CN105473737A - 用于检测细菌污染的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测细菌污染的组合物、反应混合物、试剂盒和***,及其使用方法。
Description
交叉引用
本申请要求2014年7月25日提交的美国临时申请号61/858,495的权益,该申请通过引用全文并入本文。
发明背景
移植组织和输血制品的微生物污染是重要的医学问题。血库面临在释放每个血小板袋以输注到患者体内前检测其微生物污染的巨大挑战。该挑战的一部分与血小板样品相对较短的贮藏期(通常5-7天并且有时更短)有关。标准储存条件使关于血小板的挑战进一步复杂化。与大多数其他的可移植组织不同,血小板不能耐受冷冻,并且如果经受即使非常短时间的冷却,血小板也会从接受者的循环中迅速消失。这种对血小板存活的冷却效应被认为是不可逆的,并且使得血小板不适合于输血。当血小板暴露于低于20℃的温度时,它们迅速经历指示损伤的形状改变。在输血前保持血小板在室温(例如,22-25℃)下的需求已导致了针对血小板储存的一套独特的昂贵且复杂的物流需求。由于血小板在室温下是代谢活性的,因此它们通常在气体可透过的容器中经受恒定的搅拌以允许气体交换,从而防止代谢性酸中毒的毒性后果。这些储存条件促进细菌的生长,从而造成细菌感染的更高风险。由于依赖于培养检测的筛选方法可能花费比可用贮藏期更长的时间来检测污染,因此污染的血小板经常被输注至患者体内,而随后在培养结果变得可获得时医师才得知血小板已被污染。在美国血库协会(AmericanAssociationofBloodBanks)(A.A.B.B.)标准5.1.5.1下,要求血库或输血机构采用有关方法来限制和检测在所有血小板浓缩物中的细菌污染。然而,用细菌污染的血小板输血的风险可能高达千分之一,且可能这些事件的10%-25%对患者产生不利影响。尽管一些污染可能来源于供体菌血症,但在收集时由皮肤上或血包中存在的细菌引起的污染是无法通过供体诊断筛选而解决的污染的主要来源。
减轻污染的常用方法包括预防措施(例如,手臂清洗、转移采集的血液的第一部分以及过滤)和培养方法。如由目前的污染速度所证明的,这些程序仍然是不充分的。而且,由于基于培养的检测方法需要大量的温育时间(有时数天),因此样品可能在其有效寿命的大部分时间中不能使用,并且当样品被使用时,检测可能没有完成。对于由相对缓慢生长的细菌引起的污染尤其如此。例如,使用标准的培养方法,已估计得到芽孢杆菌属的种(Bacillussp.)、葡萄球菌属的种(Staphylococcalsp.)、链球菌属的种(Streptococcalsp.)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、变异库克菌(Kocuriavarians)、棒状杆菌属的种(Corynebacteriumsp.)和丙酸杆菌属的种(Propionibacteriumsp.)的平均检测时间分别为24小时、27小时、34小时、47小时、56小时、87小时和97小时。
一种可商购的试验被称为BacT/ALERT试验(bioMérieux,Inc.,Durham,N.C.)。细菌检测基于增殖细菌的二氧化碳释放。在培养瓶底部的二氧化碳敏感的液体乳液传感器改变颜色并通过传感器上所反射的光的改变而进行检测。用于细菌检测的另一种方法涉及测量血小板制备样品中的氧气含量。一个实例是PalleBDS试验(PallCorporation,PortWashington,N.Y.)。用于检测的方法将样品袋内空气的氧气含量测量为细菌的替代标志物。使用氧气分析仪来测量具有血小板的袋或包的顶部空间气体中氧气的百分比。如果在采集的血小板样品中存在细菌,则温育期间通过样品中细菌的代谢活性和增殖将消耗增加量的氧气,导致血浆以及样品袋内的空气的氧气含量的可测量减少。尽管细菌生长的非特异性测量允许检测许多种细菌,但其灵敏度相对较低并且需要较长的温育时间。
标准的基于培养的筛选的替代方法包括细菌抗原检测和基于核酸的筛选。基于抗原的方法的主要限制是它们无法直接应用于检测细菌病原体谱未知的样品。已经提出常见细菌核酸序列如16SrRNA的检测来实现更广谱的检测,但这类方法目前被认为灵敏度和特异性低于当前的培养方法并且不适合于血小板样品的早期检测。
发明内容
本公开内容提供了用于检测生物样品如血小板样品的污染的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和***,其既具有宽范围又具有高检测特异性和灵敏度。根据本公开内容的污染检测还显著快于基于培养的筛选方法。
在一个方面,本公开内容提供了检测样品的细菌污染的方法,该细菌污染由多种细菌物种如至少八种细菌物种中的任何物种所引起。在一个实施方案中,该方法包括:在单个反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且所述保守序列在至少八种细菌物种中是相同的;以及检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的杂交产生可检测信号,该可检测信号指示由所述至少八种细菌物种中的任何物种引起的样品的细菌污染。在一些实施方案中,所述样品是血液样品或血沉棕黄层样品,并且所述污染是受试者的脓毒症的预测或诊断。在一些实施方案中,所述样品是血小板样品。在一些实施方案中,所述血小板样品是通过单采术分离的血小板浓缩物。在一些实施方案中,使从少于5mL的血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。在一些实施方案中,所述扩增子由细菌16SrRNA多核苷酸模板产生。在一些实施方案中,所述细菌污染的检测在向接受者输注之前完成。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的不超过300个碱基或不超过150个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的100-200个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所有的细菌物种均为使用具有不同的可检测标记物的探针在同一反应中检测到的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、或两者的组合。在一些实施方案中,所述至少八种细菌物种包括多种革兰氏阳性菌种和多种革兰氏阴性菌种。在一些实施方案中,所述细菌物种选自:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、金黄色葡萄球菌Mu3(StaphylococcusaureusMu3)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacteriumgranulosum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、金黄色葡萄球菌Mu50(StaphylococcusaureusMu50)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)。在一些实施方案中,所述方法包括检测样品中由至少十种或十五种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染。在一些实施方案中,所述单个引物对包含第一引物和第二引物,该第一引物包含如表2中所示序列(例如,SEQIDNO:4、7或9)的至少10个连续核苷酸,该第二引物包含如表2中所示序列(例如,SEQIDNO:5、6、8或10)的至少10个核苷酸。在一些实施方案中,所述第一引物和第二引物选自表15中公开的引物组,或其任意组合。在一些实施方案中,当最佳对齐时,所述第一引物对和第二引物对表现出与表2或表15中公开的任意引物或其互补序列至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。在一些实施方案中,所述探针包含如表3中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应包含来自细菌污染的少于5pg的起始核酸。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行:聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应在孔中、在板中、在管中、在腔室中、在小滴中、在流动池中、在载玻片中、在芯片中、附于固体基底上、附于珠子上或在乳液中进行。在一些实施方案中,所述可检测信号具有跨越至少5log的线性检测范围。在一些实施方案中,所述方法进一步包括根据探针信号确定细菌污染的量。
在另一个方面,本公开内容提供了检测样品的细菌污染的方法。在一个实施方案中,该方法包括:在单个反应混合物中,使样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且所述样品或其一部分在扩增前没有在35℃以上的温度下进行培养;以及检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的杂交产生指示样品的细菌污染的可检测信号。在一些实施方案中,所述样品是血液样品或血沉棕黄层样品,并且所述污染是受试者的脓毒症的预测或诊断。在一些实施方案中,所述样品是血小板样品。在一些实施方案中,所述血小板样品是通过单采术(apheresis)分离的血小板浓缩物。在一些实施方案中,使从少于5mL的血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。在一些实施方案中,使从少于5mL的血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。在一些实施方案中,所述扩增子由细菌16SrRNA多核苷酸模板产生。在一些实施方案中,所述细菌污染的检测在向接受者输注之前完成。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的不超过300个碱基或不超过150个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的100-200个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所述方法包括检测样品中由至少十种或十五种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染。在一些实施方案中,所述单个引物对包含第一引物和第二引物,该第一引物包含如SEQIDNO:4、7或9中所示序列的至少10个连续核苷酸,该第二引物包含如SEQIDNO:5、6、8或10中所示序列的至少10个核苷酸。在一些实施方案中,所述探针包含如表3中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应包含来自细菌污染的少于5pg的起始核酸。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行:聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应在孔中、在板中、在管中、在腔室中、在小滴中、在流动池中、在载玻片中、在芯片中、附于固体基底上、附于珠子上或在乳液中进行。在一些实施方案中,所述可检测信号具有跨越至少5log的线性检测范围。在一些实施方案中,所述方法进一步包括根据探针信号确定细菌污染的量。
在一个方面,本公开内容提供了在获得样品后24小时内快速检测该样品的细菌污染的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:在单个反应混合物中,采用单个引物对和单种可检测探针使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且来自任一种物种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及在获得所述样品后约24小时内检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的所述杂交产生指示所述样品的细菌污染的可检测信号,由此在获得所述样品后约24小时内检测所述污染。在一些实施方案中,所述样品是血液样品或血沉棕黄层样品,并且所述污染是受试者的脓毒症的预测或诊断。在一些实施方案中,所述样品是血小板样品。在一些实施方案中,所述血小板样品是通过单采术分离的血小板浓缩物。在一些实施方案中,使从少于5mL的血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。在一些实施方案中,所述检测产生指示血小板样品具有约1.0个菌落形成单位/mL(CFU/mL)的细菌负荷的细菌污染的可检测信号。在一些实施方案中,使从少于5mL的血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。在一些实施方案中,所述扩增子由细菌16SrRNA多核苷酸模板产生。在一些实施方案中,所述细菌污染的检测在向接受者输注之前完成。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的不超过300个碱基或不超过150个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的100-200个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所述方法包括检测样品中由至少十种或十五种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染。在一些实施方案中,所述单个引物对包含第一引物和第二引物,该第一引物包含如SEQIDNO:4、7或9中所示序列的至少10个连续核苷酸,该第二引物包含如SEQIDNO:5、6、8或10中所示序列的至少10个核苷酸。在一些实施方案中,所述探针包含如表3中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应包含来自细菌污染的少于5pg的起始核酸。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行:聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应在孔中、在板中、在管中、在腔室中、在小滴中、在流动池中、在载玻片中、在芯片中、附于固体基底上、附于珠子上或在乳液中进行。在一些实施方案中,所述可检测信号具有跨越至少5log的线性检测范围。在一些实施方案中,所述方法进一步包括根据探针信号确定细菌污染的量。
