CN1054773A

CN1054773A - 血液调节肽

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Publication number: CN1054773A
Application number: CN90107067A
Authority: CN
Inventors: 普拉迪普·库马·巴特纳加; 威廉·弗朗西斯·赫夫曼; 詹姆斯·爱德华·塔尔梅奇
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1991-09-25
Anticipated expiration: 2005-07-13
Also published as: PT94702A; FI94354B; NZ234501A; DK0408371T3; ZW11290A1; PT94702B; IE902547A1; AU638468B2; JP2638666B2; JPH0356498A; NO903148D0; CA2020838A1; CN1034663C; DE69012901D1; PH30055A; NO177713C; EP0408371A1; PL166004B1; CA2020838C; IL95012A0

Abstract

本发明提供下列公式的化合物：

该化合物具有血液调节活性，可用于刺激血细胞的生成。

Description

本发明涉及新型肽，它具有血液调节活性可用于刺激血细胞生成并且适用于治疗病毒、真菌和细菌感染性疾病。

各种各样的调节信使和调节物例如克隆刺激因子、干扰素以及不同类型的肽决定着骨髓细胞生成的调节。Metcalf，Cell，43∶5（1985）;Baserga R.，Foa P.，Metcalf D，Polli EE（编）Biological Regulation of Cell Proliferation（1986）;Nicola等人，J.Cell.Physiol.128∶501（1986），Zoumbos等人，Proyr.Hemat.1∶341和14∶201（1986）Werner等人，Experientia 42∶521（1986）。二十年前，Rytomaa和Kivieniemi Cell Tissue Kinet 1∶329-340（1968）;Rytomaa等人，Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp106-138（1967），报道了成熟的粒细胞的提取液（粒细胞***抑制素）能够在盖载玻片培养中特异地抑制鼠骨髓生成细胞的增殖。后来，他们证明了分子重量低于3000道尔顿的该因子能够引起一种可移植的鼠粒细胞白血病的退化以及阻碍人白血病细胞的生长。Paukovits和其他人从鼠的骨髓细胞中提取出一种类似的因子，并证明了它抑制骨髓细胞吸收氚化胸腺嘧啶脱氧核苷（Paukovits，W.R.，Cell Tissue Kinet 4∶539-547（1971）;Naturforsch 37∶1297（1982））。在1979年，Boll等人ActaHaematologica 6∶130（1979）证明了在培养的人骨髓细胞上鼠粒细胞提取液的抑制效应，一些其他研究者证实了这种粗制粒细胞提取液在试管内抑制啮齿动物骨髓细胞g-CFUC和/或gm-CFUC的生长。

把这种生物剂称为粒细胞***抑制素，按照这个理论概念，当它在同样的组织中被分泌时它应当是细胞增殖作用的内源抑制因子。发现从粗制提取液中获得的这种物质是非种间特异的却具有高的组织特异性。进一步发现，它是无毒的和具有可逆活性的。

在1982年，报道了一种具有下列结构的血液调节五肽：

pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys

它在骨髓生成细胞上，在体内和体外均具有选择性抑制作用。其中主要作用似乎是发生在骨髓生成干细胞（CFU-gm）上，（Paukovits等人，Z.Naturforsch 37∶1297（1982）和美国专利4，499，081）。这种肽被认为是一种在骨髓提取物中已经以小量发现的自然产生的粒细胞生成抑制因子的类似物。这种肽通过抑制血细胞生成，特别是粒细胞生成，倾向于阻止休眠细胞进入细胞***，而对细胞毒素的抗癌药物的攻击变得敏感。除了在使用细胞毒素药物的治疗中提供一种保护功能，该肽也可用于阻止涉及骨髓细胞生成***（即骨髓白血病）的癌细胞增殖。

在1987年，Laerum等人报道了这种肽的氧化产品是通过二硫桥键形成的二聚物（HP-5）。这种二聚物具有与单体相反的作用，在试管中它强烈刺激人或鼠的CFU-gm的克隆形成，并且在体内向上调节鼠骨髓生成细胞。在欧洲专利申请87309806.5中，它已被提出权利要求。

报道的二聚物对于一些病人刺激骨髓细胞生成是有用的，这些病人是指患骨髓细胞生成活性下降的病人，包括骨髓损伤，粒性白血细胞缺乏症和再生障碍性贫血，包括在骨髓移植外科中为了免疫抑制治疗而抑制组织反应，降低了骨髓机能的病人。该化合物也可以用于对肿瘤和病毒性疾病进行抑制细胞生长的化疗和放疗以后激励骨髓更迅速的再生。它们对随着骨髓的衰竭而导致的缺乏免疫应答的严重感染患者有特殊的价值。

在HP-5二聚物中二硫键的存在提示出这个单体可能在体内是代谢物。由于该单体抑制血细胞生成，当用于体内刺激骨髓细胞生成时，HP-5二聚物的稳定性是关键性的。一种稳定的二聚物的发现将会消除这个潜在的问题。

本发明包括由以下公式（Ⅰ）表示的肽，它具有血液调节活性，并能用于刺激血细胞生成和治疗细菌、病毒和真菌疾病。这些肽可用于由于各种临床情况造成的细胞计数降低病人的白细胞的恢复，例如，外科导致的骨髓抑制、爱滋病、先天性骨髓发育不良、骨髓和器官移植;对于预防白细胞减少的感染，对于治疗严重烧伤病人和使用于一些细胞周期特异的抗病毒药剂的观察中，对骨髓抑制的改善是有用的。这些肽对于治疗病毒、真菌和细菌感染疾病，特别是念珠菌和疱疹，在免疫抑制和“常规”治疗中均是有用的。

这些化合物也可用于与美国专利4，499，081中的单体结合，在骨髓细胞中提供高、低活性的交替峰，以此促进血细胞生成的自然生理节奏的节律。使得抑制细胞的治疗能在低的骨髓活性期间进行，由此减少骨髓损伤的危险，而通过活性的高峰期来激励再生。本发明还涉及一种药用组合物，它包括公式（Ⅰ）的化合物和一种药用载体。

本发明进一步建立一种用于刺激动物（包括人）的骨髓细胞生成***的方法，该方法包括将公式（Ⅰ）的化合物的有效量给需要治疗的动物施用。

本发明还建立一种用于治疗受病毒、真菌和细菌感染的免疫抑制的和正常的动物（包括人）的方法，该方法包括将公式（Ⅰ）的化合物以有效量给需要治疗的动物服用。

本发明的肽可用式（Ⅰ）或它的药用盐来表明：

Y₁和Y₂各独立地是CH₂或S;

x是0，1，2，3或4;

m是0，1或2;

n是0，1或2;

A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;

B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;

C是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;

