CN105483232A - 一种立克次体液相基因芯片的检测方法 - Google Patents

一种立克次体液相基因芯片的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105483232A
CN105483232A CN201510982767.3A CN201510982767A CN105483232A CN 105483232 A CN105483232 A CN 105483232A CN 201510982767 A CN201510982767 A CN 201510982767A CN 105483232 A CN105483232 A CN 105483232A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microballoon
hybridization
detection
minutes
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510982767.3A
Other languages
English (en)
Inventor
赵锋
刘杨
倪蓉
王俊贤
田绿波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Original Assignee
Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center filed Critical Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Priority to CN201510982767.3A priority Critical patent/CN105483232A/zh
Publication of CN105483232A publication Critical patent/CN105483232A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种立克次体液相基因芯片的检测方法，涉及基因芯片检测领域,是一种快速、准确、高通量的病原检测技术。采用多重PCR结合液相芯片技术，通过液相芯片技术对多重PCR扩增的产物进行检测，克服了多重PCR产物电泳检测不能区分分子量相近片段的缺点，极大地提高了引物设计自由度，使同一反应管中进行数对甚至数十对引物的PCR反应成为可能。液相芯片技术检测过程采用生物素-亲和素放大***连接荧光报告分子，且芯片荧光检测器对反应信号进行了放大，检测灵敏度得到极大提高，该技术可在我国疾控、卫生检疫等部门推广应用，从而提供一种快速、准确、高效的检测手段，为保障人民健康，应对突发公共卫生事件，保护公共安全等方面发挥重要作用。

Description

一种立克次体液相基因芯片的检测方法
技术领域
本发明涉及基因芯片检测领域，更具体的说是涉及一种立克次体液相基因芯片的检测方法。
背景技术
液相芯片（liquidarray,liquidchip）也称为悬浮芯片(suspensionarray)，全名为多功能多指标同步分析体系（FlexibleMultipleAnalyTE缓冲液Profiling,xMap），该技术利用具有唯一编码特征的微球作为反应单元，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定，检测、筛选和分离均在同一个微球上快速完成。它有机整合了激光技术、微流体技术、快速信号处理和数据分析***，既具有一般片基生物芯片高通量检测的特点，又具有重复性好、灵敏度高、准确性好、易于标准化、同时定性定量分析等独特优点，目前已经广泛应用于病原体检测、细胞因子检测等方面。
液相芯片利用微球在溶液中反应，克服了固相芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等动力学的影响，大大增强了敏感性，提高了反应效率；同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，使其既具有以往固相芯片高通量的特性，又具有优于固相芯片的操作简便、重复性好、灵敏度高和定量检测等特点。多重PCR在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段，可同时检测多种病原微生物，具有高效、快速等优点。多重PCR要求在同一个反应体系中进行多个位点的特异性扩增，目前一般通过琼脂糖凝胶电泳的方式将目的片段分离。因此，多重PCR也有许多不可避免的缺点，如不同引物间交叉干扰，不同引物间退火温度不能相差太大，扩增的片段长度不能太接近等，对引物的设计提出了较高的要求。
液相芯片的检测灵敏度主要取决于多重PCR扩增效率和杂交效率。通过调整PCR反应体系和反应条件，可使扩增效率达到一个较优的水平。特异性片段选择是多重PCR扩增效率以及扩增特异性的关键。杂交效率则与扩增产物的长度、探针的序列长度、探针的GC含量等因素有关。在液相反应中，虽杂交条件是相同的，但扩增产物长度、探针长度、GC含量不同，导致各个杂交反应的动力学不同，因此各个探针的检测灵敏度也有差异。通过调节杂交温度、时间等因素虽然可使完全互补配对杂交尽可能达到最大程度，从而使所有探针都达到一个较高的分辨率，但对所对应的多种靶序列来说，很难保证几种杂交反应都具有足够的严谨度和灵敏度。
发明内容