在另一个方面,本公开内容提供了检测样品(例如,受试者的生物样品)中由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染的方法。在一个实施方案中,该方法包括:用单个引物对对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应,以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子,其中来自所述物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子,其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交,并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。在一些实施方案中,所述样品是血液样品或血沉棕黄层样品,并且所述污染是受试者的脓毒症的预测或诊断。在一些实施方案中,所述样品是血小板样品。在一些实施方案中,阴性对照样品的CT比含有来自至少5种细菌物种中的任一种的1pg-5pgDNA的样品的CT高至少5个循环。在一些实施方案中,所述一种或多种可检测探针包括不超过5种不同的探针或不超过2种不同的探针。在一些实施方案中,所述一种或多种可检测探针由一种探针组成。在一些实施方案中,所述细菌污染的检测在向接受者输注之前完成。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的不超过300个碱基或不超过150个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所述扩增反应产生可检测量的100-200个碱基的扩增子。在一些实施方案中,所有的细菌物种均为采用具有不同的可检测标记物的探针在同一反应中检测到的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或两者的组合。在一些实施方案中,所述多种细菌物种包含来自不同属的多种革兰氏阳性菌种和来自不同属的多种革兰氏阴性菌种。在一些实施方案中,所述一种或多种可检测探针包含第一探针和第二探针,所述第一探针与在革兰氏阳性菌种中共有但不存在于至少一些革兰氏阴性菌种中的保守序列特异性杂交,所述第二探针与在革兰氏阴性菌种中共有但不存在于至少一些革兰氏阳性菌种中的保守序列特异性杂交。在一些实施方案中,所述细菌物种选自:金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、颗粒丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。在一些实施方案中,所述方法包括检测样品中由至少十种或十五种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染。在一些实施方案中,所述单个引物对包含第一引物和第二引物,该第一引物包含如SEQIDNO:4、7或9中所示序列的至少10个连续核苷酸,该第二引物包含如SEQIDNO:5、6、8或10中所示序列的至少10个核苷酸。在一些实施方案中,所述探针包含如表3中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应包含来自细菌污染的少于5pg的起始核酸。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行:聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。在一些实施方案中,所述核酸扩增反应在孔中、在板中、在管中、在腔室中、在小滴中、在流动池中、在载玻片中、在芯片中、附于固体基底上、附于珠子上或在乳液中进行。在一些实施方案中,所述探针产生具有跨越至少5log的线性检测范围的信号。在一些实施方案中,所述方法进一步包括根据探针信号确定所述多种细菌物种的丰度。
在一个方面,本公开内容提供了用于扩增和检测16SrRNA多核苷酸的一部分的组合物。在一些实施方案中,该部分的长度小于约800、700、600、500、400、300、200、150或100个核苷酸。在一个实施方案中,所述组合物包含:第一引物,其包含如表2或表15所示序列(包括但不限于SEQIDNO:9)的至少10个连续核苷酸;第二引物,其包含如表2或表15中所示序列(包括但不限于SEQIDNO:10)的至少10个连续核苷酸;以及探针,其包含如表3中所示序列(包括但不限于SEQIDNO:16)的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。在一个实施方案中,所述组合物包含引物,该引物在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中扩增长度为至少50个核苷酸的扩增子,当最佳对齐时该扩增子与表1中列出的任意序列(包括但不限于SEQIDNO:1-3)具有90%的序列同一性;以及一种或多种探针,该探针与所述扩增子的任一条链特异性杂交。在一些实施方案中,所述组合物在容器如孔、板、管、腔室、流动池或芯片中。在一些实施方案中,所述组合物为脱水形式。在一些实施方案中,在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中,使用所述引物和探针对来自多种目标物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)。
在另一个方面,本公开内容提供了检测由至少五种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法。该方法包括:在反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含第一正向引物和第一反向引物,其中所述第一正向引物和第一反向引物各自与单独的区域杂交,该单独的区域在至少5种不同的细菌基因组中是保守的;从所述反应混合物检测指示所述量的扩增子的存在的信号,由此检测由所述至少五种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染。在一个实施方案中,所述第一正向引物和第一反向引物各自与在至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种或甚至更多种不同的细菌基因组中保守的单独的区域杂交。保守区域可以包括金黄色葡萄球菌的16SrRNA(GenBank登录号NC_007622)的9到28、32到48、522到545、888到903、916到937、939到973、975到994、957到981、1093到1125、1184到1206、1231到1252、1378到1396、1398到1422或1496到1516的区域,或以下细菌的基因组中的任一种的相应区域:金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、丙酸杆菌属的种、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。本文公开的任何引物,包括表15中列出的引物组,均可用于实施该方法和本文公开的其他方法。在一些实施方案中,当最佳对齐时,所述第一正向引物和第一反向引物各自表现出与靶细菌序列的单独的区域至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性。在一些实施方案中,所述反应混合物进一步包含第二正向引物,当与至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种或更多种细菌物种中的任一种或全部最佳对齐时,所述第二正向引物表现出至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性。在一些实施方案中,所述反应混合物进一步包含第二反向引物,当与至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种或更多种细菌物种中的任一种或全部最佳对齐时,所述第二反向引物表现出至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性。具有同源性的区域可以包括但不限于本文公开的任何保守区域,例如,金黄色葡萄球菌的16SrRNA(GenBank登录号NC_007622)的9到28、32到48、522到545、888到903、916到937、939到973、975到994、957到981、1093到1125、1184到1206、1231到1252、1378到1396、1398到1422或1496到1516的区域,或本文中引用的任一种细菌基因组中的相应区域。需要时,所述反应混合物进一步包含可检测标记物,包括但不限于DNA结合染料或本文公开的其他标记分子。在一些实施方案中,在使得来自至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种或更多种细菌物种中的任一种的约1pg-5pgDNA具有小于30的循环阈值(CT)的条件下进行核酸扩增。
在一个方面,本公开内容提供了用于扩增和检测16SrRNA多核苷酸的一部分的反应混合物。在一些实施方案中,该部分的长度小于约800、700、600、500、400、300、200、150或100个核苷酸。在一些实施方案中,所述反应混合物包含样品核酸;引物,该引物在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中扩增长度为至少50个核苷酸的扩增子,当最佳对齐时所述扩增子与SEQIDNO:1-3中的任一个具有90%的序列同一性;探针,该探针与所述扩增子的任一条链特异性杂交;以及聚合酶;其中所述反应混合物在反应位置中。在一些实施方案中,所述反应位置是小滴、孔、板、管、腔室、流动池或芯片。在一些实施方案中,在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中,使用所述引物和探针对来自多种目标物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)。
在一个方面,本公开内容提供了用于检测样品如血小板样品的细菌污染的试剂盒。在一个实施方案中,所述试剂盒包含第一引物,其包含如表2或表15中所示序列(包括但不限于SEQIDNO:9)的至少10个连续核苷酸;第二引物,其包含如表2或表15中所示序列(包括但不限于SEQIDNO:10)的至少10个连续核苷酸;探针,其包含如表3中所示序列(包括但不限于SEQIDNO:16)或其互补序列的至少10个连续核苷酸。
在一个方面,本公开内容提供了使用本公开内容的试剂盒的方法。在一个实施方案中,该方法包括用单个引物对对样品或其一部分进行核酸扩增反应,以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子,其中来自不同属的多种细菌物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子,其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交,并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。
在一个方面,本公开内容提供了用于检测由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的样品(例如,血小板样品、血液样品或血沉棕黄层样品)的细菌污染的***。在一个实施方案中,该***包含被配置用于接收客户请求以对样品进行检测反应的计算机;响应所述客户请求,对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应的扩增***,其中所述扩增反应采用单个引物对和单种探针产生了可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子,并且进一步地,其中来自至少五个属中的任一个的1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的CT;以及向接收者发送报告的报告生成器,其中所述报告含有由所述探针产生的信号强度的检测结果。在一些实施方案中,所述报告生成器根据由所述探针产生的信号强度将所述样品确定为污染的或未污染的。在一些实施方案中,所述接收者是客户。
在一个方面,本公开内容提供了计算机可读介质。在一些实施方案中,该计算机可读介质包含代码,该代码在由一个或多个处理器执行时,实施检测由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法。在一个实施方案中,执行代码时所实施的方法包括:接收客户请求以对样品进行检测反应;响应所述客户请求,对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应,其中所述扩增反应采用单个引物对和单种探针产生可检测量的、16SrRNA的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子,并且进一步地,其中来自至少五个属中的任一个的1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的CT;以及生成含有由所述探针产生的信号强度的检测结果的报告。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文,其程度如同具体地且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图,将会获得对本发明的特征和优势的更好的理解,在附图中:
图1是图示了核酸扩增反应的结果的图。
图2是图示了核酸扩增测定的检测范围的图。
图3A和3B是图示了核酸扩增反应的结果的图。
图4A和4B是图示了核酸扩增反应的结果的图。
图5是描绘了示例性样品分析***的示意图。
图6A和6B图示了Liu等人描述的探针与引物之间杂交的样品分析的结果。
图7A是图示了核酸扩增反应的结果的图。
图7B是图示了核酸扩增测定的检测范围的图。
图8A-G是图示了核酸扩增反应的结果的图。
图9是图示了核酸扩增反应的结果的图。
图10A是图示了一式三份进行的核酸扩增反应的结果的图。
图10B是图示了所得扩增核酸的解链曲线分析结果的图。
发明详述