D是赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、二氨基己炔酸或羧基酰胺、或它的羟甲基的衍生物。

E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或一个肽键。

规定：

当Y₁和Y₂是S时，x是2、3或4，并且m和n是1;或

当Y₁和Y₂是CH₂时，x是0，1或2，并且m和n是0;或

当Y₁和S和Y₂是CH₂时，x是0并且n是1;或

当Y₂是S和Y₁是CH₂时，x是0和m是1。

在本发明中还包括本发明的化合物的药用盐络合物。在式（Ⅰ）中应当注意A包括相应于焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸的氨基酸残基的末端氨基。与此相似，D包括与赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、二氨基己炔酸或羧基酰胺或它的羟甲基的衍生物相应的氨基酸残基的末端羧基。

在现有技术中通常使用的符号在此用来描述这些肽：

pGlu＝焦谷氨酸

Pro＝脯氨酸

Gln＝谷氨酸胺

Glu＝谷氨酸

Asp＝天冬氨酸

Lys＝赖氨酸

Arg＝精氨酸

Cys＝半胱氨酸

Tyr＝酪氨酸

Sub＝二氨基辛二酸

Hna＝二氨基己炔酸

Pim＝二氨基庚二酸

Adp＝二氨基己二酸

按照通常的表示法，氨基的末端在左边，羧基的末端在右边。所有的手性氨基酸可以是D或L的绝对构型形式。

可以通过酰化作用保护氨基末端，这样的保护基团的实例是t-丁氧基碳酰（t-Boc）、CH₃CO和Ar-CO（Ar＝苯甲基）。

C末端可以在天然的氨基酸情况下是羧基，或羧基酰胺（）或羟甲基（-CH₂-OH）。

优选的化合物是其中的Y₁和Y₂为CH₂、x是1或2，其中A是pGlu，B是Glu，C是Asp，D是Lys和E是一个肽键，并且手征性氨基酸是以L的构型形式。

特别优选的化合物是：

本发明的化合物不同于现有技术的化合物，其中的二聚物是通过碳-碳键来联系而不是二硫键。碳-碳键在体内不容易断裂，所以，在体内它比欧洲专利申请87309806.5的化合物更稳定。

本发明的肽用Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149（1964）报道的固相技术来制备，现有技术公知的溶液法也可以成功地使用。肽合成的方法一般记载在J.M.Stewart和J.D.Young Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Company，Rockford，I1（1984）或M.Bodansky，Y.A.Klauser和M.A.Ondetti Peptide Synthesis，John Wiley & Sons，Inc.，New York，N.Y.（1976）中，可以用来制备本发明的肽并在此作为参考结合到本发明中。

象已知的肽技术一样，适当地保护每一个氨基酸或肽。例如，芴基甲氧基羰基基团（Fmoc）或t-丁氧基羰基（t-Boc）基团优选地用于保护氨基，特别是在α位置。一种相应地取代的羰苄氧基团可以用于赖氨酸的ε氨基，苯甲基分别用于Asp和Glu的β和γ羧基。羰苄氧基团保护基的合适的取代是邻和/或对位氯、溴、硝基或甲基的取代。并用予改进保护基团的反应性。除了t-Boc基，最常用的保护基是用温和的酸处理不被去掉的那些，如已知的现有技术那样，这些保护基团要通过催化氢化作用，用在液态氨中的钠或HF处理的方法除去。

如果使用固相方法，从羧基末端开始朝着肽的氨基末端按顺序地建造肽。通过把保护的氨基酸的C端与一个合适的树脂共价连接，来开始固相合成这些树脂。例如，二苯甲基胺树脂（BHA）、甲基二苯甲基胺树脂（MBHA）或氯基甲基树脂（CMR）（这在美国专利4，244，946中作了一般描述）或苯乙酰胺一甲基树脂（PAM）。如果产品肽的羧基端打算是羧基酰胺，则使用BHA或MBHA载体树脂。如果产品肽的羧基端打算是一个羧基基团，则通常使用CMR或Pam树脂，尽管它也可用于生产羧基酰胺或酯。

通过温和的酸（即三氟乙酸）的处理来去除α氨基上的保护基团。对于Y₁和/或Y₂是CH₂而不是S的化合物，用合适的偶合剂把di-Boc（二氨基二羧基酸）偶合到树脂上的两个氨基酸上。用适当地保护的D衍生物使游离的羧基酰胺化。在不分离中间产品的情况下，用现有技术中已知的技术适当的脱保护、中和以及偶合循环去依次地加成氨基酸直到形成所期望的肽。然后可以以任意顺序从载体树脂中分离出和/或裂解出完成的肽。

用HF或HBr/乙酸处理支持肽的树脂，从树脂中裂解出肽，并像生成羧酸一样，产生羧基末端氨基酸。

如果期望的是酯，则可用适当的醇类例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或苯甲基醇来处理CMR或Pam树脂，在有三乙基胺存在的情况下，从树脂中裂解出肽，并直接得到酯。

本发明的肽的酯出可通过一般的方法从其羧酸母体制备。通常在有酸催化剂存在下用一种醇处理该羧酸。另一方面，羧酸可以转化成为一种活性酰基的中间体，例如一种酸卤化物，并且最好在有一种碱存在的情况下用一种醇处理。

用于从支持树脂中分解肽的优选方法是在有合适的阳离子净化剂例如苯甲醚或二甲氧基苯存在的情况下用无水HF处理支持肽的树脂。该方法同时地去除所有的保护基团（除了保护硫的硫代烷基）并从树脂中裂解出肽，用这种方法从CMR和Pam树脂中进行水解的肽是羧酸，从BHA树脂中裂解出的肽是如羧基酰胺那样的肽。

该肽的末端氨基的修饰象现有技术中通常已知的那样，用烷基化和酰化作用来完成。这种修饰可以在结合到肽之前的氨基酸上进行，或在该肽已经合成和释放了末端氨基之后，但是要在保护基被去掉之前在肽上进行。

通常，酰化作用在有叔胺的情况下，使用相应的烷基酸或芳基酸的酰基卤、酸酐或活性醚在游离的氨基上进行。在有温和的还原剂例如氰氢硼化锂或钠存在下，用相应的脂肪族醛或酮通过氨基的还原性烷基化作用进行单烷基化是最易于进行的。在有碱存在下，用过量的烷基卤化物处理该氨基可以进行双烷基化。

