CN105497034B - 一种通过靶向prmt5抑制骨肉瘤生长的组合物及其制备方法 - Google Patents

一种通过靶向prmt5抑制骨肉瘤生长的组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，包括PRMT5抑制剂和Hsp90抑制剂：所述PRMT5抑制剂为EPZ015666；所述Hsp90抑制剂为17‑AAG；按浓度比计算，EPZ015666：17‑AAG为0.5～2:1；所述组合物的制备方法，包括以下步骤：1)将EPZ015666溶解到溶剂中，形成EPZ015666储备液；2)将17‑AAG溶解到溶剂中，形成17‑AAG储备液；3)将EPZ015666储备液和17‑AAG储备液混合，形成组合物；本发明所述的组合物通过PRMT5的抑制剂结合Hsp90的抑制剂协同抑制骨肉瘤细胞的生长。

Description

一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及骨肉瘤抑制研究及技术领域，具体涉及一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物及其制备方法。
背景技术
骨肉瘤是骨骼***主要的恶性肿瘤之一，以浸润性生长破坏周围正常组织，以早期即发生远处转移为特点，其临床预后差，给社会及家庭造成沉重的经济和精神负担。目前临床上主要采用手术切除联合新辅助化疗方法进行综合治疗，使得骨肉瘤患者的5年生存率从20％提高到了65-70％。然而，在过去的30年，骨肉瘤的复发率及转移性骨肉瘤的生存率并没有明显改变，尤其是对于那些初诊时就已经发现转移的患者，5年的生存率仍然只有约20％。另外，临床高剂量化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂等使用具有较大的副作用[1、2]。这些现象皆表示现阶段骨肉瘤的治疗已遇到瓶颈，传统意义上对骨肉瘤发病机制的探究也面临着一定的挑战。
专利CN200610088827.8中公开了白血病患者骨髓细胞中PRMT5蛋白质精氨酸甲基转移酶5的表达水平显著高于正常骨髓细胞，因此可以将PRMT5作为白血病标志物，还提供了抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA，通过小干扰RNA沉默PRMT5基因，可以抑制PRMT5基因缺失细胞的增殖，表明PRMT5基因可以作为治疗白血病及肿瘤的药物靶标。PRMT5即蛋白质精氨酸甲基转移酶5，属于II型PRMTs，它是II型中最早被鉴定的成员，位于人类染色体14q11.2。最近的研究也表明，PRMT5在许多人类实体瘤如肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤及恶性胶质瘤中呈高表达，且其高表达水平直接与肿瘤的进程及预后差密切相关。然而，与以上肿瘤相比，骨肉瘤的发病率明显较低，且存在临床组织样品收集困难等问题，使得PRMT5是否参与骨肉瘤的发病过程目前尚未有研究报道。在骨肉瘤细胞系U2OS中，PRMT5被发现与SNAIL及AJUBA蛋白相互作用，进而影响其细胞定位[3]；然后PRMT5在骨肉瘤组织中的表达情况及其对骨肉瘤细胞生长的影响仍不清楚。近年来，表观遗传调控酶在肿瘤发生发展中的作用已受到广泛关注，结合我们前期对PRMT5蛋白的研究，探讨以PRMT5作为骨肉瘤的临床预后生物标志物甚至靶向治疗具有重要意义。
Hsp90(热休克蛋白90)是真核细胞中最丰富、最活跃的伴侣蛋白之一，通过保证蛋白质的正确折叠以及防止蛋白的非特异性聚集，对维持细胞的正常活性至关重要。Hsp90的靶蛋白中，超过50个靶蛋白广泛参与细胞增殖、分化和凋亡[4]，与肿瘤发生密切相关。Hsp90的抑制剂17-AAG(17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素)是一种苯醌安莎霉素类抗生素的衍生物，通过结合改变Hsp90的分子伴侣功能，从而促进众多肿瘤细胞增殖和存活相关的蛋白发生泛素化降解，具有显著的抗肿瘤活性，对正常细胞的毒性很小，在抗骨肉瘤的治疗已经进临床试验阶段[5、6、7]。17-AAG抑制骨肉瘤细胞生长的IC40是0.4μM(药物处理48小时)[6]，I期临床结果提示17-AAG的最大药物耐受剂量是270mg/m2，增加药物浓度增加了一些副作用的出现，如肝脏天冬氨酸转氨酶升高等，提示该药与其他合适的药物联合使用可能会一方面增加疗效，一方面减少17-AAG的药物用量，减少副作用[5]。
参考文献：
[1]L.Mirabello,R.J.Troisi,S.A.Savage.Osteosarcoma incidence andsurvival rates from 1973to 2004:data from the Surveillance,Epidemiology,andEnd Results Program.Cancer,2009,115(7):1531-43.
