试剂盒，包括酶标二抗、结晶紫和孔雀石绿单克隆抗体、结晶紫或孔雀石绿系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液、氧化剂浓缩液、结晶紫或孔雀石绿提取剂、样品净化剂、包被有包被原的酶标板。
由此可见，本发明的优点在于：生产过程安全简单、温度要求条件不严苛，产物性质稳定；成本低；鉴于半抗原、抗原及其相应的抗体结构，制成的酶联免疫检测试剂盒对孔雀石绿和结晶紫的灵敏度高，交叉反应率达95％以上。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
1半抗原的合成
根据下式反应原理：
实施例1：
(1)取4-甲胺基苯甲醛2.0g(14.8mmol)于50ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml无水乙醇，2-溴乙酸乙酯3.7g(22.2mmol)和碳酸钾2.0g(14.8mmol)。于80～90℃回流3h。反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，石油醚结晶得所需化合物a12.6g。
(2)将2.6g化合物a1溶于13ml乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺3.6g(29.4mmol)和氯化锌4.0g(29.4mmol)，80～90℃回流24h。反应完毕，减压去溶剂。加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化得所需化合物b12.3g(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)。
(3)将2.3g化合物b1溶于7ml无水乙醇中，加入氢氧化锂溶液(6mol/L)至PH值为10-11，室温反应18h。加入35ml纯化水，用1M的稀盐酸调PH值至4-5，加入乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，减压去溶剂得产物1.1g。
实施例1半抗原的合成路线如下所示：
实施例2
(1)取4-甲胺基苯甲醛2.0g(14.8mmol)于50ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml无水乙醇，4-溴丁酸乙酯4.3g(22.2mmol)和碳酸钾2.0g(14.8mmol)。于80～90℃回流3h。反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，石油醚结晶得所需化合物a22.9g。
(2)将2.9g化合物a2溶于13ml乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺3.5g(29.1mmol)和氯化锌4.0g(29.1mmol)，80～90℃回流24h。反应完毕，减压去溶剂。加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化得所需化合物b22.0g(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)。
(3)将2.0g化合物b2溶于7ml无水乙醇中，加入氢氧化锂溶液(6mol/L)至PH值为10-11，室温反应18h。加入35ml纯化水，用1M的稀盐酸调PH值至4-5，加入乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，减压去溶剂得产物1.2g。
实施例2半抗原的合成路线如下所示：
实施例3
(1)取4-甲胺基苯甲醛2.0g(14.8mmol)于50ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml无水乙醇，6-溴己酸乙酯5.0g(22.2mmol)和碳酸钾2.0g(14.8mmol)。于80～90℃回流3h。反应完毕，减压去溶剂，加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，石油醚结晶得所需化合物a32.7g。
(2)将2.7g化合物a3溶于13ml乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺2.9g(24.3mmol)和氯化锌3.3g(24.3mmol)，80～90℃回流24h。反应完毕，减压去溶剂。加入40ml纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化得所需化合物b32.6g(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)。
(3)将2.6g化合物b3溶于7ml无水乙醇中，加入氢氧化锂溶液(6mol/L)至PH值为10-11，室温反应18h。加入35ml纯化水，用1M的稀盐酸调PH值至4-5，加入乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，减压去溶剂得产物1g。
实施例3半抗原的合成路线如下所示：
同理，不同碳链的通式(Ⅰ)同上方案可得到不同碳链相对应的半抗原产物。
2抗原的合成
(1)取10mg半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入8mg EDC和6mg NHS，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
(2)称取载体蛋白30mg，使其充分溶解在4ml PBS(0.01mol/L)中，在搅拌下将半抗原活化酯反应液逐滴缓慢滴加至蛋白溶液中，并在室温下搅拌24h；
(3)用0.01mol/L PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HAS)和血蓝蛋白(KLH)等。
3单克隆抗体的制备：
以上述人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为50～100ug，免疫间隔3周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100ug全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
4人工抗原与单克隆抗体在ELISA中的应用与效果评价：
4.1酶标板的制备方法
用PH9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将人工抗原稀释至0.2μg/ml，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μL/孔加入含1％BSA，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
4.2抗体的配制
用含0.05％叠氮钠，PH7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.05μg/ml，4℃保存。
4.3标准溶液的配制
孔雀石绿标准溶液为精确称量孔雀石绿标准品10mg，先用乙腈1ml溶解，再用PH7.4的磷酸盐缓冲液配制系列浓度为0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8μg/kg的孔雀石绿标准溶液。
结晶紫标准溶液为精确称量结晶紫标准品10mg，先用乙腈1ml溶解，再用PH7.4的磷酸盐缓冲液配制系列浓度为0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8μg/kg的结晶紫标准溶液。