肽的溶液合成可以使用通常形成酰胺键的方法来实现。通常使用适当的偶合剂例如N，N′-二环己基碳二亚胺（DCC）将具有游离羧基的被保护的t-Boc氨基酸偶合到具有游离氨基的被保护氨基酸上。可选择在有催化剂如1-羟基苯并***（HOBT）或二甲基氨基吡啶（DMAP）存在下进行。其他的方法，例如使被保护的t-Boc-氨基酸的游离羧基形成活性醚、酐或酰基卤，然后可选择地在有碱存在情况下，与被保护的氨基酸的游离氨基反应也是适合的。例如，在有碱例如N-甲基吗啉、DMAP（二甲基氨基吡啶）、或三烷基胺存在下，将一个被保护的Boc-氨基酸或肽在一种无水溶剂例如二氯甲烷或四氢呋喃（THF）中处理，用异丁基氯甲酸酯来形成“活化酸酐”，然后与另一个被保护的氨基酸或肽进行反应。通过这些方法形成的肽可以用一般的技术在氨基或羧基末端选择地去保护，和用类似技术与其他肽或氨基酸耦合。在肽完成之后，可以像前面所描述的那样，去掉保护基团。例如在有钯或铂催化剂的情况下，用在氨液、氢氟酸或强碱中的钠处理进行氢化作用。

在肽去掉保护之后，如果最终的肽含有一个碱性基团，可以制备一种酸加成盐。肽的酸加成盐以标准方式在一种适当的溶剂中由该母体化合物和一种过量的酸制备。这些酸是例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、或甲磺酸。乙酸盐的形式是特别有用的。如果最终的肽含有一种酸性基团，则可以制备阳离子盐。通常将母体化合物用过量碱性试剂处理，例如含有适当阳离子的氢氧化物、碳酸盐或醇盐。阳离子如Na⁺⁺、K⁺、Ca⁺和NH⁺是药用盐中阳离子的实例，最好选用阳离子Na⁺和NH+₄。

概括地说，为了产生刺激作用，本发明的肽可以通过注射或口服，以0.1-10mg的剂量范围，例如每天每70Kg重的人体给1-5mg予病人施用。如果用输注或类似的技术引入体内，则剂量可以为每70Kg重人体使用30-300mg的范围，例如约100mg（在6天中），原则上，希望在病人的细胞外液体中产生约10^-13M-10^-15M的肽浓度。

按照本发明的进一步的特征，提供了药用组合物，该组合物包括一个或几个如前面所定义的结构式（Ⅰ）的化合物或其药用盐作为活性组份，与药用载体或赋形剂相结合。按照本发明所述的组合物，可以以适合于例如口、鼻、非肠道或直肠的施用形式使用。

在此使用的术语“药用的”包括本发明的兽医的应用。

这些肽可以形成胶囊、制片或制成乳剂或糖浆剂用于口服。可加入药用的固态和液态的载体来制备或稳定该组合物，或便利于该组合物的制备。液态载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水和水。固态载体包括淀粉、乳糖、硫酸二水合钙、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、***胶、琼脂或明胶。载体也可以包括一种持续释放材料例如甘油单硬脂肪酯或甘油双硬脂酸酯，单独使用或与一种蜡合用。固体载体的用量可以变化，但是最好是每单位剂量在约20mg到1g之间。该药剂可以用以下药学的常规方法制备，包括碾磨、混合、制粒和压制。必要时作成片剂;或碾磨、混合和充填硬明胶胶囊。当使用液态载体时，可将制剂制备成糖浆剂、酏剂、乳剂或含水或非水的悬浮剂。这样的液体形式可直接用于口服或充填软明胶胶囊。器宫特异的载体***也可以使用。

另一方面本发明的肽或它的衍生物的药用组合物可以制成用于非肠道给药的溶液或冻干粉末。冻干粉在使用前可通过加入适当的稀释剂或其他药用载体回复水份。该液体的配方一般是缓冲的、等渗的水溶液。适当的稀释剂的实例是常规的等渗盐水溶液、规范的5%右旋糖水溶液或缓冲的乙酸钠或铵的溶液。这样的组成特别适用于非肠道给药，但是也可以用于口服或包含在计量给药吸入器或喷雾器中用于吸入。它也可以加入所期望的赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、***胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠或柠檬酸钠。

对于直肠给药，可将本发明的肽的粉末以与赋形剂例如可可油、甘油、明胶或聚乙二醇结合并压制成为栓剂。该粉末也可以与一种油状制剂、凝胶、霜膏或乳剂组合，进行缓冲或不缓冲，并通过一种透皮膏给药。

鼻用喷雾剂可以相似地在水溶液中制备，并且将它装在含有气雾推进剂或提供手动压缩装置的气雾剂容器中。可以制备成含有一种或多种活性组份的胶囊，例如通过将惰性载体如乳糖或山梨糖醇与活性组份混合，并将该混合物充填到明胶胶囊中。

含有本发明化合物的剂量单位最好为0.1-10mg，例如1-5mg的通式（Ⅰ）的肽或它的盐。

按照本发明的进一步特征，还提供一种刺激骨髓细胞生成的方法，其中包括将一个如前面所定义的药物组合物以有效剂量给患者施用。

本发明的另一个特征是提供在免疫抑制患者和正常的动物中治疗病毒、真菌和细菌感染的方法，其中包括给予所需要治疗的动物施用一个有效剂量的如前面所定义的药用组合物。

通式（Ⅰ）的化合物的生物活性通过以下试验来证实。

基质细胞（stromal cell）克隆刺激活性的诱导

人的骨髓基质细胞系C6在塑料组织培养皿中，在RPMI-1640培养基和5%FBS中融合生长。在实验的前一天，将培养基换成没加血清的DMEM。将该化合物加到这些培养液中一小时后，洗涤培养物，用新鲜的DMEM代替该培养基，在37℃，5%CO₂的条件下培养该细胞24小时。24小时后收集C6细胞培养物上清液，无菌过滤、冷冻。直到按如下所述方法测定是否存在血细胞生成克隆刺激活性（CSA）。

软琼脂测试

从路易斯（Lewis）鼠中获得骨髓细胞。在没有血清的DMEM中把它们调节到10⁶细胞/毫升。使用如下的单层琼脂***：用营养素（NaHCO₃、丙酮酸、氨基酸、维生素和HEPES缓冲液）富集的DMEM;0.3%Bacto琼脂和20%路易斯鼠血清，对它加入上面所述的C6细胞系上清液（10-2.5%）以及鼠骨髓细胞（最终浓度＝10⁵细胞/ml）。该琼脂板在37℃，5%CO₂条件下培养7-8天。在显微镜下计数增殖的骨髓细胞（CFU-C）克隆。计数的琼脂克隆的数目是与在C6骨髓基质细胞系上清液中存在的CSA成正比例。

表1

5%的上清液的血细胞生成克隆的刺激活性

剂量对照（pGlu-Glu-Asp）₂-Sub-（LyS）₂

ng/ml 的百分比（实例2）

1000 192

100 241

10 207

1 188

0.1 154

0.01 97

0.001 -

单纯性疱疹鼠模型

在感染前七天，给Balb/c鼠每天一次腹膜内注射0.2ml体积，剂量为10和1ng/Kg的本化合物。对照鼠接受注射稀释缓冲剂、DPBS和0.5%热非活性正常鼠血清的混合物0.2ml。

