CN105483094B

CN105483094B - 马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用

Info

Publication number: CN105483094B
Application number: CN201610077049.6A
Authority: CN
Inventors: 梁海鹰; 朱家萍; 雷倩楠; 吴羽媛; 王志新
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: CN105483094A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用。马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD相比于传统的SOD，具有很多区别，初步鉴定是一种新的SOD，而且本发明的马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。具有良好的应用前景。

Description

马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用。

背景技术

马氏珠母贝（Pinctada martensii）是我国人工海水育珠的主要珍珠贝之一，近年来因沿海水质的日趋恶化，各种病害也频繁发生，导致马氏珠母贝因病害发生大量死亡，对我国珍珠产业造成了巨大的经济损失。因此，了解马氏珠母贝免疫机制并在此基础上提高马氏珠母贝抗胁迫能力是目前亟需解决的问题。

无脊椎动物，不具备高等动物的特异性免疫***，所以对于天然免疫分子超氧化物歧化酶（SOD）在体内发挥免疫功能十分重要。超氧化物歧化酶能够清除机体内的自由基（O^2-），维持自由基生成与清除之间的失衡。超氧化物歧化酶一般为二聚体或四聚体，分子量在20 kDa～80 kDa之间。大量的研究发现超氧化物歧化酶在一些疾病如炎症、自身免疫性疾病、辐射以及抗衰老等有治疗作用。近年来，国内外对超氧化物歧化酶的研究逐渐增多，相对起脊椎动物，在贝类仅有少数物种如海湾扇贝、太平洋长牡蛎以及缢蛏等的超氧化物歧化酶被研究。对于马氏珠母贝，还未见超氧化物歧化酶的报道研究，研究马氏珠母贝的超氧化物歧化酶不仅可以了解马氏珠母贝的免疫机制，做到疾病防治，还间接对人类的生活有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD。

本发明的另一个目的是提供一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因。

本发明的另一个目的是提供马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。SEQ ID NO：2所示序列为PmECSOD基因的DNA全长序列，全长1846bp，包含42bp的5'UTR和382bp的3'UTR。SEQ ID NO:3所示序列为PmECSOD基因的开放阅读框序列，开放阅读框1422bp，编码473个氨基酸。

目前对SOD研究的比较多的主要是它能清除机体中的自由基，治疗由自由基引起的一些疾病，如抗衰老、抗肿瘤以及一些炎症等，而有少量的报道中有发现CuZnSOD具有参与活化抗菌肽和溶酶菌的作用。本发明发现马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。因此本发明要求保护马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD在抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长中的用途。

另外，本发明设计了一对检测如上所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的荧光定量引物，用于分析马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因在各组织中的表达情况，因此本发明要求保护一对检测如上所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的荧光定量引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示。

本发明还保护包含SEQ ID NO:2或3所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的重组载体。本发明还保护包含如上所述重组载体的重组菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次从马氏珠母贝血清中分离纯化获得一种新的超氧化物歧化酶，该酶有3个结构域，分别是FRI（Frizzled）结构域，IGc2（免疫球蛋白）结构域和SOD_Cu结构域，但是在Blastp中能比对上的只有SOD_Cu结构域，初步判断为一种新的SOD。另外发明人通过研究发现马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。

PmECSOD在组织中表达含量与其它物种的ECSOD截然不同，它在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃、性腺和血液中均有表达，鳃是PmECSOD的主要表达场所；然后是外套膜、血液和性腺，这三者含量差不多；表达量最少的是肝胰腺和闭壳肌。用灭菌后的大肠杆菌和藤黄微球菌刺激后，PmECSOD在血细胞各时期的含量都不相同。刺激之后4 h，PmECSOD的含量降低，之后8 h升高少许，从8 h之后又开始降低，直到36 h含量开始回升，一直到48 h，PmECSOD的含量达到最大值，与其它时间段有明显的差异。根据一些研究，可以推测，当某种物种受到外界物（如细菌、真菌和寄生虫等）刺激时，活性氧ROS开始大量聚集，吞噬外来物质，大量的ROS可能通过一些调控因子调控ECSOD的表达，产生的ECSOD与过量的ROS作用，防止过量的ROS对机体造成伤害。