本发明提供一种立克次体液相基因芯片的检测方法，选用的多重PCR引物扩增，片段均小于100bp，完成按照实时荧光PCR的引物设计策略设计的引物，这样能使目标基因的扩增效率大大提高，从而增加了方法的敏感性。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种立克次体液相基因芯片的检测方法，包括如下步骤：
（1）PCR反应：①设计引物，分别选择Q热立克次体特有的转座酶htpAB基因相关重复序列、普氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因和莫氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因设计引物，通过引物设计软件分析各引物退火温度值以及各引物间二聚体的形成；②PCR体系及反应条件，PCR体系（50μL）包括PCR预混液25μL，上下游引物（10μM）各1.0μL，DNA3μL，去离子水补足50μL；反应条件：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环,最后72℃延伸5分钟；
（2）制备、杂交和检测微球，每条探针的5’端连上20个多聚碱基T作为连接端，并氨基化修饰；
①联结探针与羧化微球，其步骤如下：
A、将已分装好的碳化二亚胺粉末从-20℃取出，回温至室温；
B、将氨基化修饰的寡核苷酸探针重悬于蒸馏水中使其终浓度为1mmol/L；
C、将1mL包装中的小球振荡30秒，超声30秒，至小球分散；
D、取100μL小球至1.5mL离心管，14000g4分钟，小心吸出上清；
E、微球重悬于50μLpH4.5、0.1mol/L的2-(N-***啉)乙磺酸溶液中，振荡20秒，超声20秒；
F、用蒸馏水将1mmol/L的寡核苷酸探针10倍稀释；
G、将2μL10倍稀释的探针加于小球悬浮液中，振荡混匀；
H、配制10mg/mL碳化二亚胺溶液；
I、每个1.5ml离心管中加入2.5μL新鲜配制的碳化二亚胺溶液，振荡混匀；
J、置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；
K、每管中加入2.5μL新鲜配制的碳化二亚胺溶液，振荡混匀；
L、再次置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；
M、反应结束后，14000g离心4分钟，小心吸弃上清；
N、各管中加入1mL0.02%吐温20洗涤1次，吐温20是一种非离子型表面活性剂，有助于大分子溶解；
O、离心14000g4分钟，小心吸弃上清；
P、各管中加入1mL0.1%的十二烷基硫酸钠溶液，洗涤1次，同上离心吸弃上清；
Q、各管中加入100μLpH8.0的TE缓冲液，振荡10s，超声10s，使微球重悬；
R、微球的计数：用血球计数板计数；
S、联结好探针的微球悬于pH8.0的TE缓冲液中，4℃保存备用；
②联结微球的质控，其步骤如下：
A、合成与探针互补的寡核苷酸链,寡核苷酸链5’端生物素标记；
B、用涡流振荡器充分振荡已经联结好的编码微球；
C、吸取适量微球，用2×氯化四甲铵杂交液稀释至3500个/25μL，置于0.2μL离心管中；
D、稀释与探针互补的寡核苷酸链至0.1μmol/L；
E、各管中加入10μL上述寡核苷酸溶液以及15μLTE缓冲液溶液使其终体积为50μL，吹打混匀；
F、95℃变性10分钟；
G、55℃杂交15分钟；
H、转移至滤板抽滤去掉未结合的核苷酸链；
I、各孔加75μl4ng/μL链亲和素-藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素-藻红蛋白；
J、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬；
K、反应结束后使用液相悬浮芯片仪检测；
L、同时设置不加寡核苷酸链而只加TE缓冲液的阴性对照，同上进行检测；
结果判定：联结的微球的MFI值大于5000，说明包被成功；
③杂交与检测，其步骤如下：
A、取联结好探针的微球各3500个混于25μL2×氯化四甲铵杂交液杂交液中，置于0.2μL离心管中；
B、各管中加10μL混合模板的PCR产物和15μLTE缓冲液溶液，使其终体积为50μL，吹打混匀；
C、95℃变性10分钟；
D、杂交温度下杂交一定时间；
E、转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物；
F、各孔加75μL4ng/μL链亲和素-藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素-藻红蛋白；
G、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬，结束后使用液相悬浮芯片仪检测；
H、按操作说明，先冲洗管道，再预热激光检测器30分钟，待机备用；
I、根据微球编号和待检因子，编写检测用的控件；
J、根据样本的数量，建立操作流程；
K、然后将96孔板放入检测仓检测；
检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测作为检测本底，对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的平均荧光强度值，即为MFI值，亦即读取的这种编号的微球群的每个微球信号强度的统计平均值，通过液相悬浮芯片仪悬浮芯片***读取各孔MFI值以及本底荧光值，本底荧光值即为BFI值，结合液相悬浮芯片仪分析处理数据；当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时，即判为阳性；