在鼠的每一个后足肉趾上注射悬浮在0.05毫升PBS中的5.0×10⁵/pfu，使鼠感染单纯性疱疹病毒（菌株MS）。这些鼠继续得到化合物或对照注射，直到垂死（不可给予进食或水）。

或者通过***培育病毒。将含有5.0×10⁵/pfu的MS-NAP菌株的棉塞***鼠的***。

用Wilcoxin试验测定生存者在治疗组与对照组中是否显著性增加。

念珠菌的攻击

用白色念珠菌菌株B311a。该菌株是通过鼠传代然后在-70℃温度下冷冻。B311a对于免疫抑制鼠在5.0到8.0×10⁴Cfu/鼠的范围内有毒力，而对于正常鼠是1.0～2.0×10⁵cfu/鼠的范围。将冷冻的念珠菌原种的一个样品在Sabouraud右旋糖斜面上培养，然后取出50ml震荡培养Sabouraud培养液18小时。洗涤细胞三次，然后用血细胞计数器计数。并用亚甲基染料的不相容性进一步证实其存活性。在接种物上进行存活性计数，进一步确定其数量。

用悬浮在0.2ml盐水中的细胞静脉注射念珠菌使所有的鼠（Bal b/c）感染。一些鼠用300拉德的辐射使其产生不致命的骨髓抑制。辐射之后的开始两小时，给这些动物每天注射化合物CSF作为阳性对照，或注射赋形剂。辐射和治疗开始后七天，静脉注射白色念珠菌，对这些鼠进行攻击。注意对于正常的鼠这大约相当于LD₇₅。在其他研究对象中，鼠不被免疫抑制。在这些研究对象中，象被辐射的鼠一样，以同样的方式在感染后最初七天治疗这些鼠。观察这两个模型中的鼠直到垂死。用wilcoxin试验比较存活率的不同。

以下的实例用以说明本发明。这些实施例不限制本发明的范围，但是展示了本发明化合物的制备和使用。

在这些实例中，所有温度均是摄氏度。氨基酸分析是在Dionex Autoion 100上完成的。肽含量分析基于氨基酸分析。使用快原子轰击在VG ZAB质谱仪上进行FAB质谱测定。所使用的缩写如下：

Arg＝精氨酸

Asp＝天冬氨酸

t-BOC＝叔丁氧基羰基

Bz＝苯甲基

Cl-Z＝对-氯羧苄氧基羰基

（Z＝羧苄氧基羰基）

DCC＝二环己基碳化二亚胺

DIEA＝二异丙基乙胺

EDC＝（N-乙基-N′-（3-二甲基氨基丙基）

碳化二亚胺

Glu＝谷氨酸

p-Glu＝焦谷氨酸

Tyr＝酪氨酸

Hna＝二氨基己炔酸

HOBT＝羟基苯并***

Lys＝赖氨酸

NMP＝N-甲基-2-吡咯烷酮

Pro脯氨酸

Gln＝谷氨酰胺

Cys＝半胱氨酸

Pim＝

（二氨基庚二酸）

Sub＝

（二氨基辛二酸）

Adp＝

N-MeArg＝N-甲基精氨酸

Prc＝双Boc-S，S′-1，3-丙烷二基半胱氨酸

Etc＝双Boc-S，S′-1，2-乙烷二基半胱氨酸

Buc＝双Boc-S，S′-1，4-丁烷二基半胱氨酸

实例1

制备：（p-Glu-Glu-Asp）₂-Pim-（Lys）₂

半克t-Boc-Lys（Cl-Z）-OCH₂-Pam树脂（0.63mmol/gm）装载到博克曼（Beckman）990B合成器的反应容器中，在去除保护的步骤中，用在二氯甲烷（CH₂Cl₂）中含40%的三氟乙酸（TFA）去除t-Boc基然后用10%的DIEA/CH₂Cl₂中和三氟乙酸盐。使用2mM DDC和HOBT耦合2mM（780mg）的双-Boc-2，6-二氨基庚二酸。耦合是在15ml CH₂Cl₂和10ml DMF的混合物中，在室温下进行2小时。凯色（Kaiser）的试验惯用于监视该耦合。对剩余的游离羧基用3mM（1.65mg）的H-Lys（Z）-OBz、HCl和3mM的DCC和3mM的HOBT在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中进行二次酰胺化作用。

耦合2小时之后，该树脂用15ml的CH₂Cl₂洗涤二次，用15ml的DMF洗二次，用15ml的MeOH/CH₂Cl₂（1∶1）洗二次，最后用15ml的CH₂Cl₂洗二次。在对t-Boc使用40%TFA/CH₂Cl₂去保护并用10%DIEA/CH₂Cl₂中和之后，加入2mM（0.646gm）的Boc-Asp（Bzl）和2mM的DCC以及2mM的HOBT，在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中耦合两小时。然后如前所述的那样对树脂进行洗涤步骤。重复去保护步骤和中和作用步骤后在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中耦合2mM（0.674gm）的BoC-Glu（Bzl），2mM DCC和2mM的HOBT。在洗涤，去保护和中和作用步骤之后，再与2mM（0.258gm）的pGlu、2mM的DCC和2mM的HOBT在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中耦合两小时，然后将树脂进行一次洗涤步骤。通过Kaiser的试验监视耦合的完成，并且在每一步上只需要单偶合。在合成完成之后，树脂被干燥和称重。产量：1.2g。

将该肽树脂（1.2g）装入一个裂化装置，在-15℃条件下用10ml的氢氟酸（HF）和1ml苯甲醚进行两小时裂解。在真空条件下去除HF之后用醚彻底地洗涤树脂和肽的混合物，在冰醋酸（30ml）中提取肽。在一个旋转蒸发器（rotavap）上从提取液中去除大部分酸，残留物在水中稀释并冷冻干燥。乙酸提取液具有810mg粗制肽。

从乙酸提取液中获得的粗制肽（80mg）用制备C-18柱进一步提纯，使它流过一个预平衡（在0.1%TFA/H₂O中）的柱。采用一种线性梯度的80%乙腈、20%H₂O和0.1%TFA洗脱该肽。

三个同分异构体同时被洗脱（8.52min）。在C-18柱上用30%（0.1%TFA在CH₃CN中），70%（0.1%TFA在水（H₂O）中）到80%（在CH₃CN中0.1%的TFA）、20%（0.1%TFA在H₂O中）的梯度在流速为1.5ml/min进行35分钟条件下，对他们进行分离。洗脱得下列组分：