附图说明

图1为马氏珠母贝血清用Sunfire^TM 半制备型C18柱分离所得色谱图，收集有抑菌活性的目的峰用“**”标注。

图2为目的峰用分析型Vydac C18柱进一步分离纯化，收集有抑菌活性的峰用C1标示对应的洗脱液做结构分析。

图3为马氏珠母贝血清分离组分对藤黄微球菌和大肠杆菌生长抑制图。

图4为PmECSOD肽段的质谱图。

图5为PmECSOD基因的中间片段电泳图；M: Marker；1： PmECSOD中间片段产物。

图6为PmECSOD基因RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳；M: Marker ； A-1: 3' RACE产物； B-2: 5' RACE产物。

图7为马氏珠母贝PmECSOD的cDNA序列及氨基酸序列功能位点预测；图中的ORF区域用大写字母表示，5’UTR和3’UTR用小写字母表示，PmECSOD的保守结构域用黑框表示，双横线代表多聚A加尾信号，粗线代表测序得到的氨基酸。

图8为SMART 在线分析PmECSOD序列结构域结果图。

图9为PmECSOD的氨基酸序列与其它物种的ECSOD的氨基酸序列的比对分析。

图10为以NJ法构建的PmECSOD家族成员氨基酸序列***进化树。

图11为PmECSOD基因表达定量分析；横坐标为组织，纵坐标为五次重复所得平均值±标准偏差。

图12为细菌刺激后PmECSOD基因在马氏珠母贝血淋巴的时序表达；差异显著0.01<P <0.05用星号表示，P<0.01用两个星标示；纵坐标为平均值±标准偏差(n=3)。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、马氏珠母贝的诱导与血清的收集：马氏珠母贝饲养三天后，将灭活大肠杆菌和藤黄微球菌注入马氏珠母贝的闭壳肌内进行诱导，每只注射10μL灭活大肠杆菌和20μL灭活藤黄微球菌，重新放入海水中饲养12h后用无菌的注射器从马氏珠母贝的闭壳肌处收集血淋巴，4℃，3000 rpm离心15min，取上清，冷冻干燥得马氏珠母贝的血清干粉。

2、马氏珠母贝血清的分离纯化：用SunFire^TM半制备型C18柱分离纯化马氏珠母贝血清，得到结果如图1所示，本轮洗脱共四个浓度梯度（5%乙腈、18%乙腈、40%乙腈和60%乙腈），经抑菌检测发现第Ⅲ梯度（即40%乙腈）洗脱的物质具有抗菌活性（图1中星号**表示），将该组分收集起来。该组分经分析型反相色谱柱C18分离，结果见图2。由图2可见，有抗菌活性的组分中成分复杂，共收集超过20种洗脱峰。经冷冻干燥后分别进行抑菌活性检测。其中有抗菌活性的组分标记为C1（见图2），收集并冷冻干燥后做进一步研究。

采用酶标仪法，对照组去离子水，实验组为上述经HPLC分离后的组分，样品浓度为100 μg/mL。以马氏珠母贝血清组分对藤黄微球菌和大肠杆菌的抑制作用为例，结果如图3所示。A图为藤黄微球菌在加入样品后0和12小时所测得的OD值，由图3A可见，加入马氏珠母贝血清组分后，藤黄微球菌的生长受到明显抑制（p<0.05）；同时，马氏珠母贝血清组分对大肠杆菌的生长液产生明显抑制作用（P<0.05）（图3B）。抑菌试验证明组分C1对藤黄微球菌和大肠杆菌具有抑制作用。

3、马氏珠母贝血清抗菌活性蛋白的质谱分析：将步骤2分离获得的抑菌活性成分C1运用MALDI-TOF/TOF 5800质谱仪进行活性蛋白的分子量鉴定；采用二级质谱结合Denovo测序技术分析蛋白经胰蛋白酶酶解后的片段的氨基酸序列。经过质谱测序得到的C1组分的质谱图见图4。将测得的氨基酸序列在NCBI中进行同源比对，发现组分C1与超氧化物歧化酶的相似度极高，分别在NCBI的蛋白质数据库以及马氏珠母贝基因组筛选超氧化物歧化酶同源序列，以得分最高的同源序列为模板设计扩增C1组分中间片段、5’ RACE和3’RACE扩增引物。扩增引物序列如表1所示。