（3）建立多重引物液相基因芯片检测体系：混合分别联结有3种特异性探针的3种微球组成多重检测***；
（4）检测PCR产物：在多重检测体系中每孔加入25μL含有微球各3500个的2×氯化四甲铵杂交液杂交液、10μLPCR产物和15μLTE缓冲液溶液；
（5）对制备、杂交和检测微球中的杂交条件进行优化：
优化杂交温度，杂交温度分别选择47℃、51℃、55℃、59℃、63℃5个温度进行，以混合模板的PCR产物为被检测物，以MFI值与BFI值之比进行结果判断；
优化杂交时间，确定杂交温度后，以混合模板的PCR产物为被检测物，杂交时间分别取10分钟、15分钟、20分钟、25分钟，比较不同杂交时间对信号强度的影响，
（6）液相基因芯片的方法学验证：①特异性验证，选用多种菌株，考核多重悬浮芯片方法对样品检测的特异性；②灵敏度验证，不同浓度的质粒分别按照优化后的PCR体系进行扩增，然后用包被对应探针的微球进行检测，液相悬浮芯片仪***自带软件进行分析得出剂量反应曲线；BFI值为阴性对照检测时的信号，最低检测限从拟合曲线上推定，即分析物的MFI值相当于BFI值三倍所对应的检测物浓度；③重复性验证，以质粒为模板，PCR扩增后，使用同一批包被探针的微球，对同一批PCR产物进行重复性检测；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取DNA进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）设计了Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体特异性检测引物和探针；
（2）建立了Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体的液相基因芯片检测方法，并用质粒体系、模拟样本和已知其他病原体验证了方法的灵敏度、特异性和重复性。
附图说明
图1为Q热立克次体和普氏立克次体特异性验证结果电泳图；
图2为莫氏立克次体特异性验证结果电泳图；
图3为多重PCR体系的验证结果；
图4为退火温度优化结果电泳图；
图5为引物对浓度优化结果电泳图；
图6为杂交温度的优化结果图；
图7为杂交时间的优化结果图；
图8为三种探针液相基因芯片特异性验证结果图；
图9为三种立克次体液相基因芯片特异性验证结果图；
图10为Q热立克次体DNA浓度-MFI值剂量反应曲线图；
图11为普氏立克次体DNA浓度-MFI值剂量反应曲线图；
图12为莫氏立克次体DNA浓度-MFI值剂量反应曲线图；
图13为三种立克次体液相基因芯片模拟标本验证结果图。
具体实施方式
本发明的应用原理、作用与功效，通过如下实施方式予以说明。
实施例1
本发明提供的一种立克次体液相基因芯片的检测方法，包括如下步骤：
（1）PCR反应：①设计引物，分别选择Q热立克次体特有的转座酶htpAB基因相关重复序列、普氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因和莫氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因设计引物，通过引物设计软件分析各引物退火温度值以及各引物间二聚体的形成；②PCR体系及反应条件，PCR体系（50μL）包括PCR预混液25μL，上下游引物（10μM）各1.0μL，DNA3μL，去离子水补足50μL；反应条件：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环,最后72℃延伸5分钟；
（2）制备、杂交和检测微球，每条探针的5’端连上20个多聚碱基T作为连接端，并氨基化修饰；
①联结探针与羧化微球，其步骤如下：
A、将已分装好的碳化二亚胺粉末从-20℃取出，回温至室温；
B、将氨基化修饰的寡核苷酸探针重悬于蒸馏水中使其终浓度为1mmol/L；
C、将1mL包装中的小球振荡30秒，超声30秒，至小球分散；
D、取100μL小球至1.5mL离心管，14000g4分钟，小心吸出上清；
E、微球重悬于50μLpH4.5、0.1mol/L的2-(N-***啉)乙磺酸溶液中，振荡20秒，超声20秒；
F、用蒸馏水将1mmol/L的寡核苷酸探针10倍稀释；
G、将2μL10倍稀释的探针加于小球悬浮液中，振荡混匀；
H、配制10mg/mL碳化二亚胺溶液；
I、每个1.5ml离心管中加入2.5μL新鲜配制的碳化二亚胺溶液，振荡混匀；
J、置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；
K、每管中加入2.5μL新鲜配制的碳化二亚胺溶液，振荡混匀；
L、再次置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；
M、反应结束后，14000g离心4分钟，小心吸弃上清；
N、各管中加入1mL0.02%吐温20洗涤1次；
O、离心14000g4分钟，小心吸弃上清；
P、各管中加入1mL0.1%的十二烷基硫酸钠溶液，洗涤1次，同上离心吸弃上清；
Q、各管中加入100μLpH8.0的TE缓冲液，振荡10s，超声10s，使微球重悬；
R、微球的计数：用血球计数板计数；
S、联结好探针的微球悬于pH8.0的TE缓冲液中，4℃保存备用；
②联结微球的质控，其步骤如下：
A、合成与探针互补的寡核苷酸链,寡核苷酸链5’端生物素标记；
B、用涡流振荡器充分振荡已经联结好的编码微球；
C、吸取适量微球，用2×氯化四甲铵杂交液稀释至3500个/25μL，置于0.2μL离心管中；
D、稀释与探针互补的寡核苷酸链至0.1μmol/L；