组份1：18.69min

组份2：19.68min

组份3：22.95min

氨基酸的分析给出下列结果：

氨基酸分析观察值

Glu 1.99

Asp 1.0

Lys 1.05

二氨基庚二酸未测

质谱＝1157.5（M+H）⁺

实例2

（pGlu-Glu-Asp）₂-Sub-（Lys）₂的制备

A.BOC-SUB-Lys-（ε-Z）COOBz的合成：

Bis-Boc（1，1）二氨基辛二酸用R.Nutt的方法合成（J.Org.Chem.45，3078，1980）。

2mM的Boc-Sub（808mg），4mM的Lys-（ε-Z）-COOBz.HCl（1.56g）和4mM的HOBT（0.613g）溶解在10ml的二氯甲烷（CH₂Cl₂）中，将该溶液用冰/丙酮浴冷冻到-15℃。加入4mM（0.692ml）的二异丙基乙胺（DIEA）随后加入0.772g（4mM）水溶性碳化二亚胺（EDC）。搅拌一小时之后，将该混合物加温至室温，三小时之后蒸发掉二氯甲烷，将残留物在200ml的乙酸乙酯中溶解。该溶液首先用1N HCl洗涤，随后用1N NaOH、饱和NaCl溶液和水洗涤，这样的洗涤重复三次，每次洗液约100ml。有机层用MgSO₄干燥并且蒸干。未进一步的纯化。1.86克的BOC-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz（产率79%）被获得和使用。B.BOC Asp-（β-OBz）Sub Lys-（ε-Z）-COOBz.的合成：

在4N HCl-二恶烷中溶解Boc-Sub-Lys-（ε-Z）-COOBz（1.8g）半小时，然后蒸发至干。用醚洗涤剩余物，干燥过夜。将该盐酸盐溶解在30ml的CH₂Cl₂中，且加入BOCAsp-（β-OBz）（1.292g）。将该溶液冷冻至-15℃，加入0.613g HOBT，0.554ml DIEA和0.772g EDC。搅拌两小时之后，该混合物升温至室温。18小时之后（过夜）处理该反应混合物，蒸发掉CH₂Cl₂把剩余物溶解在200ml的乙酸乙酯中。该溶液用1N HCl，1N NaOH，饱和NaCl溶液和水洗涤（洗涤重复三次，每次洗液约100ml）。该有机层用MgSO₄干燥并且将蒸发。BOC-Asp-（β-OBz）-Sub-Lys-（ε-Z）COOBz 1.9g（产率73%）。未进一步提纯，这个肽即被使用。

C.BOC-Glu-（γ-OBz）Asp-（β-OBz）Sub-Lys-（ε-z）COOBz.的合成：

在15ml的4N HCl二恶烷中溶解1.8g BOC-（β-OBz）Asp-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz。15分钟之后去除溶剂和用醚洗涤剩余物，并干燥。在15ml的N-甲基吡咯烷酮（NMP）中溶解该盐酸盐。把该溶液冷冻至-15℃，且加入4mM（1.338）的BOC-Glu（γ-OBz），0.204mlDIEA，0.772g EDC和0.612g的HOBT。将该混合物搅拌过夜，逐渐升温至室温。该反应混合物加到含有1升冷冻的10%Na₂CO₃在饱和NaCl溶液中的烧瓶中。过滤该沉淀物，用水洗涤，且在真空条件下干燥。不作进一步提纯。获得BOC-（γ-OBz）Glu-（β-OBz）Asp-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz（1.3g），备用，产率：68%

D.pGlu-（γ-OBz）Glu-（β-OBz）Asp-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz的合成：

在15ml的4N HCl二恶烷中溶解1.2g BOC-（γ-OBz）Glu-（β-OBz）Asp-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz。15分钟后，去除溶剂，用醚洗涤该剩余物并干燥。在15ml的NMP中溶解该盐酸盐。冷冻该溶至-15℃、且加入4mM（0.516g）Pyro-Glu（p-Glu），0.106ml DIEA、0.772gEDC和0.612g的HOBT。将该混合物搅拌过夜，而逐渐将其升温至室温。将该反应混合物加到一个含有一升冷冻的10%Na₂CO₃（在饱和NaCl溶液中）的烧瓶中。过滤该沉淀物，用水洗涤，且在真空条件下干燥。未进一步提纯，获得（0.830g）pGlu-（γ-OBz）-Glu-（β-OBz）Asp-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz。备用。产率：69%

E.pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH的合成：

pGlu-（γ-OBz）Glu-（β-OBz）Asp-Sub-（ε-Z）Lys-COOBz（0.200g）使用5ml HF/1.5ml苯甲醚在0℃条件下去保护。去除HF，且在醚和0.1N乙酸之间分配该肽。含水层被洗涤和冷冻干燥。获得0.089g的pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH。该肽20mg在C18制备性Vyadec柱上，使用isocratic条件（10%乙腈，90%水和0.1%三氟乙酸，流速5.6ml/min），进行提纯。FAB质量：M+H＝1171.4。氨基酸分析：Asp（1.0），Glu（2.19），Lys（1.01），Sub N.D。HPLC：在C18 Vyadec 0.23×25mm分析柱上的保持时间7.01分钟（流速为1.5ml梯度0%至80%B A＝0.1%TFA在水中，B＝0.1%TFA在乙腈中）。

实例3

（pGLu-Glu-Asp）₂-Lan-（Lys）₂的制备

〔Lan＝羊毛硫氨酸（SCH₂CH（NH₂）COOH）〕

0.5克的t-BOC-Lys（Cl-Z）-CH₂PAM（0.63mm/g）装入Beckman 990合成器的反应容器中。用在二氯甲烷中的40%TFA去除t-BOC基。用10%DIEA/CH₂Cl₂中和三氟乙酸盐。在室温条件下在15ml的CH₂Cl₂和10ml的DMF中用4mM的DCC和HOBT偶合2mM的Bis Boc羊毛硫氨酸。使用Kaiser试验监视其偶合。在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中使用3mM的H-Lys-O-Bz·HCl;和3mM的DCC以及HOBT酰胺化游离的剩余羧基。在该偶合树脂用CH₂Cl₂，30%MeOH-CH₂Cl₂，和CH₂Cl₂（25ml×3）彻底洗涤之后，用目的肽中其余的氨基酸（Asp，Glu，pGlu）重复去保护、中和和偶合这一循环。把4mM的每一个氨基酸、DCC和HOBT用于每一个偶合。用Kaiser试验监视每一个偶合。在合成完成之后，干燥和称重该树脂。

把上述肽树脂装入裂解装置中，在-15℃条件下用10ml的氢氟酸（HF）和1ml的苯甲醚裂解二小时。在去掉HF之后，用醚彻底洗涤该树脂，用冰醋酸（30ml）提取肽。在旋转蒸发器（rotavap）上去掉大部分醋酸，余留物在水中稀释和冷冻干燥。在用HPLC纯化之后，获得肽。