4、提取马氏珠母贝血细胞总RNA，利用RT-PCR方法得到C1组分基因的中间片段为1342 bp（图5），再根据中间片段的基因设计3'RACE和5'RACE的特异性引物（表1），通过RACE技术获得1089 bp的3'端核苷酸序列（图6中的A）和137bp的5'端核苷酸序列（图6中的B）。最终获得C1组分基因的cDNA序列全长，总长为1846bp。根据该cDNA所编码的蛋白质氨基酸序列与质谱测的的肽段进行比对，最终确定该活性组分的全部氨基酸序列。通过序列分析，发现C1组分是一种新的超氧化物歧化酶，将C1组分命名为马氏珠母贝超氧化物歧化酶(PmECSOD)。PmECSOD基因的DNA全长为1846 bp(序列如SEQ ID NO：2所示)，包含42 bp的5'UTR和382 bp的3'UTR，开放阅读框为1422 bp(序列如SEQ ID NO：3所示)，编码473个氨基酸(序列如SEQ ID NO：1所示)。3'UTR末端有加尾信号序列AATAAA和poly（A）尾巴。

5、马氏珠母贝PmECSOD的cDNA序列及氨基酸序列功能位点预测结果见图7。PmECSOD蛋白理论分子量（MW）为49.6 KDa，等电点pI为8.62；在N-末端含有20个氨基酸的信号肽，而一般的CuZnSOD是没有信号肽的，这说明PmECSOD属于胞外型CuZnSOD，因此直接命名为PmECSOD。对于贝类的CuZnSOD来说，大部分研究的是胞质型CuZnSOD，目前在贝类中仅有太平洋长牡蛎和海湾扇贝中有发现胞外型CuZnSOD（ECSOD）。PmECSOD氨基酸序列中包含3个N-糖基化位点，2个酰胺化位点，4个CAXX盒，6个微体C-末端定位信号序列，4个酪蛋白Ⅱ磷酸位点，6个PKC磷酸位点和15个肉豆蔻酰化位点。其中氨基酸序列含有2个典型的铜/锌超氧化物歧化酶信号序列，分别位于氨基酸359～369这一段，氨基酸特征是：[GA]-[IMFAT]-H-[LIVF]-H-[S]-x-[GP]-[SDG]-x-[STAGDE]；马氏珠母贝PmECSOD氨基酸所含的特征序列是：GFHIHEYGGME；还有453～464这段，氨基酸特征是：G-[GNHD]-[SGA]-[GR]-x-R-x-[SGAWRV]-C-x(2)-[IV]而马氏珠母贝CuZnSOD氨基酸所含的特征序列是：GNAGTRIACCTI。

6、PmECSOD基因的开放阅读框编码生成的蛋白共有473个氨基酸，其中信号肽有20个氨基酸，成熟肽有453个氨基酸。从SMART main page中获得结构域，如图8所示，图中显示它有3个结构域，分别是FRI（Frizzled）结构域，IGc2（免疫球蛋白）结构域和SOD_Cu结构域。但是在blastp中能比对上的只有SOD_Cu结构域，初步判断为一种新的SOD。

将PmECSOD和其它物种进行同源序列比较，结果如图9所示。PmECSOD和其他物种的相似度很低，与斑马鱼（D. rerio）的相似度是37.01%，与果蝇（D.nasuta）的相似度是40.52%，与智人（H.sapiens）的相似度是19.9%，与太平洋长牡蛎（C.gigas）和海湾扇贝（A. irradians）相比，相似度依然很低，分别是28.32%和36.4%。

运用MEGA 6.0软件（Neighbor-Joining法）建立进化树。由于PmECSOD的结构域与其它物种的ECSOD有一些差别，进化树的建立结果如图10，图中显示进化树主要分为两大分支， PmECSOD与太平洋长牡蛎在同一支上，而包永波研究的海湾扇贝ECSOD却在另外一分支上。由此可以说明ECSOD这种超氧化物歧化酶除了少部分序列保守外，不同物种，它们的氨基酸有明显的差异。

实施例2

1、马氏珠母贝PmECSOD的组织差异表达分析：取10只成年马氏珠母贝做组织差异表达分析，所取的组织包括闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃、性腺以及血细胞，分别提取它们总RNA，反转录成cDNA，用于组织特异性表达分析。根据马氏珠母贝PmECSOD基因的保守序列，设计荧光定量引物，所用的内参是GAPDH。荧光定量分析用的引物见表2。