E、各管中加入10μL上述寡核苷酸溶液以及15μLTE缓冲液溶液使其终体积为50μL，吹打混匀；
F、95℃变性10分钟；
G、55℃杂交15分钟；
H、转移至滤板抽滤去掉未结合的核苷酸链；
I、各孔加75μl4ng/μL链亲和素-藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素-藻红蛋白；
J、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬；
K、反应结束后使用液相悬浮芯片仪检测；
L、同时设置不加寡核苷酸链而只加TE缓冲液的阴性对照，同上进行检测；
结果判定：联结的微球的MFI值大于5000，说明包被成功；
③杂交与检测，其步骤如下：
A、取联结好探针的微球各3500个混于25μL2×氯化四甲铵杂交液杂交液中，置于0.2μL离心管中；
B、各管中加10μL混合模板的PCR产物和15μLTE缓冲液溶液，使其终体积为50μL，吹打混匀；
C、95℃变性10分钟；
D、杂交温度下杂交一定时间；
E、转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物；
F、各孔加75μL4ng/μL链亲和素-藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素-藻红蛋白；
G、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬，结束后使用液相悬浮芯片仪检测；
H、按操作说明，先冲洗管道，再预热激光检测器30分钟，待机备用；
I、根据微球编号和待检因子，编写检测用的控件；
J、根据样本的数量，建立操作流程；
K、然后将96孔板放入检测仓检测；
检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测作为检测本底，对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的平均荧光强度值，即为MFI值，亦即读取的这种编号的微球群的每个微球信号强度的统计平均值，通过液相悬浮芯片仪悬浮芯片***读取各孔MFI值以及本底荧光值，本底荧光值即为BFI值，结合液相悬浮芯片仪分析处理数据；当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时，即判为阳性；
（3）建立多重引物液相基因芯片检测体系：混合分别联结有3种特异性探针的3种微球组成多重检测***；
（4）检测PCR产物：在多重检测体系中每孔加入25μL含有微球各3500个的2×氯化四甲铵杂交液杂交液、10μLPCR产物和15μLTE缓冲液溶液；
（5）对制备、杂交和检测微球中的杂交条件进行优化：
优化杂交温度，杂交温度分别选择47℃、51℃、55℃、59℃、63℃5个温度进行，以混合模板的PCR产物为被检测物，以MFI值与BFI值之比进行结果判断；
优化杂交时间，确定杂交温度后，以混合模板的PCR产物为被检测物，杂交时间分别取10分钟、15分钟、20分钟、25分钟，比较不同杂交时间对信号强度的影响
（6）液相基因芯片的方法学验证：①特异性验证，选用多种菌株，考核多重悬浮芯片方法对样品检测的特异性；②灵敏度验证，不同浓度的质粒分别按照优化后的PCR体系进行扩增，然后用包被对应探针的微球进行检测，液相悬浮芯片仪（同上所述）***自带软件进行分析得出剂量反应曲线；BFI值为阴性对照检测时的信号，最低检测限从拟合曲线上推定，即分析物的MFI值相当于BFI值三倍所对应的检测物浓度；③重复性验证，以质粒为模板，PCR扩增后，使用同一批包被探针的微球，对同一批PCR产物进行重复性检测；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取DNA进行检测。
本实施例中，检测结果如下：
一、无优化手段
如图1、图2所示，图1中1-6分别为Q热立克次体引物对Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌、阴性对照的扩增结果，7-12分别为普氏立克次体、Q热立克次体、莫氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌、阴性对照的扩增结果，图2中1-6分别为莫氏立克次体引物对莫氏立克次体、Q热立克次体、普氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌、阴性对照的扩增结果，通过单对引物的扩增，各对引物都与其对应的模板在相应的位置出现扩增条带，条带位置正确；而对照菌株扩增均未有可见条带。
如图3所示，图中1-5分别为Q热立克次体+普氏立克次体+莫氏立克次体模板、Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、阴性对照的扩增结果，三对引物混合扩增，各模板均在相应的位置出现扩增条带，条带位置正确。因为片段长度过于接近，混合模板和单一模板PCR产物无法通过电泳区分。
二、对PCR条件优化后：
①优化退火温度，退火温度分别为53℃、55℃、57℃的扩增结果如图4所示，图中1-3分别为退火温度53℃、55℃、57℃的Q热立克次体扩增，4-6分别为退火温度53℃、55℃、57℃的普氏立克次体，7-9分别为退火温度53℃、55℃、57℃的莫氏立克次体；由图可以看出，Q热立克次体退火温度为55℃时，扩增较好；普氏立克次体退火温度为53℃和55℃时，扩增较好；莫氏立克次体退火温度为53℃、55℃和57℃均较好，没有明显差异。因此，选择55℃作为三重PCR扩增的退火温度。