[2]K.R.Duchman,Y.Gao,B.J.Miller.Prognostic factors for survival inpatients wit h high-grade osteosarcoma using the Surveillance,Epidemiology,and End Results(SEER)Program database.Cancer epidemiology,2015,39(4):593-599.
[3]Hou Z,etc.The LIM protein AJUBA recruits protein argininemethyltransferase 5to mediate SNAIL-dependent transcriptionalrepression.Molecular&Cellular Biology,2008,28(10):3198-3207.
[4]Luke,Whitesell,Susan L,Lindquist.HSP90and the chaperoning ofcancer.Natur e reviews.Cancer,2005,5(10):761-72.
[5]Bagatell R,etc.Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic studyof 17-N-ally lamino-17-demethoxygeldanamycin in pediatric patients withrecurrent or refractory solid tu mors:a pediatric oncology experimentaltherapeutics investigators consortium study.Clin C ancer Res.,2007,13(6):1783-8.
[6]Gazitt Y,etc.Targeted therapy of human osteosarcoma with 17AAG orrapamycin:characterization of induced apoptosis and inhibition of mTOR andAkt/MAPK/Wnt pathw ays.Int J Oncol.,2009,34(2):551-61.
[7]苟永胜.热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素增强热诱导骨肉瘤细胞杀伤的研究.第四军医大学,2008.
发明内容
针对现有技术的不足，我们首次发现，表观遗传酶PRMT5在骨肉瘤组织及细胞的表达水平特异升高，通过细胞实验证实PRMT5和Hsp90在分子水平上协同发挥作用，通过泛素化降解PRMT5来实现靶向PRMT5抑制骨肉瘤Saos-2细胞的生长，并结合Hsp90的抑制剂共同发挥抑制骨肉瘤细胞生长的作用，因此提出一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物及其制备方法；该组合物通过PRMT5的抑制剂EPZ015666结合Hsp90的抑制剂17-AAG协同抑制骨肉瘤细胞的生长，同时在分子水平揭示这两种抑制剂协同作用的机理，为骨肉瘤的防治提供新思路。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，包括PRMT5抑制剂和Hsp90抑制剂：
所述PRMT5抑制剂为EPZ015666；所述Hsp90抑制剂为17-AAG。
作为本发明的一种优选的方案：所述EPZ015666的结构式为：
所述EPZ015666的分子量为383.44；
所述EPZ015666采用美国Selleck品牌，产品货号：S7748的产品,产品规格：5mg，-20℃低温保存。
作为本发明的一种优选的方案：所述17-AAG的结构式为：
所述17-AAG的分子量为585.69；
所述Hsp90采用美国Selleck品牌，产品货号：S1141的产品,产品规格：25mg，-20℃低温保存。
作为本发明的一种优选的方案：按摩尔比计算，EPZ015666：17-AAG为0.5～2:1；优选地，EPZ015666：17-AAG为2:1。
一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将EPZ015666溶解到溶剂中，得到EPZ015666储备液；