实例4

制备（Pro-Asp-Asp）₂-Sub-（Lys）₂

把0.5克的t-BOC-Lys（Cl-Z）-CH₂·Pam（0.63mM/g）装入Beckman 990合成器的反应容器中。在二氯甲烷中用40%TFA去除t-BOC基团。用10%DIEA/CH₂Cl₂中和该三氟乙酸盐，在室温条件下，在15ml的CH₂Cl₂和10ml的DMF中用4mM的DCC和HOBT偶合2mM的BisBOC二氨基辛二酸。用Kaiser试验监视其偶合。在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中用3mM的H-Lys-O-Bz·HCl;和3mM的DCC以及HOBT酰胺化剩余的游离羧基。偶合之后，用CH₂Cl₂、30% MeOH-CH₂Cl₂，和CH₂Cl₂，和CH₂Cl₂（25ml×3）彻底洗涤该树脂。用目标肽中其余的氨基酸（Asp，Asp和Pro）重复去保护、中和，以及偶合这一循环。把4mM氨基酸、DCC和HOBT用于各次偶合。每一次偶合均用Kaiser试验监视。在合成完成之后，干燥和称重该树脂。

上述肽树脂装入裂解装置中，在-15℃温度条件下用10ml的氢氟酸（HF）和1ml的乙腈裂解二小时。去除HF之后，用醚彻底洗涤该树脂，用冰醋酸（30ml）提取肽。在一个旋转蒸发器（votavap）上去除大部分乙酸，用水稀释其剩余物并且冷冻干燥。过HPLC提纯作用之后，获得肽。

实例5

制备（pGlu-Asp-Asp）₂-Pim-（Lys）₂

0.5克的BOC-Lys（Cl-Z）-CH₂PAM（0.63mM/g）装入一个Beckman 990合成器的反应容器中。用在二氯甲烷中的40%TFA去除t-BOC基。用10%DIEA/CH₂Cl₂中和三氟乙酸盐。在室温条件下，在15ml的CH₂Cl₂和10ml的DMF中使用4mM的DCC以及HOBT偶合2mM的Bis Boc庚二酸，用Kaiser试验监视其偶合。在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中用3mM的H-Lys-O-Bz·HCl;3mM的DCC和HOBT酰胺化游离的剩余羧基。偶合之后，用CH₂Cl₂，30%MeOH-CH₂Cl₂，和CH₂Cl₂（25ml×3）彻底洗涤该树脂。用目的肽中剩余的氨基酸（Asp，Asp和p-Glu）重复去保护、中和作用和偶合循环。把4mM的氨基酸、DCC和HOBT用于每一次偶合，用Kaiser试验监视每一次偶合。在合成完成之后，干燥和称重该树脂。

把上述树脂装入裂解装置，在-15℃条件下，用10ml的氢氟酸（HF）和1ml的苯甲醚裂解二小时。在去除HF之后，用醚彻底洗涤该树脂和用冰醋酸30ml提取肽。在一个旋转蒸发器（Votvap）上去除大部分乙酸，在水中稀释其剩余物且冷冻干燥。在通过HPLC提纯作用之后，获得肽。

实例6

（pGlu-Glu-Asp）₂-Pim-（Arg-CONH₂）₂的制备

0.5克的BOC-Tos Arg-BHA（0.5mM/g）被装入Beckman 990合成器的反应容器中，用在二氯甲烷中的40%TFA去掉BOC基。用10%的DIEA/CH₂Cl₂中和三氟乙酸盐。在15ml的CH₂Cl₂和10ml的DMF中在室温条件下用2mM的DCC和HOBT偶合1mM的Bis BOC庚二酸。用Kaiser试验监视其偶合，在25ml的CH₂Cl₂/DMF（15/10）中用3mM的H-Lys-OBz·HCl;和3mM的DCC和·HOBT使游离的剩余羧基酰胺化。偶合之后，用CH₂Cl₂，30%MeOH-CH₂Cl₂和CH₂Cl₂（25ml×3）彻底洗涤该树脂。用目标肽中其余的氨基酸（Asp，Glu和pGlu）重复去保护、中和和偶合循环，把3mM的氨基酸、DCC和HOBT用于每一次偶合。用Kaiser试验监视每一次偶合，在合成完成之后，干燥和称重该树脂。

将肽树脂装入一个裂解装置中，在-15℃条件下用10mM的（HF）氢氟酸和1ml的苯甲醚裂解二小时。去掉HF之后，用醚彻底洗涤该树脂，用冰醋酸（30ml）提取肽。在旋转蒸发器（votavap）上去除大部分的乙酸，在水中稀释其残余物并且冷冻干燥。在用HPLC提纯之后，获得肽。

实例7

含有酪氨酸的类似物的合成：

（Tyr-Glu-Asp）₂-Sub-（Lys）₂;

（pGlu-Tyr-Glu-Asp）₂-Sub-（Lys）₂;

（pGlu-Glu-Tyr-Asp）₂-Sub-（Lys）₂;

（pGlu-Glu-Asp-Tyr）₂-Sub-（Lys）₂。

2克的BOC-Lys（Cl-Z）-O-树脂（PeninsulaLabs

，取代0.49mM/g）装入一个手动震摇器的容器中。在去保护和中和作用步骤之后，用4mM（824mg）的二环己基碳二亚胺（DCC）和4mM（612mg）的1-羟基苯并***水合物（HOBT）在25ml的50%N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）和二氯甲烷（DCM）中，把2mM（808mg）的di-BOC二氨基辛二酸偶合到树脂上，使反应进行过夜随后加入10mM（4.06g）H-Lys（Z）-OBz·HCl，10mM（1.29g）二异丙基乙胺（DIEA），10mM（2.06g）DCC和10mM（1.53g）HOBT。在两小时之后，使用在NMP/DCM（1∶1）中的乙酸酐覆盖未反应的氨基酸。把近三分之一的所得的BOC-Sub-Lys-树脂转移到另一个反应容器中。树脂多的部分称为部分Ⅰ，少的部分称为部分Ⅱ，在部分Ⅱ中采用标准的去保护，中和，和偶合循环把BOC-Tyr（Br-Z），BOC-Asp（OBz），BOC-Glu（OBz），和p-Glu耦合到树脂上。使用5mM的氨基酸、DCC和HOBt，在25ml NMP/DCM（1/1）中进行偶合，且用Kaiser试验监视偶合的合成，在部分Ⅰ中把5mM的BOC-Asp（OBz）耦合到树脂上。所得BOC-Asp-Sub-Lys树脂的四分之一被移到另一个容器中（部分Ⅲ）。剩余的树脂被称为部分Ⅳ。在部分Ⅲ中采用标准的去保护、中和和偶合循环把BOC-Tyr（Br-Z），BOC-Glu（OBz）、和p-Glu偶合到树脂上。使用5mM的氨基酸、DCC和HOBt。在25ml NMP/DCM（1/1）中进行偶合和用Kaiser试验完成对偶合的监视。在多的部分（部分Ⅳ）中把5mM的BOC-Glu（OBz）偶合到树脂上。把该树脂的三分之一转移到另一个容器中，且把5mM的p-Glu偶合到这部份（部份Ⅵ）上合成pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-树脂。把5mM的BOC Tyr（Br-Z）偶合到多的部分（部分Ⅴ）上，且把该树脂进一步分成两半。一半树脂照现在的样子留下，而另一半树脂（部分Ⅶ）与5mM的p-Glu偶合，导致在p-Glu-Tyr-Glu-Asp-Sub-Lys-树脂中的合成。在说明书附图中用图解来进行描述。这些树脂多肽被去掉保护，且在0℃条件下用HF/苯甲醚裂解一小时。在C-18Vydac 2.5cm×30cm的制备柱上用水/0.1%三氟乙酸（TFA）和乙腈/0.01%TFA缓冲剂***对粗制肽（近100mg）提纯。