②优化引物浓度，按照优化后的退火温度修改基本体系，开展引物浓度优化实验，上下游引物（10μM）体积各为2.5μL、2.0μL、1.5μL、1.0μL的扩增结果如图5所示，图中1-4分别为Q热立克次体上下游引物（10μM）各2.5μL、2.0μL、1.5μL、1.0μL的扩增结果，5-8分别为普氏立克次体同上的扩增结果，9-12分别为莫氏立克次体同上的扩增结果，由图5可以看出，随着上下游引物（10μM）体积各2.5μL、2.0μL、1.5μL、1.0μL的变化，Q热立克次体、普氏立克次体和莫氏立克次体扩增产物量没有明显变化；而普氏立克次体和莫氏立克次体在上下游引物浓度增高时引物二聚体的量也增高。因此，选择上下游引物（10μM）体积各1.0μL作为用量。
因此，本发明设置PCR反应体系及反应条件如下：
PCR体系（50μL）包括预混液，25μL；上下游引物（10μM）各1.0μL；DNA3μL；去离子水补足50μL。
反应条件：94℃预变性5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；最后72℃延伸5分钟。
三、对杂交条件优化后
优化杂交温度，如图6所示，各个探针信噪比变化不一，但63℃和67℃信噪比基本呈下降趋势；综合比较在不同温度下的信噪比，以及考虑到温度对杂交特异性的影响，选择杂交温度为59℃；
优化杂交时间，如图7所示，随着杂交时间的延长，各个探针信噪比基本随之增加，因此选择杂交时间为25分钟。
综上，杂交反应主要条件优化为95℃变性10min，而后59℃杂交25分钟。
四、液相基因芯片的方法学验证结果
特异性验证，探针的特异性验证，即用备选探针对待检因子不同组合进行检测，当有某一待检因子存在时，该检测因子对应微球显示强的荧光信号，而其余微球与阴性质控微球上的荧光信号相比没有明显变化，说明各探针与其他分析物之间不存在交叉反应，如图8所示，该体系具有检测Q热立克次体、普氏立克次体和莫氏立克次体的能力；如图9所示，对Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体出现特异性扩增，而土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌EV76株未出现扩增
综上所述，本检测技术具备较好的特异性。
②灵敏度验证，由图10可知，Q热立克次体液相悬浮芯片仪分析结果得出拟合曲线，曲线方程为：
FI=-6.53652+(1881.23+6.53652)/((1+(Conc/14.9405)-1.61702))0.916998，从标准曲线推算检出限为1.5×103copies/mL；
由图11可知，普氏立克次体液相悬浮芯片仪分析结果得出拟合曲线，曲线方程为：
FI=8.93662+(2781.56-8.93662)/((1+(Conc/0.0795255)-1.13837))10，从标准曲线推算检出限为3.9×103copies/mL；
由图12可知，莫氏立克次体液相悬浮芯片仪分析结果得出拟合曲线，曲线方程为：
FI=4.94624+(2842.66-4.94624)/((1+(Conc/0.590861)-0.623733))10，从标准曲线推算检出限为3.5×103copies/mL；
综上所述，本检测技术具备较强的灵敏度。
③重复性验证，观察4次检测的MFI值，Q热立克次体、普氏立克次体和莫氏立克次体变异系数分别为3.28%、12.62%和2.78%，Q热立克次体和莫氏立克次体重复性较好，而普氏立克次体重复性较弱。
④模拟标本验证，由图13所示，添加质粒的鼠体标本中检出Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体，而不加质粒的鼠体标本未检出。
如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种立克次体液相基因芯片的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)PCR反应：①设计引物，分别选择Q热立克次体特有的转座酶htpAB基因相关重复序列、普氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因和莫氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因设计引物，通过引物设计软件分析各引物退火温度值以及各引物间二聚体的形成；②PCR体系及反应条件，PCR体系（50μL）包括PCR预混液25μL，上下游引物（10μM）各1.0μL，DNA3μL，去离子水补足50μL；反应条件：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环,最后72℃延伸5分钟；
(2)制备、杂交和检测微球，每条探针的5’端连上20个多聚碱基T作为连接端，并氨基化修饰；
①联结探针与羧化微球，其步骤如下：
A、将已分装好的碳化二亚胺粉末从-20℃取出，回温至室温；
B、将氨基化修饰的寡核苷酸探针重悬于蒸馏水中使其终浓度为1mmol/L；
C、将1mL包装中的小球振荡30秒，超声30秒，至小球分散；
D、取100μL小球至1.5mL离心管，14000g4分钟，小心吸出上清；
E、微球重悬于50μLpH4.5、0.1mol/L的2-(N-***啉)乙磺酸溶液中，振荡20秒，超声20秒；
F、用蒸馏水将1mmol/L的寡核苷酸探针10倍稀释；
G、将2μL10倍稀释的探针加于小球悬浮液中，振荡混匀；