2)将17-AAG溶解到溶剂中，得到17-AAG储备液；
3)将步骤1)得到的EPZ015666储备液和步骤2)得到的17-AAG储备液混合，得到通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物。
优选地，所述溶剂为DMSO。
优选地，步骤1)中，所述1mLEPZ015666储备液中含EPZ015666的质量为1.7～4mg。
优选地，步骤2)中，所述1mL17-AAG储备液中含17-AAG的质量为2.7～6mg。
优选地，得到的通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物中，EPZ015666与17-AAG的摩尔比为0.5～2:1；优选地，应用前，将组合物用溶剂稀释至17-AAG的工作浓度为10nM～50nM。
优选地，该组合物可以以溶液的形式使用，也可以将溶剂挥发后制作成为粉末、以及纳米缓释组合物添加剂添加到相应的载体上。本发明的有益效果在于：
1、本发明所述的组合物通过PRMT5的抑制剂结合Hsp90的抑制剂协同抑制骨肉瘤细胞的生长，同时在分子水平揭示这两种抑制剂协同作用的机理。
2、本发明所述的组合物可以以溶液的形式使用，也可以将溶剂挥发后制作成为粉末、以及纳米缓释组合物添加剂添加到相应的载体上。
3、本发明将17-AAG的工作浓度从现有技术的uM等级减少数量级至nM等级，有效地减少药物的副作用，并通过协同EPZ015666达到更高的骨肉瘤细胞抑制水平。
4、本发明通过细胞实验证实PRMT5和Hsp90在分子水平上协同发挥作用，通过泛素化降解PRMT5来实现靶向PRMT5抑制骨肉瘤Saos-2细胞的生长，所以本发明使用EPZ015666通过协同作用进一步增强17-AAG的临床疗效，为骨肉瘤的防治提供新思路。
说明书附图：
图1为实施例1中PRMT5在肉瘤中的表达情况图(100X)。
图2为实施例2中试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况曲线图。
图3为实施例3中试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况曲线图。
图4为实施例4中敲低PRMT5联合抑制Hsp90的活性对骨肉瘤细胞生长的影响情况。
图5、6为实施例5中co-IP检测电泳图。
图7为实施例6中基于CHIP的突变体设计。
图8为实施例6中co-IP检测电泳图。
图9为实施例6中PRMT5的突变体设计。
图10为实施例6中BiFC技术鉴定情况图示。
图11-14为实施例7中WB检测结果图。
图15为实施例8-10中本发明抑制骨肉瘤生长的OD图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
具体实施例：
实施例1-4为说明PRMT5和Hsp90在骨肉瘤细胞中的活性。
实施例1
本实施例说明PRMT5在骨肉瘤中高表达的情况：
组织免疫组化步骤如下：
1)将组织切片放入烘箱中，在温度为63℃，时间为1h的条件下进行烘烤；
2)然后放入全自动染色机中进行脱蜡，脱蜡过程包括：二甲苯两缸，每缸15min；无水乙醇两缸，每缸7min；90％酒精1缸，5min；80％酒精1缸，5min；70％酒精1缸，5min；
3)从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，每次1min；冲洗完毕后采用柠檬酸高压修复法修复5min；之后使抗原修复后的片子自然冷却30min；
4)将片子放入内源性过氧化物酶阻断剂中，15min后取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，每次1min；
5)取一抗PRMT5，按照稀释度1：400用DAKO的抗体稀释液稀释后加入；室温孵育30min；加入二抗并孵育30min；用PBS冲洗3次，每次1min；
6)DAB试剂盒显色5min，苏木素复染40s，在0.25％的盐酸酒精(400mL70％酒精+1mL浓盐酸)中浸没2s，用自来水冲洗2min；
7)将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。