实例8

（pGlu，Glu Asp）₂Prc（Lys）₂的制备

a）双BOC-S，S′-1-3-丙烷二基半胱氨酸的合成：

用干燥的氨饱和3ml的甲醇，加入在0.5ml甲醇中的0.5g BOC一半胱氨酸，随后加入0.35ml的1，3二溴丙烷。10分钟后，再加入在0.5ml甲醇中的0.5g的BOC一半胱氨酸。4.5小时之后，蒸发其溶剂，将油性剩余物溶解在水中。溶液PH值被调节到9，且用醚提取溶液。水层被酸化到PH2，并用乙酸乙酯提取，把有机层干燥和蒸发，得到1.12g双BOC-S，S-1，3-丙烷二基半胱氨酸。未进行进一步纯化。使用该氨基酸，FAB/MS M+H＝469。

b）（pGluGluAsP）₂Prc（Lys）₂的制备：

把BOC-Lys树脂（0.53g，取代0.63mM/g）装入一个手动震摇器中，在去保护和中和作用循环之后，在10mlNMP/DCM（1/1）中用1mM（206mg）DCC和1mM（153mg）HOBt偶合双BOC-S，S′-1，3丙烷二基半胱氨酸（290mg，0.6mM）。两小时后，用NMP和DCM洗涤该树脂。加入2mM（765mg）的H-Lys（Z）-OBz随后装入在4ml的NMP/DCM（1/1）中的1.5mM（390mg）DCC和1.5mM（230mg）的HOBt。18小时后，用20ml NMP和DCM洗涤该树脂。为偶合BOC-Asp（OBz），BOC-Glu（OBz）和p-Glu重复一般的去保护，中和以及偶合的循环，使用1mM的氨基酸，DCC和HOBt。在5ml的NMP/DCM（1/1）中进行偶合。用Kaiser试验监视该偶合的完成。把所得的树脂肽（416mg）去掉保护，在0℃条件下，用0.5ml的苯甲醚和8ml的HF裂解二小时。把HF蒸发，用醚洗涤树脂混合物，且用冰醋酸提取，在冷冻干燥之后，获得130mg的粗制肽。在C-18 Vydac制备柱上用乙腈-水（0.1%TFA）缓冲***提纯上述粗制肽（61.5mg）。获得纯肽16.5mg。

FAB/MS：M+H1249.3

氨基酸分析：

AsP 2.0（2）

Glu 4.28（4）

Dpc 1.14

Lys 1.96（2）

实例9和10

按照上述制备双BOC-S，S′-1，3-丙烷二基半胱氨酸（Prc）的方法制备双BOC-S，S′-1，2-乙烷二基半胱氨酸（Etc）和双BOC-S，S′-1，4-丁烷二基半胱氨酸（Buc）。

按照上述制备（pGlu Glu Asp）₂Prc（Lys）₂的方法，制备30mg的（pGlu Glu Asp）₂Etc（Lys）₂和17mg的（pGlu Glu Asp）₂Buc（Lys）₂。

实例11

（pGlu-Glu-Asp）₂Sub（N-MeArg）₂的合成

将羟基甲基树脂0.5g（0.45meg/g）悬浮在DCM（5ml）中，且与0.5mM（221mg）BOC-NMeArg，0.5mM（61mg）二甲基氨基吡啶，和0.5mM（103mg）DCC起反应，用DCM（3X），NMP（3X），和DCM（4X）洗涤己酰胺代的树脂。在20ml的DCM中用0.5ml的异氰酸苯酯覆盖未反应的羟基。用DCM和NMP彻底洗涤该树脂。用40%TFA/DCM去掉BOC基，用在DCM0.05mM（20.2mg）中的10%DIEA中和之后，用0.125mM（25.7mg）的DCC和0.125（19.1mg）mMHOBt偶合BOC-Sub。72小时之后，用NMP和DCM洗涤该树脂。重复一般的去保护、中和作用以及偶合循环进行BOC-Asp（OBz），BOC-Glu（OBz）和p-Glu的偶合。使用1mM的氨基酸、DCC和HOBt。在5ml的NMP/DCM（1/1）中进行偶合，用Kaiser试验监视该偶合的完成。上述所得的树脂肽（484mg）被去掉保护。且在0℃条件下用0.5ml的苯甲醚和10ml的HF裂解2小时。把HF蒸发，用醚洗涤上述肽树脂混合物，且用冰醋酸提取。在冷冻干燥之后，获得12.5mg的粗制肽。在C-18Vydac制备柱上用乙腈-水（0.1%TFA）缓冲剂***提纯上述粗制肽（6mg）。获得2.2mg的纯肽。

实例12

（pGlu-Glu-Asp）₂Sub（Hna）₂的合成

羟基甲基树脂0.5g（0.45meq/g）悬浮在DCM（5ml）中，且与126mg（0.335mM）2，N-BOC-6，N-Z-2，6二氨基-4-己炔酸（Hna），40mg（0.335）二甲基氨基吡啶（DMAP），69mg（0.335）DCC和50mg（0.335）HOBt起反应。用DCM（3X），NMP（3X），和DCM（4X）洗涤该酰胺代的树脂。在20ml的DCM中用0.5ml异氰酸苯酯覆盖未反应的羟基。用DCM和NMP彻底洗涤该树脂。用40%TFA/DCM去除BOC基。用在DCM中的10%DIEA中和之后，用50mg（0.22mM）的DCC和33.6mg（0.11mM）HOBt偶合BOC-Sub 44mg（0.11mM）。16小时之后，用NMP和DCM洗涤该树脂。重复常规的去保护，中和作用以及偶合的循环对于BOC Asp（OBz），BOC-Glu（OBz）和p-Glu进行偶合。使用1mM的氨基酸，DCC和HOBt，在5ml的NMP/DCM（1/1）中进行偶合，用Kaiser试验监视其偶合的完成。将所得的树脂肽（608mg）去掉保护，且在0℃条件下用0.6ml苯甲醚和10ml的HF裂解2小时。蒸发掉HF，用醚洗涤该肽树脂混合物，且用冰醋酸提取。在冷冻干燥之后，获得93.7mg的粗制肽。在C-18Vydac制备柱上用乙腈-水（0.1%TFA）缓冲***提纯上述粗制肽（20.6mg）。获得7.5mg的纯肽。分析氨基酸和确定其结构。