H、配制10mg/mL碳化二亚胺溶液；
I、每个1.5ml离心管中加入2.5μL新鲜配制的碳化二亚胺溶液，振荡混匀；
J、置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；
K、每管中加入2.5μL新鲜配制的碳化二亚胺溶液，振荡混匀；
L、再次置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；
M、反应结束后，14000g离心4分钟，小心吸弃上清；
N、各管中加入1mL0.02%吐温20洗涤1次；
O、离心14000g4分钟，小心吸弃上清；
P、各管中加入1mL0.1%的十二烷基硫酸钠溶液，洗涤1次，同上离心吸弃上清；
Q、各管中加入100μLpH8.0的TE缓冲液，振荡10s，超声10s，使微球重悬；
R、微球的计数：用血球计数板计数；
S、联结好探针的微球悬于pH8.0的TE缓冲液中，4℃保存备用；
②联结微球的质控，其步骤如下：
A、合成与探针互补的寡核苷酸链,寡核苷酸链5’端生物素标记；
B、用涡流振荡器充分振荡已经联结好的编码微球；
C、吸取适量微球，用2×氯化四甲铵杂交液稀释至3500个/25μL，置于0.2μL离心管中；
D、稀释与探针互补的寡核苷酸链至0.1μmol/L；
E、各管中加入10μL上述寡核苷酸溶液以及15μLTE缓冲液溶液使其终体积为50μL，吹打混匀；
F、95℃变性10分钟；
G、55℃杂交15分钟；
H、转移至滤板抽滤去掉未结合的核苷酸链；
I、各孔加75μl4ng/μL链亲和素-藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素-藻红蛋白；
J、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬；
K、反应结束后使用液相悬浮芯片仪检测；
L、同时设置不加寡核苷酸链而只加TE缓冲液的阴性对照，同上进行检测；
结果判定：联结的微球的MFI值大于5000，说明包被成功；
③杂交与检测，其步骤如下：
A、取联结好探针的微球各3500个混于25μL2×氯化四甲铵杂交液杂交液中，置于0.2μL离心管中；
B、各管中加10μL混合模板的PCR产物和15μLTE缓冲液溶液，使其终体积为50μL，吹打混匀；
C、95℃变性10分钟；
D、杂交温度下杂交一定时间；
E、转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物；
F、各孔加75μL4ng/μL链亲和素-藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素-藻红蛋白；
G、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬，结束后使用液相悬浮芯片仪检测；
H、按操作说明，先冲洗管道，再预热激光检测器30分钟，待机备用；
I、根据微球编号和待检因子，编写检测用的控件；
J、根据样本的数量，建立操作流程；
K、然后将96孔板放入检测仓检测；
检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测作为检测本底，对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的平均荧光强度值，即为MFI值，亦即读取的这种编号的微球群的每个微球信号强度的统计平均值，通过液相悬浮芯片仪悬浮芯片***读取各孔MFI值以及本底荧光值，本底荧光值即为BFI值，结合液相悬浮芯片仪分析处理数据；当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时，即判为阳性；
(3)建立多重引物液相基因芯片检测体系：混合分别联结有3种特异性探针的3种微球组成多重检测***；
(4)检测PCR产物：在多重检测体系中每孔加入25μL含有微球各3500个的2×氯化四甲铵杂交液杂交液、10μLPCR产物和15μLTE缓冲液溶液；
(5)对制备、杂交和检测微球中的杂交条件进行优化:
优化杂交温度，杂交温度分别选择47℃、51℃、55℃、59℃、63℃5个温度进行，以混合模板的PCR产物为被检测物，以MFI值与BFI值之比进行结果判断；
优化杂交时间，确定杂交温度后，以混合模板的PCR产物为被检测物，杂交时间分别取10分钟、15分钟、20分钟、25分钟，比较不同杂交时间对信号强度的影响；
(6)液相基因芯片的方法学验证：①特异性验证，选用多种菌株，考核多重悬浮芯片方法对样品检测的特异性；②灵敏度验证，不同浓度的质粒分别按照优化后的PCR体系进行扩增，然后用包被对应探针的微球进行检测，液相悬浮芯片仪***自带软件进行分析得出剂量反应曲线；BFI值为阴性对照检测时的信号，最低检测限从拟合曲线上推定，即分析物的MFI值相当于BFI值三倍所对应的检测物浓度；③重复性验证，以质粒为模板，PCR扩增后，使用同一批包被探针的微球，对同一批PCR产物进行重复性检测；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取DNA进行检测。