结果如图1所示，PRMT5在正常软骨(Normal cartilage)中几乎不见表达，在肉瘤组织如尤文肉瘤(Ewing cartilage)、软骨肉瘤(Chondrosarcoma)中呈低表达，在骨肉瘤如成纤维肉瘤骨肉瘤(Fibrosarcoma osteosarcoma)、成软骨骨肉瘤(Chondroblasticosteosarcoma)中呈高表达。恶性黑色素瘤(Malignant melanoma)为阳性对照，用于优化PRMT5抗体的稀释度。
实施例2
本实施例说明抑制PRMT5的活性、抑制Hsp90的活性、以及联合抑制PRMT5和Hsp90的活性对骨肉瘤细胞活性的影响：
步骤如下：
1)实验分为对照组(不使用任何试剂处理)、使用20nM的EPZ015666单独处理组、使用10nM的17-AAG单独处理组和20nM的EPZ015666联合10nM的17-AAG处理组；
2)四组实验中，均处理骨肉瘤Saos-2细胞48h，然后分别利用CCK-8法检测试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况。
结果如图2所示：EPZ015666单独处理能有效地降低骨肉瘤Saos-2细胞的活性，17-AAG单独处理也可以有效地降低骨肉瘤Saos-2细胞的活性，当两种试剂联合处理时，细胞活性出现更加明显的降低，说明两种试剂联合使用可以协同使骨肉瘤细胞活性大幅度降低。
实施例3
本实施例加大试剂的工作浓度以研究对骨肉瘤细胞活性的影响：
本实施例分为对照组(不使用任何试剂处理)、使用50nM的EPZ015666单独处理组、使用25nM的17-AAG单独处理组和50nM的EPZ015666联合25nM的17-AAG处理组；其余步骤与参数与实施例2相同。
结果如图3所示：对骨肉瘤Saos-2细胞的活性影响趋势同实施例2。
实施例4
本实施例说明敲低PRMT5的表达、敲低PRMT5联合抑制Hsp90的活性对骨肉瘤细胞活性的影响：
1)实验分为对照组、100nM的17-AAG单独处理组(24h)、siRNA转染Saos-2细胞敲低PRMT5的表达组(48h)、敲低PRMT5联合100nM的17-AAG处理组(24h)；
2)四组实验中，分别利用CCK-8法检测试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况。
实验结果来自三次独立的重复实验。结果如图4所示：敲低PRMT5能有效抑制骨肉瘤Saos-2细胞的生长，17-AAG单独处理也能有效抑制骨肉瘤Saos-2细胞的生长，敲低PRMT5联合17-AAG处理，细胞活性出现更加明显的降低，说明两种试剂联合使用可以协同使骨肉瘤细胞活性大幅度降低。
实施例5-7为公开靶向PRMT5联合17-AAG协同抑制细胞生长的分子机制。
实施例5
本实施例说明PRMT与Hsp90复合物中CHIP中的泛素化连接酶E3相互作用：
1)利用co-IP技术证明细胞外源转染的PRMT与CHIP蛋白存在相互作用。步骤如下：
a)选择转染效率较高的HEK293T细胞进行实验，将Myc-PRMT5质粒分别与FLAG-Vector及FLAG-CHIP质粒共转染到HEK293T细胞48h，同时使用MG132蛋白酶抑制剂处理细胞6h阻止发生泛素化的蛋白质降解。
b)全细胞裂解液使用FLAG的抗体进行IP，然后使用FLAG和Myc的抗体进行WB检测。
结果如图5所示：外源表达的FLAG-CHIP与Myc-PRMT5相互作用，结合在一起。
2)PRMT5与CHIP的相互作用以及17-AAG对二者相互作用的影响，步骤如下：
a)GST pulldown技术检测GST-CHIP与Myc-PRMT5的相互作用：GST和GST-CHIP融合蛋白在Ecoli.中进行体外表达，然后与转染了Myc-PRMT5的HEK293T细胞裂解液一起进行孵育，将GST和GST-CHIP结合的复合物进行WB检测，检测结果如图6A所示。
b)利用co-IP技术检测17-AAG对内源性PRMT5与CHIP的相互作用的影响：HEK293T细胞进行100nM的17-AAG处理24h，以及MG132处理6h，然后进行co-IP检测，检测结果如图6B所示。
如图6A所示，利用GST-pulldown技术可以证明体外表达的GST-CHIP可以下拉到PRMT5。如图6B所示，当使用17-AAG预处理抑制Hsp90的活性以后，CHIP与PRMT5的结合明显增加。CHIP与PRMT5的结合增加将促进泛素化连接酶E3对PRMT5的泛素化降解。
实施例6
本实施例说明CHIP与PRMT5相互作用的结构域确定。