除非另外说明,本文公开的一些实施方案的实施采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术,这些均在本领域的技术范围内。参见,例如Sambrook和Green,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第4版(2012);CurrentProtocolsinMolecularBiology系列(F.M.Ausubel等人编著);MethodsInEnzymology系列(AcademicPress,Inc.),PCR2:APracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995)),Harlow和Lane编著(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,andCultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniqueandSpecializedApplications,第6版(R.I.Freshney编著(2010))。
除非上下文另外明确指定,如在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数的指代物。例如,术语“一个细胞”包括多个细胞,包括其混合物。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。它们指任何长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构,并可以执行任何功能(已知或未知的)。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码或非编码区、从连锁分析确定的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一种或多种修饰的核苷酸,如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸结构的修饰(如果存在)可以在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步进行修饰,如通过与标记组分结合。
通常,术语“靶多核苷酸”是指具有靶序列的核酸分子起始群体中的核酸分子或多核苷酸,该靶序列的存在、量和/或核苷酸序列,或这些中的一种或多种的变化是需要进行确定的。通常,术语“靶序列”是指在核酸的单链上的核酸序列。靶序列可以是基因的一部分、调控序列、基因组DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、miRNA、rRNA)或其他。靶序列可以是来自样品或二级靶标如扩增反应产物的靶序列。
通常,“核苷酸探针”、“探针”或“标记寡核苷酸”是指用于在杂交反应中通过与相应的靶序列杂交来检测或鉴定其相应的靶多核苷酸的多核苷酸。因此,核苷酸探针可与一种或多种靶多核苷酸杂交。标记寡核苷酸可以与样品中的一种或多种靶多核苷酸完全互补,或含有不与样品中的一种或多种靶多核苷酸中的相应核苷酸互补的一种或多种核苷酸。
“杂交”是指一种或多种多核苷酸反应以形成复合物的反应,该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而稳定。氢键结合可以通过WatsonCrick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链,或这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛过程如PCR的引发或核酸内切酶对多核苷酸的酶切中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补序列”。
如应用于多核苷酸的术语“可杂交的”是指多核苷酸形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而稳定的复合物的能力。氢键结合可以通过WatsonCrick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链,或这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛过程如PCR反应的引发或核酶对多核苷酸的酶切中的步骤。与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补序列”。
“互补性”是指核酸与另一种核酸序列通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型的作用形成氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如,Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如,10个中有5、6、7、8、9、10个则为50%、60%、70%、80%、90%和100%互补)。“完全互补”指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。如本文中所用的“基本互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域中为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的互补性程度,或者指在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文所用的,用于杂交的“严格条件”是指这样一种条件,在该条件下与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交,而基本不与非靶序列杂交。严格条件通常是序列依赖性的,并且根据多种因素而变化。通常,序列越长,该序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性实例在Tijssen(1993),LaboratoryTechniquesInBiochemistryAndMolecularBiology-HybridizationWithNucleicAcidProbes,第I部分,第二章“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassay”,Elsevier,N.Y.中进行了详细描述。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用,以指代脊椎动物,优选哺乳动物,更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物(sportanimal)以及宠物。还涵盖体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用的,“表达”是指这样一种过程,通过该过程多核苷酸从DNA模板转录(如成为mRNA或其他RNA转录物)和/或通过该过程转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA,则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。
如本文所用的,“血小板样品”和“血小板浓缩物”可以互换使用,以指代包含来源于血小板纯化过程的血小板的受试者生物样品。可以通过多种方法,如通过离心或单采术,从一种或多种其他血液成分中纯化血小板。随后可以将这些纯化的血小板合并、稀释、分配或进一步纯化,所有这些过程均产生包含来源于血小板纯化过程的血小板的样品。
在一个方面,本公开内容提供了检测血小板样品的细菌污染的方法,该细菌污染由多种细菌物种如至少八种细菌物种中的任何物种所引起。在一个实施方案中,所述方法包括:在单个反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且所述保守序列在至少八种细菌物种中是相同的;以及检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的杂交产生可检测信号,该可检测信号指示由所述至少八种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染。
在另一个方面,本公开内容提供了检测血小板样品的细菌污染的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:在单个反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且所述样品或其一部分在扩增前没有在35℃以上的温度下进行培养;以及检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的杂交产生指示血小板样品的细菌污染的可检测信号。
在一个方面,本公开内容提供了在获得血小板样品后24小时内快速检测该血小板样品的细菌污染的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:在单个反应混合物中采用单个引物对和单种可检测探针,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且来自任一种物种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及在获得所述样品后约24小时内检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的所述杂交产生指示所述血小板样品的细菌污染的可检测信号,由此在获得所述样品后约24小时内检测所述污染。
在另一个方面,本公开内容提供了检测受试者的生物样品中由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:用单个引物对对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应,以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子,其中来自所述物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子,其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交,并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。
在多个方面的任一方面中,核酸可以来源于多种样品来源。可以将核酸在进一步操作之前任选地,但不是必须地,分离和/或纯化,如在核酸扩增反应中。例如,可以使生物样品在没有单独的提取步骤的情况下经历聚合酶链反应(PCR)过程,以使得无细胞核酸从未纯化的样品中扩增。作为进一步的示例,可以在临核酸扩增反应之前或在其期间使样品经受细胞裂解条件而不从其他细胞组分中纯化核酸。在一些实施方案中,在使核酸经历扩增反应之前从生物样品中纯化核酸(例如,DNA、RNA或两者)。多种核酸纯化方法是本领域已知的,并且可以随生物样品的类型而改变。例如,生物样品可以包括来自受试者的组织和/或流体。通常,生物流体包括与活生物相关的任何处理的或未处理的流体,包括但不限于,血液,包括全血、温的或冷的血液、以及储存的或新鲜的血液;处理的血液,如用至少一种生理溶液稀释的血液,该生理溶液包括但不限于盐水、营养物和/或抗凝剂溶液;血液成分,如血小板浓缩物(PC)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、无血小板血浆、血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、从血浆获得的成分、浓缩红细胞(PRC)、过渡区物质或血沉棕黄层(BC);源自血液或血液成分或源自骨髓的类似血液制品;从血浆分离并再悬浮于生理流体或冷冻保护流体中的红细胞;以及从血浆分离并再悬浮于生理流体或冷冻保护流体中的血小板。生物样品的其他非限制性实例包括皮肤、心脏、肺、肾、骨髓、***、胰、肝、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、***、食管、甲状腺、血清、唾液、尿、胃液和消化液、泪水、粪便、***、***液、源自肿瘤组织的间质液、眼内液、汗液、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脑脊髓液、组织、咽拭子、活检物、胎盘液、羊水、脐带血、重点流体(emphaticfluid)、腔液、痰、脓、微生物区(microbiota)、胎粪、乳汁和/或其他***物或身体组织。在一些实施方案中,待测样品是全血。在一些实施方案中,待测样品是血沉棕黄层。在一些实施方案中,所分析的组织是待移植或手术移植的组织,如器官(例如,心脏、肾、肝、肺等)、皮肤、骨、神经组织、腱、血管、脂肪、角膜、血液或血液成分的一部分。在一些实施方案中,样品来自受试者,如哺乳动物,包括但不限于鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物或宠物。在一些实施方案中,样品中污染的检测是诸如作出诊断或治疗受试者等医疗行为的基础。例如,污染可能是受试者的脓毒症的预测或诊断。可以采取矫正性的医学干预,如施用治疗剂。
在一些实施方案中,待测样品是血小板样品。用于从全血的其他成分提纯出血小板的方法是本领域已知的,包括采用离心和/或过滤(例如,单采术)的方法。当作为全血的成分分离时,血小板可进行浓缩、再悬浮于血浆和/或血小板添加剂溶液中,通过经过过滤装置而去除白细胞,和/或储存于在约22℃的温度下的保持在平板(flatbed)上的血小板储存袋中。血小板样品可以包含来自单独的纯化程序的血小板样品池,或其一部分。在一些实施方案中,血小板样品是从中已去除血小板(如通过离心)的纯化的血小板样品的一部分。