荧光定量结果如图11所示，最高的表达组织是鳃，约为血液的2.9倍，具有统计学差异（P<0.05）；其次是肝胰腺约为血淋巴的0.29倍，也具有显著差异（P<0.05）；而外套膜和性腺约为血液的1.15倍和0.67倍。最低的是闭壳肌，约为血液的0.11倍，具有显著的差异（P<0.05）；

马氏珠母贝的PmECSOD在组织中表达含量与其它物种的ECSOD截然不同，它在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃、性腺和血液中均有表达，鳃是PmECSOD的主要表达场所；然后是是外套膜、血液和性腺，这三者含量差不多；表达量最少的是肝胰腺和闭壳肌。这与同为贝类的海湾扇贝有明显的差异，海湾扇贝超氧化物歧化酶（AiECSOD）在血细胞中表达量最高，鳃中较低，性腺和外套膜中几乎没有。Gonzalez等研究太平洋长牡蛎的ECSOD在血循环***和细胞间隙中发现。与脊椎动物小鼠相比，也有所不同，Folz等发现小鼠的肺和肾中含有很多ECSOD，而在骨骼肌中没有检测到。可见不同的物种，ECSOD在组织中的含量各不相同，就算是同一物种，不同的组织表达含量也是有差别的。

2、细菌刺激之后PmECSOD的mRNA在血细胞中的时序表达：取暂养3天的健康马氏珠母贝140只，分2组：细菌刺激组、PBS对照组，每组60只贝。采用从闭壳肌注射的方法，以灭活的大肠杆菌和藤黄微球菌进行诱导，每只注射10μL灭活的大肠杆菌和20μL灭活的藤黄微球菌，实验期间，不投喂饵料，整个实验过程未引起死亡。注射后的0 h、2 h、4h、8 h、12 h、24h、48h，各组分别取5只贝作为各时间点样品。每个时间点中的5只贝分别取等量的血液，取好的血清800 g离心5 min后，去上清，加1 mL Trizol，用枪吸打使其重新悬浮，提取总RNA并反转录成cDNA，用于荧光定量分析。荧光定量分析的引物同表2。

用灭菌后的大肠杆菌和藤黄微球菌刺激后，PmECSOD在血细胞各时期的含量都不相同（见图12）。诱导48h之后，PmCuZnSOD的表达量最高，与空白对照组比较之后，发现是对照组的27.9倍（P<0.01），表现为极显著差异；而诱导16h时，PmECSOD在血细胞中表达量最低，约为对照组的0.22倍（P<0.05）。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海洋大学

<120> 马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 473

<212> PRT

<213> PmECSOD氨基酸序列

<400> 1

Met Trp Arg Ala Thr Gly Ile Leu Leu Leu Ala Pro Ile Phe Val Ser

1 5 10 15

Leu Ser Val Ala Gln Lys Cys Asn Met Val Thr Asp Arg Asn Cys Lys

20 25 30

Pro Tyr Thr Asn Tyr Ser Val Val Pro Asp Thr Ser Gly Ser Arg Thr

35 40 45

Asn Ala Met Phe Ser Leu Leu Asn Asn Val Asn Cys Gly Glu Glu Met

50 55 60

Arg Ser Phe Leu Cys Thr Ala Met Tyr Pro Ser Cys Asp Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Met Pro Cys Arg Ser Val Cys Leu Lys Gln Lys Thr Ile Cys Gly

85 90 95

Pro Arg Leu Lys Ala Leu Gly Ile Glu Trp Pro Phe Asn Cys Thr Met

100 105 110

Phe Gln Asp Ser Asn Asp Asn Asn Val Cys Met Leu Ala Asp Gly Pro

115 120 125

Gly Ser Thr Gln Pro Pro Leu Pro Thr Pro Ile Gln Thr Met Asp Ile

130 135 140

Leu Glu Gly Lys Lys Leu Arg Leu Thr Cys Arg Lys Ala Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Lys Trp Tyr Tyr Asn Asp Arg Gln Leu Gln Lys Thr Lys Arg

165 170 175

Ile Lys Ile Lys Lys Asn Val Leu Lys Ile Asn Lys Ile Gln Thr Ser

180 185 190

Asp Ala Gly Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Ser Asn Gly Gln Val Val Asp