1)为了鉴定哪些结构域对PRMT5/CHIP的相互作用起关键作用，我们构建了基于CHIP的一系列突变体：点突变体K30A和H260Q、删减突变体TRP和U-box，如图7所示。
HEK293T细胞共转染FLAG标签的CHIP片段或突变体以及Myc-PRMT5质粒48h，MG132处理6h，全细胞裂解液进行co-IP实验，结果如图8所示。
与全长FLAG-CHIP和Myc-PRMT5的相互作用相似，H260Q及TPR突变体Co-IP到更多的Myc-PRMT5，提示与PRMT5的相互作用略微增加。然而，另外两个突变体K30A及U-box几乎完全阻断了与PRMT5的相互作用，提示TPR结构域对于CHIP与PRMT5的相互作用很关键，且CHIP与PRMT5的相互作用依赖分子伴侣的存在。
2)为了鉴定PRMT5中能与CHIP相互作用的结构域，基于PRMT5的晶体结构，以全长Myc-PRMT5为模板，我们构建了PRMT5的另外两个删减突变体N-端突变体1-292及C-端突变体229-637如图9所示。
因为PRMT5具有发生聚集体的倾向，因而，我们采用BiFC技术来鉴定PRMT5中能与CHIP相互作用的结构域，该方法具有以下优点：一方面BiFC能更直观地观察PRMT5及其突变体与CHIP在活细胞内的实时相互作用；另一方面BiFC技术使得我们能更好地可视化研究CHIP对PRMT5及不同突变体的聚集体的影响。
COS-1细胞共转染如图9所示的PRMT5或其突变体质粒24h，Signal/Noise(S/N)Ratio越高表示二者的相互作用越强，结果如图10所示。
PRMT5的N-端结构域是PRMT5与CHIP相互作用的关键结构域，因为与全长PRMT5相比，N-端1-292结构域观察到更多的荧光。相反，在C-端突变体229-637组观察到非常低的signal/noise比率，刚好能作为我们BiFC技术的阴性对照。以上结果证明CHIP的TPR结构域与PRMT5的N-端对于CHIP/PRMT5的相互作用是必需的。
实施例7
本实施例说明CHIP/chaperone***介导PRMT5的降解。
1)1nM～100nM的17-AAG对HEK293T细胞进行处理24h，然后裂解，进行WB，结果如图11所示。
依据以上实施例，我们推测17-AAG可以通过CHIP连接酶E3的活性下调PRMT5的表达，促进PRMT5的泛素化降解。我们发现17-AAG剂量依赖地降低HEK239T细胞中PRMT5的表达。
2)
a)HEK293T细胞转染FLAG-Vector或FLAG-CHIP(CHIP)表达48h，并进行17-AAG处理24h，裂解细胞进行WB，结果如图12A所示：17-AAG处理可以进一步促进CHIP介导的PRMT5表达下调。
b)HEK293T细胞转染siRNA Control(siCon)或siRNAs CHIP(siCHIP)，表达60h，并进行17-AAG处理24h，裂解细胞进行WB，结果图12B所示，进一步的结果表明，敲低CHIP可以抑制17-AAG诱导的PRMT5下调，证明在细胞水平上PRMT5的表达可以被CHIP/chaperone***调控，17-AAG诱导的PRMT5表达水平的下调与CHIP的协同作用有关。
3)接下来，我们推测CHIP可能介导了PRMT5的多聚泛素化修饰进而降解PRMT5。
为了证明CHIP可以泛素化PRMT5，首先将Myc-PRMT5与FLAG-CHIP及HA-Ubiquitin一起转染到HEK239T细胞而进行体内的泛素化检测，结果如图13所示：显示过表达CHIP可以增加PRMT5的泛素化。当共转染Myc-PRMT5与K30A及H260Q突变体时，K30A及H260Q突变体明显地降低PRMT5的泛素化，提示CHIP与分子伴侣的结合活性及完整的U-box结构域对于CHIP诱导的PRMT5多聚泛素化很重要。另外，H260Q也可作为显性负性突变体来竞争内源性的CHIP，因为在H260Q过表达组中，PRMT5的泛素化又进一步降低。
4)17-AAG对敲低CHIP及其突变体诱导的PRMT5泛素化的影响。
HEK293T细胞共转染siCon、siCHIP、Myc-PRMT5、HA-ubiquitin或siRNA的质粒，表达60h，并且17-AAG处理12h，然后细胞裂解液进行IP和相应的WB检测，检测结果如图14所示：相反，敲低CHIP可以降低17-AAG诱导的PRMT5的多聚泛素化，提示CHIP参与了17-AAG诱导的PRMT5泛素化调节。