可以使用本领域已知的任何合适的方法从生物样品中提取核酸。例如,可以通过用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇或类似的制剂(包括TRIzol和TriReagent)进行有机萃取来纯化核酸。提取技术的其他非限制性实例包括:(1)有机萃取后乙醇沉淀,例如,使用苯酚/氯仿有机试剂(Ausubel等人,1993),采用或不采用自动化的核酸提取器,例如,可从AppliedBiosystems(FosterCity,Calif.)购得的341型DNA提取器;(2)固定相吸附法(美国专利号5,234,809;Walsh等人,1991);以及(3)盐诱导的核酸沉淀法(Miller等人,(1988)),这类沉淀方法通常被称为“盐析”法。核酸分离和/或纯化的另一个实例包括使用可与核酸特异性或非特异性结合的磁性颗粒(例如,珠子),随后使用磁体分离该颗粒,并从颗粒上清洗及洗脱核酸(参见,例如,美国专利号5,705,628)。在一些实施方案中,可以在上述分离方法之前进行酶消化步骤,以帮助从样品中消除不需要的蛋白质,例如,用蛋白酶K或其他类似的蛋白酶消化。参见,例如,美国专利号7,001,724。如果需要,可以将RNA酶抑制剂添加至裂解缓冲液中。对于某些细胞或样品类型,可能期望向方案中加入蛋白质变性/消化步骤。纯化方法可以用于分离DNA、RNA(包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA)或两者。当DNA和RNA在提取过程期间或之后一起分离时,可以采用进一步的步骤单独地将其中一种或两种从另一种中提纯。也可以产生提取的核酸的亚组分,例如,按大小、序列或其他物理或化学特征进行的纯化。除了初始的核酸分离步骤外,还可以在随后的操作之后进行核酸的纯化,如去除过量或不需要的试剂、反应物或产物。
在多个方面的任一方面中,核酸扩增反应可以涉及多种用于核酸扩增的方法中的任一种。通常,“扩增”是指使靶序列的拷贝数增加的任何过程。多种用于靶核酸的检测和定量的基于扩增的方法是本领域已知的。聚合酶链反应(PCR)采用多个循环的变性、将引物对与相反链退火以及引物延伸,以使靶序列的拷贝数呈指数增加。在被称为RT-PCR的变化形式中,使用逆转录酶(RT)由RNA制备互补的DNA(cDNA),然后将该cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝(参见,例如,美国专利号5,322,770和5,310,652)。
扩增方法可能涉及温度变化(如在热变性步骤中),或者可以是不包括热变性步骤的等温过程。等温扩增方法的实例是链置换扩增(常称为SDA),其采用以下循环:将引物序列对与靶序列的相反链退火、在dNTP的存在下进行引物延伸以产生半硫代磷酸化的双链引物延伸产物、半修饰的限制性核酸内切酶识别位点的核酸内切酶介导的切口形成、以及聚合酶介导的从切口的3’端开始的引物延伸,以置换存在的链并产生用于下一轮的引物退火、切割和链置换的链,从而导致产物的几何扩增(参见,例如,美国专利号5,270,184和美国专利号5,455,166)。嗜热SDA(tSDA)在基本相同的方法中在更高的温度下采用嗜热的核酸内切酶和聚合酶(欧洲专利号0684315)。
扩增方法的其他实例包括滚环扩增(RCA)(例如,Lizardi,“RollingCircleReplicationReporterSystems”,美国专利号5,854,033);解旋酶依赖性扩增(HDA)(例如,美国专利申请US20040058378);以及环介导等温扩增(LAMP)(例如,Notomi等人,“ProcessforSynthesizingNucleicAcid”,美国专利号6,410,278)。
核酸扩增反应的其他实例包括基于转录的扩增方法,如基于核酸序列的扩增(也称为NASBA)(例如,Malek等人,美国专利号5,130,238);依赖于RNA复制酶的使用来扩增探针分子自身的方法,常称为Qβ复制酶(例如,Lizardi,P.等人(1988)BioTechnol.6,1197-1202);以及自我持续序列复制(例如,Guatelli,J.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1874-1878;Landgren(1993)TrendsinGenetics9,199-202;和HELENH.LEE等人.NUCLEICACIDAMPLIFICATIONTECHNOLOGIES(1997))。另一种基于转录的扩增方法是转录介导的扩增,常称为TMA,其在基本恒定的温度、离子强度和pH条件下自催化地合成靶核酸序列的多个拷贝,其中靶序列的多个RNA拷贝自催化地产生额外的拷贝(参见,例如,美国专利号5,480,784;和美国专利号5,399,491)。核酸扩增方法的另外的实例包括连接酶链反应(参见,例如,美国专利号5,494,810和5,830,711),和固相扩增方法(例如,采用附于固体表面如载玻片或珠子上的引物的桥扩增;参见,例如,美国专利号5,641,658和7,985,565)。
通常,SDA可以如下描述。使单链靶核酸(通常是DNA靶序列)与SDA引物接触。“SDA引物”通常具有25-100个核苷酸的长度,且约35个核苷酸的SDA引物是优选的。SDA引物与在靶序列的3’端的区域基本互补,并且该引物在其5’端(在与靶标互补的区域之外)具有为限制性核酸内切酶的识别序列的序列,该限制性核酸内切酶有时被称为“切口酶”或“切口核酸内切酶”。然后SDA引物与靶序列杂交。SDA反应混合物还含有聚合酶(“SDA聚合酶”),以及全部四种脱氧核苷-三磷酸(也称为脱氧核苷酸或dNTP,即,dATP、dTTP、dCTP和dGTP,常在引物延伸反应中使用)的混合物,其中至少一种为取代的或修饰的dNTP;由此,将SDA引物延伸,以形成修饰的引物,有时称为“新合成的链”。将取代的dNTP进行修饰,以使得其将抑制含有取代的dNTP的链中的切割,但将不抑制另一条链上的切割。合适的取代的dNTP的实例包括但不限于2'脱氧腺苷5'-O-(1-硫代三磷酸)、5-甲基脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-脱氧尿苷5'-三磷酸和7-脱氮-2'-脱氧鸟苷5'-三磷酸。另外,dNTP的取代可以发生在掺入至新合成的链中之后;例如,可以使用甲基化酶将甲基基团添加至合成的链中。另外,如果全部核苷酸都被取代,则聚合酶可以具有5’→3’核酸外切酶活性。然而,如果少于全部的核苷酸被取代,则聚合酶优选缺少5’→3’核酸外切酶活性。正如将被本领域技术人员所理解的,识别位点/核酸内切酶对可以是很多种已知组合中的任一种。选择核酸内切酶在识别位点或其3’或5’端切割链,而不切割互补序列,这是因为该酶仅切割一条链或者由于取代的核苷酸的掺入。合适的识别位点/核酸内切酶对是本领域已知的,包括但不限于HincII、HindII、AvaI、Fnu4HI、TthIIII、NcII、BstXI、BamHI等。描绘了合适的酶及其相应的识别位点和使用的修饰的dNTP的图表见于美国专利号5,455,166中,该专利通过引用并入于此。一旦形成切口,则使用聚合酶(“SDA聚合酶”)延伸新的切口链,5’→3’,由此形成另一条新合成的链。所选的聚合酶应当能够在切口位点引发5’→3’聚合,还应当置换切口下游的聚合的链,并且应当缺少5’→3’核酸外切酶活性(这可以通过添加阻断剂而另外完成)。SDA中合适的聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE1.0和SEQUENASE2.0(U.S.Biochemical)、T5DNA聚合酶和Phi29DNA聚合酶。通常,SDA不需要热循环。通常将反应的温度设置得足够高以防止非特异性杂交,但又足够低以允许特异性杂交;这通常为约37℃到约42℃,取决于酶。在一些实施方案中,对于本文所述的其他扩增技术,可以采用互补的靶序列进行第二引物延伸反应,从而导致在设定的时间段期间扩增大幅度增加。即,第二引物核酸与第二靶序列(与第一靶序列基本互补)杂交,以形成第二杂交复合体。添加酶并随后将第二杂交复合体解离,导致产生多个新合成的第二链。因此,扩增可以是线性或非线性的(例如,指数的)。
NASBA在美国专利号5,409,818中进行了一般性描述;Sooknanan等人,MolecularMethodsforVirusDetection的NucleicAcidSequence-BasedAmplification,Ch.12(pp.261-285),AcademicPress,1995;以及“ProfitingfromGene-basedDiagnostics”,CTBInternationalPublishingInc.,N.J.,1996,所有这些文献均通过引用并入本文。NASBA与TMA和QBR都非常相似。转录介导的扩增(TMA)在美国专利号5,399,491、5,888,779、5,705,365、5,710,029中进行了一般性描述,所有这些专利均通过引用并入本文。NASBA与TMA之间的主要差异为,NASBA利用RNA酶H的添加来实现RNA降解,而TMA依赖于逆转录酶的固有的RNA酶H活性。通常,这些技术可以如下描述。使通常为RNA靶序列(有时称为“第一靶序列”或“第一模板”)的单链靶核酸与本文中通常称为“NASBA引物”的第一引物(尽管“TMA引物”也是合适的)接触。以下从DNA靶序列开始描述。这些引物通常具有25-100个核苷酸的长度,且约50-75个核苷酸的NASBA引物是优选的。第一引物优选为DNA引物,该DNA引物在其3’端具有与第一模板的3’端基本互补的序列。第一引物还在其5’端具有RNA聚合酶启动子(或其互补序列(反义的),取决于***的配置)。然后第一引物与第一模板杂交以形成第一杂交复合体。反应混合物还包含逆转录酶(“NASBA”逆转录酶),以及四种dNTP的混合物,使得第一NASBA引物得到延伸,以形成包含RNA(第一模板)和DNA(新合成的链)的杂交复合体的修饰的第一引物。本文中“逆转录酶”或“RNA引导的DNA聚合酶”是指能够从DNA引物和RNA模板合成DNA的酶。合适的RNA引导的DNA聚合酶包括但不限于禽成髓细胞性白血病病毒逆转录酶(“AMVRT”)和莫洛尼鼠白血病病毒RT。当扩增反应为TMA时,逆转录酶还包含RNA降解活性。除了上述列出的成分之外,NASBA反应还包含RNA降解酶,本文中有时也称为核糖核酸酶,其会水解RNA:DNA杂合体的RNA而不水解单链或双链的RNA或DNA。合适的核糖核酸酶包括但不限于来自大肠杆菌和小牛胸腺的RNA酶H。核糖核酸酶活性使杂交复合体中的第一RNA模板降解,从而导致该杂交复合体解离,留下第一单链新合成DNA链,有时称为“第二模板”。另外,NASBA反应还包含第二NASBA引物,其通常包含DNA(虽然对于本文中所有的探针和引物,还可以使用核酸类似物)。该第二NASBA引物在其3’端具有与第二模板的3’端基本互补的序列,并且还含有功能性启动子的反义序列和转录起始位点的反义序列。因此,该引物序列在用作合成第三DNA模板的模板时,含有充分的信息以允许RNA聚合酶的特异且有效的结合以及在期望位点处转录的引发。反义启动子和转录起始位点可以是T7RNA聚合酶的相应启动子和起始位点,尽管也可以使用其他RNA聚合酶启动子和起始位点。第二引物与第二模板杂交,并且也称为“DNA引导的DNA聚合酶”的DNA聚合酶也存在于反应中,合成第三模板(第二新合成DNA链),从而产生包含两条新合成的DNA链的第二杂交复合体。最后,纳入RNA聚合酶和所需的四种核糖核苷三磷酸(核糖核苷酸或NTP)导致RNA链(与第一模板基本相同的第三新合成链)的合成。RNA聚合酶,本文中有时称为“DNA引导的RNA聚合酶”,识别启动子并在起始位点特异性引发RNA合成。此外,对于每个DNA双链体,RNA聚合酶优选地合成RNA的若干个拷贝。优选的RNA聚合酶包括但不限于T7RNA聚合酶和其他噬菌体RNA聚合酶,包括噬菌体T3、噬菌体φII、沙门氏菌噬菌体sp6或假单胞菌噬菌体gh-1的RNA聚合酶。在一些实施方案中,TMA和NASBA与起始DNA靶序列、包含RNA聚合酶启动子的第一引物和DNA聚合酶一起使用,以产生具有新合成的链的双链DNA杂合体,该新合成的链包含启动子序列。然后使该杂合体变性并添加第二引物。
等温扩增反应的另一个实例是单引物等温扩增(SPIA)。该扩增技术在WO2001020035和美国专利号6,251,639中公开,这些专利通过引用并入本文。通常,该方法包括使嵌合RNA/DNA扩增引物与探针或靶标杂交。优选地,探针的DNA部分是RNA的3’端。任选地,该方法包括使包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与模板中相对于复合引物与该模板的杂交位于5’侧的区域杂交。引物与模板杂交后,采用DNA聚合酶将引物延伸。随后,采用从RNA/DNA杂合体中切割RNA的酶从复合引物中切割RNA。随后,将另外的RNA/DNA嵌合引物与模板杂交,以便从靶探针中置换第一延伸引物。重复该延伸反应,由此产生探针序列的多个拷贝。当只使用一个SPIA引物时,扩增反应线性进行。当还使用与第一引物延伸产物互补的反向SPIA引物时,扩增反应是非线性的。
在一些实施方案中,核酸扩增反应是PCR反应。对通过PCR扩增靶序列有利的条件可以通过本领域已知的方法来确定,可以在过程中的多个步骤中优化,并且取决于反应中元件的特征,如靶标类型、靶标浓度、待扩增的序列的长度、靶标的序列和/或一种或多种引物、引物长度、引物浓度、所用的聚合酶、反应体积、一个或多个元件与一个或多个其他元件的比例、以及其他因素,这些中的一些或全部可以改变。通常,PCR包括使待扩增的靶标变性(如果是双链的)、一种或多种引物与靶标杂交、以及通过DNA聚合酶进行引物延伸的步骤,且使这些步骤重复(或“循环”)以便扩增靶序列。可以优化该过程中的步骤以得到不同的结果,如提高产率,减少假产物的形成,和/或提高或降低引物退火的特异性。优化的方法是本领域已知的,且包括调节扩增反应中元件的类型或量,和/或调节过程中给定步骤的条件,如特定步骤中的温度、特定步骤的持续时间和/或循环数。在一些实施方案中,扩增反应包括至少5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。在一些实施方案中,扩增反应包括不超过5、10、15、20、25、35、50个或更多个循环。循环可以包含任意数目的步骤,如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个步骤,并且在所循环的步骤之前和/或之后可以有不包括在那些循环的步骤中的一个或多个步骤(例如,初始解链步骤或最终温育步骤)。步骤可以包括适合于实现给定步骤的目的的任意温度或温度梯度,该给定步骤包括但不限于引物退火、引物延伸和链变性。步骤可以具有任意的持续时间,包括但不限于约、少于约或多于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、180、240、300、360、420、480、540、600秒或更多秒,包括无限地进行直至手动中止。包含不同步骤的任意数目的循环可以以任意顺序组合。在一些实施方案中,将包含不同步骤的不同循环组合,使得组合中循环的总数目为约、少于约或多于约5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。