195 200 205

Ile Thr Tyr Gln Val Ile Val Ala Ala Lys Thr Asn Ala Pro Val Lys

210 215 220

Ile Asp Met Gly Ser Ser His Gly Gln Gln Gly Ser Arg Asp Ala Ile

225 230 235 240

Ser Ser Asn Leu Thr Ala Leu Trp Gly Tyr Val Lys Lys Met Glu Gln

245 250 255

Asp Phe Gly Glu Gly Gly Val His Leu Tyr Met Asn Gly Ala Lys Ala

260 265 270

Arg Arg Lys Gly Asn Thr Ile Asp Ile Asn Leu Asn Val Lys Gly Ala

275 280 285

Asp Cys Asp Glu Ser Met Gly Asp Asp Asp Glu Glu Arg Tyr Ala Thr

290 295 300

Cys Leu Val Thr Pro Asn Met Pro Met Ala Lys Met Phe Lys Ala Ser

305 310 315 320

His Arg Val Val Gly Gln Ile Arg Leu Ala Gln Lys Gly Arg Lys Ala

325 330 335

Pro Val Glu Met Asp Ile His Leu Ser Gly Phe Asp Val Ser Gly Pro

340 345 350

Ser Pro Gln His Glu His Gly Phe His Ile His Glu Tyr Gly Gly Met

355 360 365

Glu Asn Gly Cys Gln Thr Leu Gly Gly His Phe Asn Pro Glu Lys Val

370 375 380

Asn His Gly Ala Pro Asp Ala Lys Glu Arg His His Gly Asp Leu Gly

385 390 395 400

Asn Ile His Cys Asp Asn Phe Gly Asn Ser Ala Glu Glu Ile Thr Asp

405 410 415

His Lys Ile Thr Met Phe Gly Arg Asn Ser Ile Ile Gly Arg Ser Phe

420 425 430

Thr Ile His Glu Gly Ser Asp Asp Met Gly Leu Gly Gly Thr Lys Ala

435 440 445

Ser Leu Ser Gly Gly Asn Ala Gly Thr Arg Ile Ala Cys Cys Thr Ile

450 455 460

Ala Leu Ser Ala Lys Pro Ser Gly Pro

465 470

<210> 2

<211> 1846

<212> DNA

<213> 编码PmECSOD的cDNA全长序列

<400> 2

acatggggat ccaggtttat tccgtgccag gaaagcagca agatgtggcg agcgactgga 60

atacttcttt tggcgccaat atttgtcagt ttatctgtag cacagaagtg caacatggtg 120

acagacagaa actgcaaacc ctataccaac tatagtgttg tccccgacac ctcaggatct 180

cgcaccaacg ccatgttttc acttcttaat aatgtgaatt gtggagaaga aatgagaagc 240

tttctatgca ccgccatgta cccctcgtgc gatttcccgc ccaaaatgcc atgccgttcg 300

gtatgtctca aacagaaaac aatctgcgga ccgcgtctga aggcactcgg tatagaatgg 360

cccttcaact gtactatgtt ccaagattca aacgacaaca acgtgtgtat gcttgctgat 420

ggtcctggtt ccacccaacc tcctctcccc actccaatcc aaacaatgga tatactggag 480

gggaaaaaac tgaggctcac atgccgtaaa gctgctggaa aatctgtcaa gtggtactac 540

aacgaccgac aactacaaaa gacaaaaaga ataaagataa agaagaacgt attgaaaata 600

aacaagatac agacttcaga cgctggttta tatgagtgta aggacagcaa tggtcaggta 660

gtggatatca cgtatcaagt tatagtggct gcaaaaacaa acgctccagt taaaatagat 720

atggggtcca gccatggtca acaaggcagt cgggatgcca tcagttccaa cctgacagcg 780

ttgtggggct atgtcaagaa aatggaacaa gattttggag aaggaggagt gcacttatac 840

atgaacgggg ctaaagccag gaggaaagga aacactatag atataaacct caacgtgaag 900

ggcgctgatt gtgatgaatc tatgggagat gacgatgaag agagatatgc aacttgttta 960

gttacaccta atatgccaat ggcgaaaatg ttcaaggcca gccatcgggt tgtagggcag 1020

atcagactag cccaaaaggg aagaaaagcc ccggttgaga tggatatcca cctgtctggg 1080

tttgatgtta gtggcccctc ccctcagcac gaacatggat tccacatcca cgagtatgga 1140

ggaatggaaa atggatgcca gacactcggt ggtcatttca atcccgaaaa agtcaatcat 1200

ggtgctccgg atgccaaaga aagacaccat ggcgacttag ggaatattca ctgtgataac 1260