实施例8-10为说明通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法。
实施例8
一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将5mgEPZ015666溶解到1.3040mL的DMSO中，形成10mM的EPZ015666储备液；
2)将10mg17-AAG溶解到1.7074mL的DMSO中，形成10mM的17-AAG储备液；
3)将0.2mL的EPZ015666储备液和0.1mL的17-AAG储备液混合后，用DMSO稀释至EPZ015666的工作浓度为20nM，17-AAG的工作浓度为10nM，形成通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物。
4)将得到的组合物处理骨肉瘤Saos-2细胞48h，CCK-8方法检测细胞活性。
实施例9
本实施例的特点在于步骤3)中，将0.2mL的EPZ015666储备液和0.2mL的17-AAG储备液混合后，用DMSO稀释至EPZ015666的工作浓度为20nM，17-AAG的工作浓度为20nM，形成通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物。其余步骤和参数与实施例8相同。
实施例10
本实施例的特点在于步骤3)中，将0.2mL的EPZ015666储备液和0.4mL的17-AAG储备液混合后，用DMSO稀释至EPZ015666的工作浓度为20nM，17-AAG的工作浓度为40nM，形成通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物。其余步骤和参数与实施例8相同。
实施例8-10的结果如图15所示，三个联合组均能有效抑制骨肉瘤细胞生长，从OD值看出，EPZ015666联合17-AAG可以达到骨肉瘤细胞生长抑制率50％以上。而单独0.4μM的17-AAG处理使Saos-2细胞的活力下降16.5％，所以本发明使用EPZ015666联合17-AAG其效果是单独0.4μM的17-AAG处理2倍以上，考虑到17-AAG带来的副作用，采用17-AAG的工作浓度为10nM时组合物的工作浓度最低且效果最好。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1. 一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于包括 PRMT5 抑制剂和Hsp90抑制剂;
所述 PRMT5 抑制剂为EPZ015666；所述Hsp90抑制剂为17-AAG；
按摩尔比计算，EPZ015666：17-AAG为0.5~2:1，17-AAG工作浓度的数量级为nM等级。
2.如权利要求1所述的通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于：按摩尔比计算，EPZ015666：17-AAG为2:1。
3.一种如权利要求1所述的通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将EPZ015666溶解到溶剂中，得到EPZ015666储备液；
2）将17-AAG溶解到溶剂中，得到17-AAG储备液；
3）将步骤1）得到的EPZ015666储备液和步骤2）得到的17-AAG储备液混合，得到通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物。
4.如权利要求3所述的通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在于：所述溶剂为DMSO。
5.如权利要求3所述的通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在于：步骤1）中，1mLEPZ015666储备液中含EPZ015666的质量为1.7~4mg。
6.如权利要求3所述的通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在于：步骤2）中，1mL17-AAG储备液中含17-AAG的质量为2.7~6mg。
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