在多个方面的任一方面的一些实施方案中,核酸扩增反应包括一种或多种引物例如约、多于约或少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种引物的3’端延伸。在一些实施方案中,核酸扩增反应中的引物延伸仅涉及一对引物。在其他实施方案中,核酸扩增反应中的引物延伸涉及多个引物对,如2、3、4、5个或更多个引物对。在一些实施方案中,引物对由第一引物和第二引物组成,其中第一引物包含可与一种或多种靶多核苷酸的至少一部分杂交的序列,并且进一步地,其中第二引物包含可与第一引物延伸产物的互补序列的至少一部分杂交的序列。当靶多核苷酸是双链时,可与第一引物延伸产物的互补序列的至少一部分杂交的第二引物的序列还可以是可与靶多核苷酸的互补链的至少一部分杂交的。当扩增反应包含多个引物对时,该多个引物对可以是不同的(如每一对为两种不同的引物)、重叠的(如一个正向引物与两个或更多个不同的反向引物配对)、或不同对和重叠对的组合。扩增引物可以具有任何合适的长度,如约、小于约或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100个或更多个核苷酸,其任何部分或全部可以与相应的靶序列(例如,约、小于约或大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸)互补。通常,当引物包含互补部分和非互补部分时,与靶序列互补的部分位于引物的3’端。引物对可被设计用于扩增具有任何期望长度的靶序列。如本文所用的,“扩增子”是指在核酸扩增反应中从靶多核苷酸扩增的单链或双链形式的靶序列。当扩增子通过引物对扩增时,引物对通常位于扩增子的侧翼,使得一个引物在靶序列的5’端杂交而另一引物与靶序列的3’端的互补序列杂交。在一些实施方案中,扩增子的长度为约或小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25个或更少的核苷酸。在一些实施方案中,扩增子的长度为约或大于约50、100、200、300、400、500、750、1000个或更多个核苷酸。在一些实施方案中,扩增子的长度在这些端点的任意两个端点之间,如25-1000、30-500、50-400、50-250、50-150或100-200个核苷酸长。可以基于与多种设计考虑因素中的任一种的一致性来选择引物,这些设计考虑因素可以单独使用,或与本文公开的或本领域已知的任何其他设计考虑因素组合使用。引物的可选设计考虑因素的另外的非限制性实例包括:避免相同核苷酸的区段(run)(例如,连续3、4、5个或更多个相同核苷酸);邻近探针而不与探针杂交位点重叠(例如,沿同一链在引物的3’端与探针的5’端之间约或小于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、30、40、50、75、100个或更多个核苷酸);G-C含量在约20%-80%内,解链温度(Tm)在选定范围(例如,约55-65℃、58-62℃或58-60℃)内;在3’端的最后五个核苷酸中有不超过两个G和/或C碱基;成对的引物具有相似的Tm(例如,相同的Tm,或Tm在彼此约1-2℃内);最少的二级结构(例如,当最优折叠时有约或少于约5、4、3、2或1个Watson-Crick配对碱基,如通过用mFold所分析的(参见,例如,Zuker等人,Nucl.AcidRes,2003,31:3406-3415));作为同源二聚体或异源二聚体的反应中引物之间最少的杂交(例如,当最佳对齐时有约或少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个Watson-Crick配对碱基);以及引物与相应探针之间最少的杂交(例如,当最佳对齐时有约或少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个Watson-Crick配对碱基)。在一些实施方案中,引物特异性地扩增长度为约或至少约25、50、75、100、125、150或175个核苷酸的扩增子,并且当最佳对齐时与表1中的序列(或其互补序列)具有约或至少约80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%或更高的序列同一性。用于确定最佳序列对齐的方法和算法是本领域已知的,这些中的任一种均可用于确定百分比序列同一性。用于确定两个序列之间的序列同一性的算法的一个实例包括局部序列排比检索基本工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST),如在blast.ncbi.nlm.nih.gov由国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)所维护的。
在一些实施方案中,引物对固定在固体支持体上。固体支持体的实例包括但不限于,无机材料如基于二氧化硅的基底(例如,玻璃、石英、熔融石英、硅等),其他半导体材料,以及有机材料如聚合物材料(例如,聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖,或常用作反应介质的支持体的多种有机基底材料中的任一种)。除了所述多种材料用作固体支持体之外,固体支持体结构还可以为多种物理构造中的任一种,包括但不限于微粒、珠子、纳米颗粒、纳米晶体、纤维、微纤维、纳米纤维、纳米线、纳米管、垫(mat)、平面薄片、平面晶片或载玻片、多孔板、包含额外结构的光学载玻片、毛细管、微流体通道等。在一些实施方案中,在固体支持体上的扩增包括桥扩增。桥扩增的一般方法是本领域已知的。参见,例如WO/1998/044151和WO/2000/018957。
特别感兴趣的是能够与在至少5、10、15、20个或更多个不同细菌基因组中保守的区域特异性杂交的引物序列。例如,选择各自与在至少5、10、15、20个或更多个不同细菌基因组中保守的单独的区域杂交的正向和反向引物。这些保守区域包括但不限于金黄色葡萄球菌的16SrRNA(GenBank登录号NC_007622)的9到28、32到48、522到545、888到903、916到937、939到973、975到994、957到981、1093到1125、1184到1206、1231到1252、1378到1396、1398到1422或1496到1516的区域,或以下细菌的基因组中的任一种的相应区域:金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、丙酸杆菌属的种、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。
在一些实施方案中,主题引物能够与至少5、10、15、20个或更多个不同细菌基因组的保守区域特异性杂交,因此允许对该至少5、10、15、20个或更多个不同细菌基因组中的任意类型的特异性扩增和检测。这类引物和引物组的设计允许同时确定广泛的一组细菌菌株中的细菌感染。在一些实施方案中,该检测在采用单个引物对(且任选地采用一种或多种可选引物,以提供额外的细菌覆盖)的单个扩增反应中发生。这些引物和引物组可以与本文公开的探针或其他标记分子如DNA结合染料(例如,绿)等结合使用。
核酸扩增反应中的引物延伸可以通过本领域已知的任何合适的聚合酶如DNA聚合酶进行,这些聚合酶中的许多是可商购的。DNA聚合酶可以包括DNA依赖性DNA聚合酶活性、RNA依赖性DNA聚合酶活性、或DNA依赖性和RNA依赖性DNA聚合酶活性。DNA聚合酶可以是热稳定的或非热稳定的。DNA聚合酶的实例包括但不限于Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Klenow片段,及其变体、修饰产物和衍生物。在一些实施方案中,使用细菌产生的酶是高度纯化的,使得无模板对照扩增反应在约或多于约25、30、35、40、45个或更多个PCR反应循环后不产生高于背景水平的扩增信号。
在多个方面的任一方面的一些实施方案中,核酸扩增产物在扩增过程期间和/或完成时进行检测。扩增产物检测可在扩增测定中实时进行。在一些实施方案中,扩增产物可直接采用荧光DNA结合剂进行可视化,该荧光DNA结合剂包括但不限于DNA嵌入剂和DNA沟结合剂。由于掺入至双链DNA分子中的嵌入剂的量通常与扩增的DNA产物的量成比例,因此可以通过使用常规的光学***定量嵌入染料的荧光来确定扩增产物的量。DNA结合染料的非限制性实例包括绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoechst、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶(homidium)、光神霉素、多吡啶钌、安曲霉素等。
在一些实施方案中,在核酸扩增反应中采用序列特异性寡核苷酸探针以促进扩增产物的检测和/或定量。基于探针的定量扩增依赖于所期望的扩增产物的序列特异性检测,如通过探针与扩增产物内的靶序列之间的特异性杂交。靶特异性探针的实例包括但不限于探针和分子信标。用于进行基于探针的定量扩增的一般方法是本领域已知的(参见,例如,美国专利号5,210,015)。杂交可以在不同的严格性下进行。合适的杂交条件通常为这样的条件,其使得探针与靶多核苷酸之间的识别相互作用足够特异并且足够稳定,以便提供寡核苷酸探针和/或引物与预期靶序列之间的优先杂交。增加杂交反应的严格性的条件是本领域已知的,并且包括退火温度和/或盐浓度的优化。寡核苷酸探针可以具有任何合适的长度,例如约、小于约或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100个或更多个核苷酸,其任何部分或全部可以与相应的靶序列(例如,约、小于约或大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸)互补。在一些实施方案中,在单个核酸扩增反应中使用多种探针,如约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25种或更多种探针。在一些实施方案中,单个核酸扩增反应仅含有两种探针,例如一种与来自一种或多种革兰氏阳性菌(例如,约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)的序列特异性杂交,而第二种与来自一种或多种革兰氏阴性菌(例如,约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)的序列特异性杂交。在一些实施方案中,单个核酸扩增反应仅含有一种探针,例如与在多种不同细菌物种(例如,约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50种或更多种物种)中相同的序列和/或在来自多个不同属(例如,约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个属)的细菌中相同的序列特异性杂交的探针。可以基于与多种设计考虑因素中的任一种的一致性来选择探针,这些设计考虑因素可以单独使用,或与本文公开的或本领域已知的任何其他设计考虑因素组合使用。探针的可选设计考虑因素的另外的非限制性实例包括:避免相同核苷酸的区段(例如,连续3、4、5个或更多个相同核苷酸);邻近扩增引物杂交位点而不重叠(例如,沿同一链在引物的3’端与探针的5’端之间约或小于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、30、40、50、75、100个或更多个核苷酸);G-C含量在约20%-80%内,解链温度(Tm)在选定范围内(例如,比相应的引物Tm高约8-10℃);以及C比G多;在5’端没有G。在一些实施方案中,探针与长度为约或至少约25、50、75、100、125、150或175个核苷酸的扩增子特异性杂交,并且当最佳对齐时与表1中的序列具有约或至少约80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%或更高的序列同一性。用于确定最佳序列对齐的方法和算法是本领域已知的,这些中的任一种均可用于确定百分比序列同一性。用于确定两个序列之间的序列同一性的算法的一个实例包括局部序列排比检索基本工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST),如在blast.ncbi.nlm.nih.gov由国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)所维护的。
为了方便检测在杂交测定期间形成的探针-靶标复合物,可将核苷酸探针与可检测标记物结合。合适的可检测标记物可包括:可通过光化学、生物化学、光谱学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。很多种合适的可检测标记物是本领域已知的,其包括荧光标记物、化学发光标记物、放射性同位素标记物、酶标记物和配体。用于检测或定量杂交强度的检测方法通常将取决于上述选定的标记物。例如,可以使用照相胶片或磷光影像分析仪(phosphoimager)检测放射性标记物。可以使用用于检测发射的光的光检测器来检测和定量荧光标志物。在一些实施方案中,单个反应中的多种探针中的每一种均与不同的可检测标记物(例如,具有不同发射光谱的荧光染料)结合,以使得可以区分对应于不同靶标的扩增的信号。通常通过为酶提供底物并测量通过酶对底物的作用而产生的反应产物来检测酶标记物;并且最后通过简单地将有色标记物可视化来检测比色标记物。