FAB/MS：M+H 1163

氨基酸分析

Asp 2.0（2）

Glu 4.01（4）

Sub 2.01（1）

Hna 1.44（2）

实例13

（pGlu-Glu-Asp）₂Adp（Lys）₂的合成

a）双BOC2，5（S，S）二氨基己二酸的合成。用R.Nutt的方法（J.Org.Chem.45，3078，1980）合成双-BOC·2，5（S，S）二氨基己二酸，将192mgNaOCH₃和57.56g BOC-Asp（OBz）加入到240ml甲醇和80ml吡啶的混合物中。当该溶液均匀后，将其反应混合物冷却到0℃。用铂电极，将约1.5安的电流（100伏）通过该反应混合物，溶液的温度保持在15℃和25℃之间。通过TLC（三氯甲烷∶甲醇∶乙酸/95∶4∶1）使起始物质消失。5小时之后，终止反应。在旋转蒸发器（rotavap）上去除溶剂。其油性褐色剩余物溶解在150乙酸甲酯中。该溶液在室温下放置18小时，通过过滤，去除沉淀物，蒸发滤液，获得双BOC2，5二氨基辛二酸的粗制二苄基酯（61.7g）。在己烷中将61g的粗制产品装入硅胶柱上。顺序地用在己烷中的10%，20%，25%和30%的乙酸乙酯洗脱这个柱。用TLC分析组分。把含有期望产品的各组分汇集起来。在旋转蒸发器（rotavap）上去掉溶剂。在真空中干燥上述纯化的产品（3.78g）。把3g二苄基酯溶解在120ml的甲醇中，且在帕尔（Parl）装置中用378mg的10%Pd/活性炭氢化。在5小时完成氢化。过滤该溶液，在旋转蒸发器（rotavap）上浓缩其滤液。粗制的双BOC2，5-二氨基己二酸用三氯甲烷装填，用快速硅胶色谱法纯化。顺序地用98∶2∶0.1，98∶2∶0.5，95∶4∶1，90∶8∶2，85∶10∶5和70∶20∶10的三氯甲烷，甲醇和乙酸洗脱该柱。把含有所期望的产品的各个部分汇集起来，在一个旋转蒸发器（rotavap）上浓缩，在真空中干燥残留余物（1.07g）。用NMR、以及质谱数据确定其产品结构。

b）（pGlu·Glu AsP）₂AdP（Lys）₂的合成

0.5克BOC-Lys（Cl-Z）-PAM树脂（0.63mM）装入一手动震摇器的容器中，在二氯甲烷中用40%TFA去掉BOC基。用10%DIEA/DCM中和三氟乙酸盐。在15ml DCM和15ml NMP中用4mM DCC和HOBt偶合2MM的双Boc2，5二氨基己二酸（AdP）。在30ml DCM/NMP（1/1）中用3mM H-Lys（Z）-OBz和3mM DCC及HOBt酰胺化游离的羧基。偶合之后，用DCM，NMP彻底地洗涤该树脂，用目的肽中其余的氨基酸（Asp，Glu和pGlu）重复去保护、中和作用和偶合循环。4mM的各种氨基酸、DCC和HOBt用于各次偶合。用Kaiser试验监视每一次偶合的完成。在合成完成之后，把该树脂肽装入裂解装置中，且在-15℃条件下用10ml HF和1ml苯甲醚裂解两小时。去除HF之后，用醚彻底洗涤该树脂，和在冰醋酸中提取肽。在旋转蒸发器（rotavap）上去除大部分乙酸，用水稀释其剩余物和冷冻干燥。通过HPLC纯化作用之后，获得所期望的肽。

Claims

1、一种用于制备公式Ⅰ的化合物或它的一种药用盐的方法：

其中：

Y₁和Y₂独立地各自为CH₂或S

X是0，1，2，3或4

m是0，1或2

n是0，1或2，

A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸；

B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；

C是谷氨酸，酪氨酸或天冬氨酸；

D是赖氨酸，精氨酸，酪氨酸，N-甲基精氨酸，二氨基己炔酸或羧基酰胺，或其羟基甲基衍生物。

E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或一个肽键。

并规定：

当Y₁和Y₂是S时，X是2，3或4，m和n是1，或

当Y₁和Y₂是CH₂时，X是0，1或2，m和n是0，或

当Y₁是S或Y₂是CH₂时，X是0，n是1，或当Y₂是S并且Y₁是CH₂时，X是0，m是1；

该方法包括：

a)偶合被保护的氨基酸来形成一种适当的被保护的下式所示的化合物：

其中A、B、C、E、Y₁、Y₂、m、x和n是与上述公式I所定义的一样，而[D′]是氯甲基、甲基二苯甲基胺、二苯甲基胺或苯乙酰胺甲基树脂，或D如上述公式Ⅰ所定义的一样。

b)去除保护基，若需要，从树脂上裂解肽；和

c)选择性地形成它的药用的盐。

2、如权利要求1用于制备一种化合物的方法，其中Y₁和Y₂是CH₂。

3、如权利要求1的方法，其中X是1或2。

4、如权利要求1的方法，其中Y₁是硫。

5、如权利要求1的方法，其中Y₁和Y₂是硫。

6、如权利要求1的方法，其中A是焦谷氨酸、B是谷氨酸、C是天冬氨酸、D是赖氨酸和E是一个肽键。

7、如权利要求1的方法，用于制备一种（pGlu-Glu-Asp）₂-Pim-（Lys）₂的化合物。

8、如权利要求1的方法，用于制备一种（pGlu-Glu-Asp）₂-Sub-（Lys）₂的化合物。

9、按照权利要求1的一个化合物，选自于下列一组化合物：

（Tyr-Glu-Asp）₂Sub（Lys）₂

（pGlu-Tyr-Glu-Asp）₂Sub（Lys）₂

（pGlu-Glu-Tyr-Asp）₂Sub（Lys）₂

（pGlu-Glu-Asp-Tyr）₂Sub（Lys）₂

（pGlu-Glu-Asp）₂Sub（N-MeArg）₂

（pGlu-Glu-Asp）₂Sub（HNA）₂

（pGlu-GluAsp）₂Prc（Lys）₂

（pGluGluAsp）₂Etc（Lys）₂

（pGluGluAsp）₂Buc（Lys）₂

10、一种用于制备药用组合物的方法，其中包括把如权利要求1所定义的公式Ⅰ的化合物或它的药用盐与一种药用载体结合在一起。

11、如权利要求1所定义的公式1的化合物或它的药用盐在生产刺激骨髓细胞生成***的药物中的使用。

12、使用公式Ⅰ的化合物或一种药物治疗病毒、真菌和细菌的感染。