4.4评价结果
向包被有人工抗原的微孔酶标板中加入孔雀石绿或结晶紫标准溶液50μL/孔，再加入配制好的单克隆抗体溶液50μL/孔，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液300μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，分别加入50μL/孔的显色液A和显色液B，37℃反应15min；加入2M硫酸50μL/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。结果分别如表1和表2。
表1：ELISA测试不同浓度孔雀石绿标准品OD值
表2：ELISA测试不同浓度结晶紫标准品OD值
其中，B/B0是指不同浓度的标准品测试孔OD值与含量为0的标准品测试孔OD值的比值。从表1和表2中可看出，当结晶紫或孔雀石绿含量均为0.05ug/kg时，其B/B0值分别为79.14％，80.18％，81.58％和71.83％，75.25％，73.73％，说明其检测OD与含0ug/kg浓度的结晶紫或孔雀石绿测试孔OD值均有明显差异，故ELISA对结晶紫和孔雀石绿检测灵敏度均可达0.05ug/kg。
本发明的优点在于：在小分子药物合成前期引入活性手臂，保留结晶紫和孔雀石绿的结构特征，对其电子云密度无影响，且更突出空间结构，具有不同碳链长度以及适合与大分子载体偶联的活性手臂，反应条件温和，操作步骤简单，产物性质稳定；制备的人工抗原可与抗体特异性结合，可达95％以上的交叉反应率，具有高灵敏度、高精确性等特点，能快速检测水产品中残留的结晶紫和孔雀石绿。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构通式如下：
其中n是1或3或5。
2.一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原的制作方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(a)：将4-甲胺基苯甲醛与通式(Ⅰ)所示化合物在无水乙醇和缚酸剂的条件下进行取代反应获得通式(Ⅱ)所示化合物，
通式(Ⅰ)为：
通式(Ⅱ)为：
(b)：将通式(Ⅱ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加入N，N—二甲基苯胺和氯化锌，进行缩合反应，获得通式(Ⅲ)所示化合物，
通式(Ⅲ)为：
(c)：将通式(Ⅲ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加强碱溶液至pH 值为10-11，反应获得通式(Ⅳ)所示的半抗原，
通式(Ⅳ)为：
其中，通式(I)中n是1或3或5，通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)中的n取值与通式(Ⅰ)一致，通式(I)中R为Cl，Br或I中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原的制作方法，其特征在于：
按下面比例和步骤制作：
(a)把4-甲胺基苯甲醛和通式(Ⅰ)所示化合物以摩尔比为1：1～1.5的量溶于无水乙醇中，加入K2CO3，K2CO3与4-甲胺基苯甲醛的摩尔比为0.5～1：1，然后80～90℃回流2～5h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，再用乙酸乙酯萃取，减压去溶剂，石油醚结晶，得到通式(Ⅱ)所示化合物，
(b)将通式(Ⅱ)所示化合物溶于无水乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺和氯化锌，上述两者的用量均为通式(Ⅱ)所示化合物摩尔量的2.5倍当量，80～90℃回流15～26h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化，得到通式(Ⅲ)所示化合物，
(c)将通式(Ⅲ)所示化合物溶于无水乙醇中，加入6mol/L的氢氧化锂溶液至pH 值为10-11，室温反应15～26h，加入纯化水，用1M的稀盐酸调pH 值至4～5，加入乙酸乙酯萃取2次；合并有机相，减压去溶剂得产物通式(Ⅳ)所示的半抗原，
4.一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原，其特征在于，是将权利要求1所示通式(Ⅳ)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物，其通式为：
其中n是1或3或5。
5.一种如权利要求4所述的可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原的制备方法，其特征在于：
按以下比例进行操作：
(1)取权利要求1通式(Ⅳ)所示的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺中，搅拌充分后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，半抗原、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为5：4：3，室温下搅拌4-8h，即可得到半抗原活化酯；通式(Ⅳ)为：
其中n是1或3或5；
(2)称取载体蛋白，载体蛋白与半抗原的重量比为3：1，使其充分溶解在0.01mol/L的PBS中，在搅拌下将半抗原活化酯反应液逐滴缓慢滴加至载蛋白溶液中，并在室温下搅拌16-24h；
(3)用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
6.根据权利要求5所述一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原的制备方法，其特征在于：
常用载体蛋白可采用牛血清白蛋白，卵清蛋白，人血清白蛋白和血蓝蛋白中的任意一种。
7.一种结晶紫和孔雀石绿单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
第一步：以可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠；所述人工抗原为权利要求4所示的通式(Ⅴ)，其通式为：
其中n是1或3或5；
每只鼠免疫剂量为50～100ug，免疫间隔3周，免疫3次；
第二步：采小鼠尾部静脉血检测血清效价，如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100ug免疫原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合；
第三步：融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养；
第四步：用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；
第五步：将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
8.一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括酶标二抗、权利要求7制备的结晶紫和孔雀石绿单克隆抗体、结晶紫或孔雀石绿系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液、氧化剂浓缩液、结晶紫或孔雀石绿提取剂、样品净化剂、包被有包被原的酶标板。
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