在一些实施方案中,使用TaqMan测定来检测结合的探针的杂交(PEBiosystems,FosterCity,Calif.;参见,例如,美国专利号5,962,233和5,538,848,各专利均通过引用并入本文)。该测定在PCR反应期间进行。TaqMan测定利用DNA聚合酶如AMPLITAQDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性。序列特异性探针包含在PCR反应中。典型的TaqMan探针是具有5’-报道分子染料(例如,荧光染料)和3’-猝灭剂染料的寡核苷酸。在PCR期间,如果探针与其靶标结合,则AMPLITAQ聚合酶的5’-3’核溶解活性切割在报道分子与猝灭剂染料之间的探针。报道分子染料与猝灭剂染料的分离导致荧光增加。信号随每一个PCR循环而积累并且可以用荧光计进行监测。多种报道分子-猝灭剂对是本领域已知的。一些报道分子-猝灭剂对通过荧光共振能量转移(FRET)相互作用。常在FRET中用作报道分子或猝灭剂的分子包括但不限于荧光染料(例如,FAM、JOE和HEX)、罗丹明染料(例如,R6G、TAMRA、ROX)、花菁染料(例如,Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)、DABCYL和EDANS。荧光染料是充当报道分子还是猝灭剂通过其激发和发射光谱来确定,并且通过与其配对的荧光染料来确定。例如,FAM被具有488nm波长的光最有效地激发,并且发射500至650nm光谱的光,并且具有525nm的最大发射波长。FAM是用于与例如最大激发波长为514nm的作为猝灭剂的TAMRA一起使用的合适的报道分子标记物。将从荧光染料所吸收的能量耗散的非荧光或暗猝灭剂(darkquencher)的实例包括由BiosearchTechnologies,Inc,(Novato,Calif.,USA)销售的BlackHoleQuenchersTM。BlackHoleQuenchersTM是包含选自取代或未取代的芳基或杂芳基化合物或其组合的至少三个自由基的一类结构,其中这些残基中的至少两个通过环外重氮键连接(参见,例如,国际公开号WO2001086001)。其他暗猝灭剂包括IowaBlack猝灭剂(例如,IowaBlackFQTM和IowaBlackRQTM)、暗猝灭剂(EpochBiosciences,Inc,Bothell,Wash.)和ZenTM猝灭剂(IntegratedDNATechnologies,Inc.;Coralville,IA)。还在美国专利号6,465,175中提供了猝灭剂的另外的非限制性实例。
在一些实施方案中,如在美国专利号5,925,517、PCT申请号WO1995013399和美国专利号6,150,097中描述的,使用分子信标寡核苷酸探针来检测结合探针的杂交。在典型的分子信标中,当探针没有与靶标链杂交时,中心靶标识别序列的侧翼为彼此杂交的臂,从而形成发夹结构,在该结构中靶标识别序列在发夹结构的单链环中,而臂序列形成双链茎杂合体。当探针与靶标杂交时,形成相对刚性的螺旋,从而导致茎杂合体解开并迫使臂分离。FRET对,如荧光团EDANS和猝灭剂DABCYL(或本文中所述的或本领域已知的其他对),可以通过烷基间隔基团与臂连接。当分子信标没有与靶标链杂交时,荧光团的发射被猝灭。当分子信标与靶标链杂交时,FRET对分离,且荧光团的发射没有被猝灭。所发射的荧光标志着靶标链的存在。可以在核酸扩增反应期间,如在PCR反应中的每个循环结束时采用荧光计检测信号。信号强度随靶序列量的增加而增加。
如在Whitcombe等人,DetectionOfPCRProductsUsingSelf-probingAmpliconsandFluorescence,NatureBiotechnology17:804-807(1999年8月)中公开的,PCR产物的检测可以采用自探测扩增子来完成。蝎形引物(ScorpionPrimer)携带包含探针元件、自互补茎序列对和荧光团/猝灭剂对的5’延伸部。“保护”延伸部以防止通过纳入嵌段六乙二醇(hexethyleneglycol,HEG)单体而被拷贝。在一轮从引物开始的PCR延伸后,新合成的靶区域此时连接至与探针相同的链上。在第二轮变性和退火后,探针和靶标杂交,探针随后发出荧光。因此,如本文中描述的“探针”可以作为引物的一部分而存在。
在多个方面的任一方面的一些实施方案中,在核酸扩增反应中扩增的靶序列是保守的细菌多核苷酸的一部分的序列。在一些实施方案中,保守的多核苷酸的扩增部分在不同的细菌属中表现出约或高于约80%、85%、90%、95%、97.5%或更高的同源性。保守的多核苷酸序列的实例包括但不限于,在16SrRNA基因、23SrRNA基因、5SrRNA基因、5.8SrRNA基因、12SrRNA基因、18SrRNA基因、28SrRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、cox1基因和nifD基因中发现的核苷酸序列。在一些实施方案中,保守的多核苷酸是16SrRNA多核苷酸的一部分(例如,rRNA、rDNA、扩增产物或这些的组合)。近40,000种长度大于1250个核苷酸的对齐的16SrDNA序列的列表可见于Greengenes网络应用(Greengeneswebapplication),其为由劳伦斯伯克利国家实验室(LawrenceBerkeleyNationalLaboratory)运行的可公开访问的数据库。其他可公开访问的数据库包括GenBank、密歇根州立大学(MichiganStateUniversity)的核糖体数据库项目(ribosomaldatabaseproject)、马克斯普朗克海洋微生物研究所的Silva数据库(MaxPlanckInstituteforMarineMicrobiology'sSilvadatabase)和国家卫生研究院(NationalInstituteofHealth)的NCBI。扩增靶序列的非限制性实例在表1中示出。在一些实施方案中,扩增子的长度为约或至少约25、50、75、100、125、150或175个核苷酸,并且当最佳对齐时与表1中的序列具有约或至少约80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%或更高的序列同一性。用于确定最佳序列对齐的方法和算法是本领域已知的,这些中的任一种均可用于确定百分比序列同一性。用于确定两个序列之间的序列同一性的算法的一个实例包括局部序列排比检索基本工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST),如在blast.ncbi.nlm.nih.gov由国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)所维护的。
在一些实施方案中,保守的多核苷酸的一部分被由第一引物和第二引物组成的引物对特异性地扩增,该第一引物和第二引物可与在多种不同细菌物种(例如,约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50种或更多种)中相同的序列和/或在来自多个不同属(例如,约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个)的细菌中相同的序列特异性杂交。因此,采用单个通用引物对的扩增可以在单个反应中扩增来自多种不同生物的多核苷酸。在一些实施方案中,引物对包含第一引物和第二引物,该第一引物在其3’端包含来自表1中序列的至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个连续核苷酸,该第二引物在其3’端包含来自表1中相同序列的至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个连续核苷酸的互补序列。在一些实施方案中,核酸扩增反应中的一种或多种引物在其3’端包含选自表2的序列的至少约10、11、12、13、14、15个或全部的核苷酸。在一些实施方案中,在其3’端包含来自SEQIDNO:4的至少约10个核苷酸的第一引物与在其3’端包含来自SEQIDNO:5或6的至少约10个核苷酸的第二引物组合使用。在一些实施方案中,在其3’端包含来自SEQIDNO:7的至少约10个核苷酸的第一引物与在其3’端包含来自SEQIDNO:8的至少约10个核苷酸的第二引物组合使用。在一些实施方案中,在其3’端包含来自SEQIDNO:9的至少约10个核苷酸的第一引物与在其3’端包含来自SEQIDNO:10的至少约10个核苷酸的第二引物组合使用。
在多个方面的一些实施方案中,在单个反应中检测多种生物的存在与否和/或量。在一些实施方案中,所检测的生物是微生物,微生物的非限制性实例包括病毒、类病毒、细菌、古菌、真菌和原生动物。在一些实施方案中,微生物是细菌。所检测的细菌可以是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、或革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的组合。可以在单个反应中检测的细菌的非限制性实例包括以下的两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种):金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、颗粒丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。在一些实施方案中,检测的所有细菌均采用与在所有待检测的细菌中共享的序列互补的单种探针来检测。侧翼为通用引物对并被其扩增的靶序列可以在具有保守多核苷酸的多种不同生物中是不同的(例如,具有一个或多个***、缺失、取代或其组合),在具有保守多核苷酸的多种不同生物中是相同的,或这些的组合。通常,侧翼为通用引物对并被其扩增的靶序列包含核苷酸序列的一个或多个保守内部区域,该保守内部区域在多种不同细菌物种(例如,约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50种或更多种)中是相同的和/或在来自多个不同属(例如,约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个)的细菌中是相同的,该保守内部区域可以用作探针靶标。在一些实施方案中,保守内部区域在多种革兰氏阳性菌中相同而在革兰氏阴性菌中不同,或反之亦然。在一些实施方案中,保守内部区域的长度为约或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75、100个或更多个核苷酸。在一些实施方案中,选择引物使得在待检测的种和/或属中的扩增子序列在待检测的种和/或属中为约或至少约80%、85%、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%或更高的序列同一性。在一些实施方案中,选择引物,以产生在待检测的种和/或属中在靶标长度内的扩增子,如本文所述的任何扩增子长度。
在一些实施方案中,通过扩增的保守内部区域与探针寡核苷酸之间的杂交来检测(并优选地定量)多种细菌种和/或属。通常,来自与保守内部区域特异性杂交的探针的阳性信号指示靶序列的存在,表明至少一种具有该靶序列的生物存在于核酸所来源的样品中。这样,可以采用共有探针来检测多个种和/或属的存在与否和/或量。在一些实施方案中,探针包含来自表1中的序列至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个连续核苷酸,或与其互补的序列。在一些实施方案中,核酸扩增反应中的一种或多种探针包含选自表3的序列的至少约10、11、12、13、14、15个或全部的核苷酸,或其互补序列。在一些实施方案中,包含来自SEQIDNO:11、12或13(或其互补序列)的至少10个核苷酸的一种或多种探针用于检测通过基于SEQIDNO:4-6的引物扩增的扩增产物。在一些实施方案中,包含来自SEQIDNO:14或15(或其互补序列)的至少10个核苷酸的一种或多种探针用于检测通过基于SEQIDNO:7-8的引物扩增的扩增产物。在一些实施方案中,包含来自SEQIDNO:16(或其互补序列)的至少10个核苷酸的探针用于检测通过基于SEQIDNO:9-10的引物扩增的扩增产物。
在多个方面的任一方面的一些实施方案中,选择引物和探针以最大化靶多核苷酸检测的灵敏度。在一些实施方案中,灵敏度以循环阈值(CT)来度量。在初始PCR循环中,荧光信号变化很小。这确定了扩增图(荧光强度相对于循环数的图)的基线。基线以上的荧光增加指示积累的PCR产物的检测。固定的荧光阈值可以设置在基线以上。参数CT定义为荧光超过固定阈值时的部分循环数,该固定阈值通常为统计学上显著高于基线或背景并且在扩增的对数线性阶段中的强度。用于计算给定反应或反应组中荧光的阈值水平的软件通常包含在实时PCR分析软件包中。用于设置阈值的一个常用方法是确定基线(背景)平均信号并设置高于基线平均信号10倍的阈值。或者,阈值可以设置为基线发射的标准差的约10倍。一组标准的初始靶拷贝数的对数相对于CT的图通常为直线。通过测量CT并使用标准曲线确定起始拷贝数来完成未知样品中靶标量的定量。在一些实施方案中,检测在约或多于约3、4、5、6、7、8或更多个log中具有线性检测范围。在一些实施方案中,在扩增反应中来自可通过探针检测的细菌物种中的任一种的约或少于约10pg、5pg、4pg、3pg、2pg、1pg、0.5pg、0.1pg或在其中任何数值之间的范围(例如,0.5-4pg、1pg-5pg、1pg-3pg等)的基因组DNA的扩增具有小于30的CT。在一些实施方案中,在扩增反应中可通过探针检测的靶序列的约或少于约15000、10000、5000、2500、1500、1000、500、200、100、50个或更少的起始拷贝的扩增具有小于30的CT。在一些实施方案中,在扩增反应中来自可通过探针检测的细菌物种中的任一种的约1pg的基因组DNA的扩增具有约或小于约30、29、28、27、26、25或更小的CT。在一些实施方案中,在扩增反应中阴性对照样品的CT比含有约100pg、10pg、5pg、4pg、3pg、2pg、1pg、0.5pg、0.1pg或在其中任何数值之间的范围(例如,0.5-4pg、1pg-5pg、1pg-3pg、5pg-10pg等)的基因组DNA的样品的CT高至少2个循环(例如,至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个循环),该基因组DNA来自可通过探针检测的细菌物种中的任一种。通常,阴性对照为具有所有反应试剂,但没有添加模板(例如,添加水替代模板,或在细菌特异性扩增子的情况下添加已知缺少靶标扩增子的多核苷酸,如人类基因组DNA)的扩增反应。在一些实施方案中,在来自约或少于约25mL、20mL、15mL、10mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1mL、0.1mL或更少的血小板浓缩物的核酸中检测细菌污染。在一些实施方案中,对血小板样品或其一部分进行扩增,而无需首先温育样品(如在高于约30℃、35℃或37℃的温度下)以促进细菌生长。在一些实施方案中,检测产生可检测信号,该信号指示血小板样品中具有约或小于约50、25、10、5、4、3、2、1、0.1个或更少的菌落形成单位/mL(CFU/mL)的细菌负荷的血小板样品细菌污染。在一些实施方案中,当来源于小于50000、40000、30000、25000、20000、15000、10000、7500、5000、2500、1250、1000、750、500、250、100、50、25、10、5或更少的CFU的核酸在检测反应中存在时,检测产生指示血小板样品的细菌污染的可检测信号。在一些实施方案中,获得了含有核酸的反应的可检测信号,该核酸来源于5至50000CFU、500至25000CFU、1000至10000CFU或25至2500CFU。在一些实施方案中,在捐献的血小板样品输注前完成检测,并且如果检测到阳性信号(指示细菌污染),则不将该捐献的血小板输注至接受者体内。在一些实施方案中,在从受试者获得样品(例如,从受试者抽取血液)后约48、24、12、6、4、2或更少的小时内检测具有任何公开的检测阈值或该阈值以上的污染的样品的阳性信号。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中,在生物样品使用之前(例如,在向受试者施用血液样品或来源于血液的样品如血小板样品之前)的某个时间开始检测程序,并在该使用之前产生结果(无论何时采集样品)。例如,可以在生物样品的预期使用之前约或少于约12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时检测生物样品的污染,并且在该预期使用的时间之前(例如,在使用前1、2、3、4、5或更多个小时)获得检测结果。在一些实施方案中,在预期使用的约5小时内检测样品,并且在该预期使用之前获得结果。在一些实施方案中,在预期使用的约2小时内检测样品,并且在该预期使用之前获得结果。在一些实施方案中,在预期使用的约1小时内检测样品,并且在该预期使用之前获得结果。在一些实施方案中,如果通过检测方法检测出细菌污染,则将生物样品废弃而不使用该样品。在一些实施方案中,如果没有检测到细菌污染,则进行生物样品的预期使用。在一些实施方案中,在预期使用之前约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天收集在使用前检测的样品。在一些实施方案中,在预期使用之前约或多于约5天收集在使用前检测的样品。