CN201510982767.3A 2015-12-24 2015-12-24 一种立克次体液相基因芯片的检测方法 Pending CN105483232A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510982767.3A CN105483232A (zh) 2015-12-24 2015-12-24 一种立克次体液相基因芯片的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510982767.3A CN105483232A (zh) 2015-12-24 2015-12-24 一种立克次体液相基因芯片的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105483232A true CN105483232A (zh) 2016-04-13

Family

ID=55670503

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510982767.3A Pending CN105483232A (zh) 2015-12-24 2015-12-24 一种立克次体液相基因芯片的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105483232A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723376A (zh) * 2017-09-20 2018-02-23 李佳萌 一种检测普氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途
CN112819751A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 珠海碳云智能科技有限公司 多肽芯片检测结果的数据处理方法及装置
CN113430113A (zh) * 2021-06-30 2021-09-24 东南大学 一种超声波悬浮聚合酶链式反应装置及检测方法
CN114540551A (zh) * 2022-03-14 2022-05-27 海南医学院 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1786197A (zh) * 2005-11-23 2006-06-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种检测生物恐怖相关病原细菌的方法及其专用dna芯片
CN102183666A (zh) * 2011-03-18 2011-09-14 中国检验检疫科学研究院 高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法
CN103173567A (zh) * 2013-03-27 2013-06-26 中国检验检疫科学研究院 一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1786197A (zh) * 2005-11-23 2006-06-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种检测生物恐怖相关病原细菌的方法及其专用dna芯片
CN102183666A (zh) * 2011-03-18 2011-09-14 中国检验检疫科学研究院 高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法
CN103173567A (zh) * 2013-03-27 2013-06-26 中国检验检疫科学研究院 一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WATANABE, M.等: "Molecular screening for Rickettsia, Anaplasmataceae and Coxiella burnetii in Rhipicephalus sanguineus ticks from Malaysia", 《TROPICAL BIOMEDICINE》 *
栾明春等: "立克次体病实验室诊断现状", 《中国热带医学》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723376A (zh) * 2017-09-20 2018-02-23 李佳萌 一种检测普氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途
CN107723376B (zh) * 2017-09-20 2020-10-20 李佳萌 一种检测普氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途
CN112819751A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 珠海碳云智能科技有限公司 多肽芯片检测结果的数据处理方法及装置
CN112819751B (zh) * 2020-12-31 2024-01-26 珠海碳云智能科技有限公司 多肽芯片检测结果的数据处理方法及装置
CN113430113A (zh) * 2021-06-30 2021-09-24 东南大学 一种超声波悬浮聚合酶链式反应装置及检测方法
CN113430113B (zh) * 2021-06-30 2024-03-15 东南大学 一种超声波悬浮聚合酶链式反应装置及检测方法
CN114540551A (zh) * 2022-03-14 2022-05-27 海南医学院 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法