tttggtaatt cagctgaaga aatcactgac cataaaatca caatgttcgg ccgtaattcc 1320

atcattggtc gatcatttac gattcacgag ggaagtgatg acatgggtct tggcggcacg 1380

aaagcaagtt tgtcgggtgg caatgctggt accaggatag cgtgctgtac aatagccctc 1440

tctgctaaac ctagtggtcc ttaaaggcag tggacatgca catatgccaa ttggaatacg 1500

cggcaatttt ttttctatta cacgttaata tttctcgtca ccatatgatt tatacatgta 1560

tacgtgtgca ttttttctaa caatttaaag ccagtgctga attctatgat attatttata 1620

ctattttatt actacatcgt agtattttgg gtttgacgaa tgtttgagtt acgaagcatg 1680

agactaaata gtcagaaatt gaattcttta tatgaacgaa aacactagca caatatgtgc 1740

aatacgaatt gaaaatctac catatatgta tacttctaca tgtacatagt atttgttaaa 1800

agcagaataa accataaaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1846

<210> 3

<211> 1422

<212> DNA

<213> 编码PmECSOD的ORF序列

<400> 3

atgtggcgag cgactggaat acttcttttg gcgccaatat ttgtcagttt atctgtagca 60

cagaagtgca acatggtgac agacagaaac tgcaaaccct ataccaacta tagtgttgtc 120

cccgacacct caggatctcg caccaacgcc atgttttcac ttcttaataa tgtgaattgt 180

ggagaagaaa tgagaagctt tctatgcacc gccatgtacc cctcgtgcga tttcccgccc 240

aaaatgccat gccgttcggt atgtctcaaa cagaaaacaa tctgcggacc gcgtctgaag 300

gcactcggta tagaatggcc cttcaactgt actatgttcc aagattcaaa cgacaacaac 360

gtgtgtatgc ttgctgatgg tcctggttcc acccaacctc ctctccccac tccaatccaa 420

acaatggata tactggaggg gaaaaaactg aggctcacat gccgtaaagc tgctggaaaa 480

tctgtcaagt ggtactacaa cgaccgacaa ctacaaaaga caaaaagaat aaagataaag 540

aagaacgtat tgaaaataaa caagatacag acttcagacg ctggtttata tgagtgtaag 600

gacagcaatg gtcaggtagt ggatatcacg tatcaagtta tagtggctgc aaaaacaaac 660

gctccagtta aaatagatat ggggtccagc catggtcaac aaggcagtcg ggatgccatc 720

agttccaacc tgacagcgtt gtggggctat gtcaagaaaa tggaacaaga ttttggagaa 780

ggaggagtgc acttatacat gaacggggct aaagccagga ggaaaggaaa cactatagat 840

ataaacctca acgtgaaggg cgctgattgt gatgaatcta tgggagatga cgatgaagag 900

agatatgcaa cttgtttagt tacacctaat atgccaatgg cgaaaatgtt caaggccagc 960

catcgggttg tagggcagat cagactagcc caaaagggaa gaaaagcccc ggttgagatg 1020

gatatccacc tgtctgggtt tgatgttagt ggcccctccc ctcagcacga acatggattc 1080

cacatccacg agtatggagg aatggaaaat ggatgccaga cactcggtgg tcatttcaat 1140

cccgaaaaag tcaatcatgg tgctccggat gccaaagaaa gacaccatgg cgacttaggg 1200

aatattcact gtgataactt tggtaattca gctgaagaaa tcactgacca taaaatcaca 1260

atgttcggcc gtaattccat cattggtcga tcatttacga ttcacgaggg aagtgatgac 1320

atgggtcttg gcggcacgaa agcaagtttg tcgggtggca atgctggtac caggatagcg 1380

tgctgtacaa tagccctctc tgctaaacct agtggtcctt aa 1422

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> PmECSOD-qPCR-F

<400> 4

tccacctgtc tgggtttgat gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> PmECSOD-qPCR-R

<400> 5

ccggagcacc atgattgact tt 22

Claims

1.SEQ ID NO:1所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD在制备抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长药物中的用途。