在一个方面,本公开内容提供了用于在本文公开的任何方法中使用的***。在一些实施方案中,该***用于检测由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的样品(如血小板样品)的细菌污染。在一个实施方案中,该***包含:被配置用于接收客户请求以对样品进行检测反应的计算机;响应所述客户请求,对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应的扩增***,其中所述扩增反应采用单个引物对和单种探针产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约500个碱基的扩增子,并且进一步地,其中来自至少五个属中的任一个的1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的CT;以及向接受者发送报告的报告生成器,其中所述报告含有由所述探针产生的信号强度的检测结果。
在一些实施方案中,所述计算机包含一个或多个处理器。处理器可以与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机***的其他单元相关联,或根据需要植入固件中。如果程序在软件中实现,则该程序可以存储在任何计算机可读存储器如RAM、ROM、闪存、磁盘、光盘或其他存储介质中。同样地,可以通过任何已知的传送方法将该软件传送至计算装置,该传送方法包括,例如,经通信信道如电话线、因特网、无线连接等,或通过可传输介质,如计算机可读磁盘、闪存盘等。多个步骤可以作为多个块、操作、工具、模块或技术实现,这些块、操作、工具、模块或技术反过来可以在硬件、固件、软件或其任意组合中实现。当在硬件中实现时,一些或全部的块、操作、技术等可以在例如定制的集成电路(IC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)、可编程逻辑阵列(PLA)等中实现。在一些实施方案中,计算机被配置用于接收客户请求以对样品进行检测反应。计算机可以直接(例如,通过由客户操作的输入设备如键盘、鼠标或触摸屏,或用户输入客户请求的方式)或间接地(例如,通过有线或无线连接,包括经因特网)接收客户请求。客户的非限制性实例包括提供样品的受试者、医务人员、临床医生、实验室人员、保险公司人员或医疗保健行业中的其他人。
在一些实施方案中,所述***包含用于响应由计算机接收的客户请求,对样品或其一部分进行核酸扩增反应的扩增***。该扩增***可以包含液体处理器、热循环仪、光检测器和/或用于分析检测数据的处理器。在一些实施方案中,样品处理、核酸分离、扩增和/或分析中的一个或多个步骤通过扩增***自动化地进行。在一些实施方案中,自动化可以包括一种或多种液体处理器和相关软件的使用。可以采用几种可商购的液体处理***来运行这类过程的自动化(参见,例如,来自Perkin-Elmer、CaliperLifeSciences、Tecan、Eppendorf、ApricotDesign、Velocity11的液体处理器)。在一些实施方案中,检测包括实时检测仪器。示例性的实时仪器包括但不限于,ABI7000序列检测***(ABI7000SequenceDetectionSystem)、7700序列检测***(ABI7700SequenceDetectionSystem)、AppliedBiosystems7300实时PCR***(AppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystem)、AppliedBiosystems7500实时PCR***(AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem)、AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR***(AppliedBiosystems7900HTFastReal-TimePCRSystem)(全部来自AppliedBiosystems);LightCyclerTM***(RocheDiagnosticsGmbH);Mx3000PTM实时PCR***(Mx3000PTMReal-TimePCRSystem)、Mx3005PTM实时PCR***(Mx3005PTMReal-TimePCRSystem)和多重定量PCR***(MultiplexQuantitativePCRSystem)(Stratagene,LaJolla,Calif.);以及智能循环仪***(SmartCyclerSystem)(Cepheid,由FisherScientific销售)。用于处理和/或测定样品的自动化***的另外的非限制性实例包括AmpliPrep/***(RocheMolecularSystems)、TIGRISDTS***(HologicGen-Probe,SanDiego,CA)、PANTHER***(HologicGen-Probe,SanDiego,CA)、BDMAXTM***(BectonDickinson)、GeneXpert***(Cepheid)、(BioFireDiagnostics)、iCubate***、IDBox***(Luminex)、EncompassMDxTM(Rheonix)、LiatTM分析仪(LiatTMAanlyzer)(IQuum)、Biocartis的分子诊断平台(MolecularDiagnosticPlatform)、ML***(EnigmaDiagnosstics)、***(T2Biosystems)、***(NanoSphere)、GreatBasin的诊断***(DiagnosticSystem)、UnyveroTM***(Curetis)、PanNAT***(Micronics)、SpartanTMRX***(SpartanBioscience)、Atlasio***(AtlasGenetics)、Idylla平台(Biocartis)、ARIES(Luminex)、GenMark的自动化PCR平台(automatedPCRplatform)(例如,eSensor***)、3M集成循环仪(3MIntegratedCycler)(FocusDiagnostics)以及Alerei自动化PCR平台(AlereiautomatedPCRplatform)(Alere)。实时仪器的说明可见于其他地方,即其各自的制造商的用户手册;McPherson;DNAAmplification:CurrentTechnologiesandApplications,Demidov和Broude编著.,HorizonBioscience,2004;以及美国专利号6,814,934。
在一些实施方案中,所述***包含向接受者发送报告的报告生成器,其中该报告含有由探针产生的信号强度的检测结果。报告生成器可以响应由扩增***产生的荧光强度数据而自动地发送报告,如以通过实时PCR分析软件进行的数据分析的形式发送。或者,报告生成器可以响应来自操作者的指令而发送报告。报告可以含有原始信号强度数据、经处理的信号强度数据(例如,图形显示、CT值的确定、模板多核苷酸起始量的计算)、检测到或未检测到细菌污染的结论、和/或源样品中污染的量的定量(如以CFU/mL为单位)。可以使用任何合适的通信介质将报告传送到在本地或远程位置的接收者。例如,通信介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。报告可以通过此类网络或连接(或用于传输信息的任何其他合适的手段,包括但不限于邮寄体检报告,如打印稿)进行传输,以供接收者接收和/或查看。接收者可以是但不限于客户、个人、医疗保健提供者、医疗保健管理者或电子***(例如,一个或多个计算机和/或一个或多个服务器)。在一些实施方案中,报告生成器将报告发送至接收者的装置,如个人计算机、电话、平板计算机或其他装置。报告可以在线查看、存储在接收者的装置上或打印。
图5图示了用于检测样品的细菌污染的示例性***。可将该***理解为可以读取来自介质(例如,软件)和/或网络端口(例如,来自因特网)的指令的逻辑设备,该端口可以任选地连接到具有固定介质的服务器。计算机***可包括CPU、磁盘驱动器、输入设备如键盘和/或鼠标、以及显示器(例如,显示屏)中的一个或多个。数据通信,如指令或报告的传输,可以通过通信介质传输至在本地或远程位置的服务器来实现。通信介质可以包括传输和/或接收数据的任何手段。例如,通信介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这种连接可以提供经万维网的通信。
在一个方面,本公开内容提供了包含代码的计算机可读介质,该代码在由一个或多个处理器执行时,实施根据本文公开的任何方法的方法。在一些实施方案中,计算机可读介质的执行实现了检测由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的生物样品如血小板样品的细菌污染的方法。在一个实施方案中,计算机可读介质的执行实现了这样的方法,该方法包括:响应客户请求以对样品进行检测反应,响应所述客户请求,对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应,其中所述扩增反应采用单个引物对和单种探针产生可检测量的、16SrRNA的不超过约500个碱基的扩增子,并且进一步地,其中来自至少五个属中的任一个的1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的CT;以及生成含有由所述探针产生的信号强度的检测结果的报告。
计算机可读介质可以采取许多种形式,包括但不限于:有形存储介质、载波介质或者物理传输介质。非易失性存储介质包括,例如,光盘或磁盘,如在任何计算机等(如可以用于实施计算步骤、处理步骤等)中的任何存储装置。易失性存储介质包括动态存储器,如计算机的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆;铜线和光纤,包括包含计算机***内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号、或声波或光波(如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些)的形式。因此,计算机可读介质的常见形式包括,例如:软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传送数据或指令的载波、传送该载波的电缆或链路、或计算机可从中读取程序代码和/或数据的任何其他介质。这种形式的计算机可读介质中的许多可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送至处理器以供执行。
在一个方面,本公开内容提供了用于扩增和检测保守多核苷酸的至少一部分的组合物。组合物可以包含本文公开的与多个方面中的任意方面有关的任意组合的一种或多种要素。在一些实施方案中,该保守多核苷酸是16SrRNA多核苷酸(例如,16SrRNA、含有16SrRNA基因的DNA、16SrRNA和/或rDNA扩增产物或这些的组合)。在一些实施方案中,扩增的16SrRNA多核苷酸部分的长度为约或小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50个或更少的核苷酸。在一些实施方案中,该组合物包含:包含SEQIDNO:9的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的第一引物;包含SEQIDNO:10的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的第二引物;以及包含SEQIDNO:16的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的探针。在一些实施方案中,该组合物包含:引物,该引物在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中扩增长度为至少50个核苷酸的扩增子,当最佳对齐时所述扩增子与SEQIDNO:1-3中的任一个具有90%的序列同一性;以及探针,该探针与所述扩增子的任一条链特异性杂交。在一些实施方案中,根据本文公开的一个或多个参数选择引物和探针。例如,可以选择引物和探针,以使得来自多种目标物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)。组合物可以包含在任何适当的容器,如多孔板的孔、板、管、腔室、流动池、微流体装置的腔室或通道、或芯片中。在一些实施方案中,该组合物为脱水形式,如粘附于容器表面的珠子或膜。