CN114540551B (zh) * 2022-03-14 2024-04-05 海南医学院 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Single-exosome-counting immunoassays for cancer diagnostics
Zhang et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a
Chen et al. Emerging biosensing technologies for improved diagnostics of COVID-19 and future pandemics
CN101985665B (zh) 一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针
Lie et al. A lateral flow biosensor for detection of nucleic acids with high sensitivity and selectivity
CN105483232A (zh) 一种立克次体液相基因芯片的检测方法
CN101560558B (zh) 多重pcr产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法
Fu et al. A tetrahedral DNA nanostructure functionalized paper-based platform for ultrasensitive colorimetric mercury detection
Soares et al. Rolling circle amplification in integrated microsystems: An uncut gem toward massively multiplexed pathogen diagnostics and genotyping
FI112094B (fi) Parannettu menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi
CN105675565B (zh) 一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法
CN101701266B (zh) 用于检测a型流感病毒的基因芯片、其制备方法及应用
CN101560557B (zh) 一种联合检测五种烈性病原菌的基因液相芯片及其非诊断性检测方法
Mirski et al. Review of methods used for identification of biothreat agents in environmental protection and human health aspects
Zhang et al. A one-pot strategy for the sensitive detection of miRNA by catalyst–oligomer-mediated enzymatic amplification-based fluorescence biosensor
CN103937884A (zh) 一种用于结核分枝杆菌检测的环介导等温扩增试剂盒及其使用方法
Mao et al. Portable biosensor combining CRISPR/Cas12a and loop-mediated isothermal amplification for antibiotic resistance gene ermB in wastewater
CN104313179B (zh) 一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
Tan et al. Sandwich-type DNA micro-optode based on gold–latex spheres label for reflectance dengue virus detection
KR20180081445A (ko) 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법
CN101560560B (zh) 一种检测鼠疫菌的基因液相芯片及其检测方法
CN101403000A (zh) 一种应用悬浮芯片技术检测致病性志贺氏菌方法
CN101429545A (zh) 一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法
Dunbar et al. Parallel processing in microbiology: Detection of infectious pathogens by Luminex xMAP multiplexed suspension array technology
Wu et al. Multiplex detection of five canine viral pathogens for dogs as laboratory animals by the Luminex xTAG assay

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160413

RJ01 Rejection of invention patent application after publication