在一个方面,本公开内容提供了用于扩增和检测保守多核苷酸的反应混合物。反应混合物可以包含本文公开的与多个方面中的任意方面有关的任意组合的一种或多种要素。在一些实施方案中,该保守多核苷酸是16SrRNA多核苷酸(例如,16SrRNA、含有16SrRNA基因的DNA、16SrRNA和/或rDNA扩增产物或这些的组合)。在一些实施方案中,扩增的16SrRNA多核苷酸部分的长度为约或小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50个或更少的核苷酸。在一些实施方案中,该反应混合物包含:包含SEQIDNO:9的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的第一引物;包含SEQIDNO:10的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的第二引物;以及包含SEQIDNO:16的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的探针。在一些实施方案中,该反应混合物包含:引物,该引物在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中扩增长度为至少50个核苷酸的扩增子,当最佳对齐时所述扩增子与SEQIDNO:1-3中的任一个具有90%的序列同一性;以及探针,该探针与所述扩增子的任一条链特异性杂交。在一些实施方案中,根据本文公开的一个或多个参数选择引物和探针。例如,可以选择引物和探针,以使得来自多种目标物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)。反应混合物可以包含在任何合适的反应位置中。该反应位置可以是容器,如多孔板的孔、板、管、腔室、流动池、微流体装置的腔室或通道、或芯片。该反应位置可以是溶液内的分区,如小滴(例如,在乳液混合物内)。在一些实施方案中,组合物为脱水形式,如粘附于容器表面的珠子或膜。
在一个方面,本公开内容提供了用于检测生物样品如血小板样品的细菌污染的试剂盒。试剂盒可以包含本文公开的与多个方面中的任意方面有关的任意组合的一种或多种要素。在一些实施方案中,该试剂盒包含:包含SEQIDNO:9的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的第一引物;包含SEQIDNO:10的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的第二引物;以及包含SEQIDNO:16的至少约10、11、12、13、14、15个或全部核苷酸的探针。试剂盒中的试剂和其他材料可以包含在任何合适的容器中,并且可以为立即可用的形式或者需要与试剂盒中的其他试剂或使用者提供的试剂组合(例如,浓缩组合物的稀释或冻干组合物的重建)。试剂盒可以提供缓冲液,缓冲液的非限制性实例包括碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。试剂盒可以包含对照样品,例如,用于DNA提取程序对照的已知细菌和/或用作阳性对照或定量标准的纯化的DNA。在一些实施方案中,试剂盒包含根据本文公开的一种或多种方法的试剂盒的使用说明。在一些实施方案中,使用试剂盒的方法包括:用单个引物对对样品或其一部分进行核酸扩增反应,以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约500个碱基的扩增子,其中来自不同属的多种细菌物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子,其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交,并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。
表1:示例性扩增靶序列
表2:示例性引物序列
表3:示例性探针序列
SEQ ID NO:11 | TCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCT |
SEQ ID NO:12 | TCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCT |
SEQ ID NO:13 | TCGAATTAAACCACATGCTCCGCTACT |
SEQ ID NO:14 | AGCTGACGACAGCCATGCAGCACCT |
SEQ ID NO:15 | AGCTGACGACAACCATGCACCACCT |
SEQ ID NO:16 | TGACGTCATCCCCACCTTCCTCC |
SEQ ID NO:127 | AGCTGACGACAGCCATGCACCACCT |
SEQ ID NO:128 | ACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGT30 --> |
SEQ ID NO:129 | ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT |
SEQ ID NO:130 | ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT |
SEQ ID NO:131 | AACGCTGGCGGCGTGC |
SEQ ID NO:132 | AACGCTGGCGGCAGGC |
SEQ ID NO:133 | CGGCGTGCCTAATACATGCAAG |
SEQ ID NO:134 | CGGCAGGCCTAACACATGCAAG |
SEQ ID NO:135 | CGGCAGGCTTAACACATGCAAG |
SEQ ID NO:136 | CGGCGTGCTTAACACATGCAAG |
SEQ ID NO:137 | CGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAA |
SEQ ID NO:138 | CGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAA |
SEQ ID NO:139 | CGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGAT |
SEQ ID NO:140 | CAGTGGCGAAGGCGACTTTCTG |
SEQ ID NO:141 | CAGGGGGCCGCCTTCGCCACCG |
SEQ ID NO:142 | CAGAGAGCCGCTTTCGCCACCG |
SEQ ID NO:143 | GGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGT |
SEQ ID NO:144 | GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT |
SEQ ID NO:145 | GGGAGCGAACAGGCTTAGATACCCTGGT |
SEQ ID NO:146 | ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC |
SEQ ID NO:147 | ACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTC |
SEQ ID NO:148 | ACAAGTAGCGGAGCATGTGGTTTAATTC |
SEQ ID NO:149 | AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG |
SEQ ID NO:150 | AGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCG |
SEQ ID NO:151 | AGTAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCG |
SEQ ID NO:152 | AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG |
SEQ ID NO:153 | AGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCG |
SEQ ID NO:154 | AGTAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCG |
SEQ ID NO:155 | TGTACACACCGCCCGTCA |
表15:作为引物的序列的示例性配对
实施例
提供以下实施例是为了说明本发明的各个实施方案,并不意在以任何方式限制本发明。这些实施例,连同本文中所述的方法一起,是目前优选实施方案的代表,是示例性的,并不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将会想到其变化和其他用途,这些变化和其他用途均涵盖在由权利要求书范围限定的本发明的精神内。
实施例1:
评估了示例性引物对和相应扩增子的示例性探针的特异性、检测范围和检测来自多个不同属的多种细菌物种的能力。在本实施例中,使用具有序列SEQIDNO:9的引物、具有序列SEQIDNO:10的引物和具有序列SEQIDNO:16的探针来扩增和检测16SrRNA基因的保守部分。设计针对序列SEQIDNO:3的引物和探针。用指定量的细菌基因组DNA以及引物、探针、酶、dNTP和其他标准试剂准备实时PCR反应。
为了评估引物-探针组合的灵敏度,一式两份准备含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg和0.1pg大肠杆菌DNA提取物的扩增反应。一式四份准备含有所有共同试剂但用水替换DNA提取物的无模板对照。实时PCR扩增结果的图示在图1中示出。将沿y轴(0到10)的任意荧光强度的对数尺度对沿x轴(0至40)的循环数作图。从左到右,第一对曲线对应于10ng样品(平均CT为约14.5),随后重叠的成对曲线对应于1ng、100pg、10pg、1pg和0.1pg样品(CT为约17.5、21、24.5、27.5和31)。不希望受到理论的限制,以下情况是可能的:四个无模板对照样品在CT36附近的扩增信号可能由商购获得的酶中残留的细菌多核苷酸造成。然而,引物和探针的这种组合的特异性扩增信号提供了6-log的检测范围,且0.1pg的起始模板在来自阴性对照的信号前的至少5个全循环中检测到。事实上,在该范围内的检测是线性的,如图2所示(R2为约0.999,并且在该范围内的扩增效率为约95.5%),因此可以用于定量未知样品中起始物质的量。
在相似的一系列扩增反应中,针对100pg来自于金黄色葡萄球菌Mu3(也称为甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌和肺炎链球菌的DNA的扩增和检测,还有用于比较的10pg大肠杆菌,以及无模板对照(NTC),对该组引物和探针进行了测试,全部一式两份进行。值得注意的是,所测试的细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者。实时扩增结果在表4中示出(“EP”指终点)。
表4
样品 | CT | 终点(在c40处) | |
金黄色葡萄球菌Mu3 | 100pg | 22.2 | 130832 |
金黄色葡萄球菌Mu3 | 100pg | 21.7 | 136136 |
金黄色葡萄球菌 | 100pg | 21.8 | 124004 |
金黄色葡萄球菌 | 100pg | 21.8 | 135570 |
表皮葡萄球菌 | 100pg | 19.0 | 132983 |
表皮葡萄球菌 | 100pg | 18.9 | 144509 |
无乳链球菌 | 100pg | 20.2 | 116510 |
无乳链球菌 | 100pg | 20.4 | 90608 |
酿脓链球菌 | 100pg | 21.0 | 135415 |
酿脓链球菌 | 100pg | 21.0 | 136506 |
肺炎链球菌 | 100pg | 21.3 | 141007 |
肺炎链球菌 | 100pg | 21.2 | 132592 |
大肠杆菌 | 10pg | 28.6 | 93763 |
大肠杆菌 | 10pg | 28.6 | 94028 |
NTC | 0 | 35.9 | 5574938 --> |
NTC | 0 | 35.3 | 57366 |
在其他系列的扩增反应中,针对扩增和检测1pg或10pg(如所指定的)来自金黄色葡萄球菌Mu3、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、颗粒丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌和大肠杆菌的DNA,并与无模板对照(NTC)进行比较,对同一组引物和探针的灵敏度进行了测试。实时扩增结果在表5A中示出(星号表示从平均值和标准差(SD)的计算中排除的离群值;“反应”缩写为“rxn”)。
表5A
准备相似的反应以测试来自蜡状芽孢杆菌的DNA(100pg)作为模板的扩增,并用大肠杆菌模板(100pg)和无模板对照的各自的反应作为对比。实时扩增结果在表5B中示出。
表5B
实施例2:探针和引物组的比较
使用如下指示的三个引物组中的一个和相应的探针,按照实施例1对100pg金黄色葡萄球菌、100pg大肠杆菌或无模板对照(NTC)准备实时PCR反应。引物组1由具有序列SEQIDNO:4的正向引物和两个反向引物组成,两个反向引物中的一个具有序列SEQIDNO:5而另一个具有序列SEQIDNO:6。引物组1的扩增产物采用具有SEQIDNO:11-13的序列的三种探针的混合物进行检测,各扩增产物根据其与不同报道分子的关联独立地检测。引物组1探针被设计用于共同检测宽范围的细菌。例如,SEQIDNO:12被设计用于检测除了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌之外的物种。各个引物组1扩增反应的最终试剂浓度如下:1XTaqman通用主混合物II(UniversalMasterMixII);500nM的各引物;以及500nm的各探针。引物组2由具有序列SEQIDNO:7的引物和具有序列SEQIDNO:8的引物组成。引物组2的扩增产物采用具有序列SEQIDNO:14-15的两种探针的混合物进行检测,各扩增产物均根据其与不同报道分子的关联独立地检测。引物组2探针被设计用于共同检测宽范围的细菌,其中SEQIDNO:14被设计用于检测多种革兰氏阴性菌(尽管不仅限于此),而SEQIDNO:15被设计用于检测多种革兰氏阳性菌(尽管仅限于此)。各个引物组2扩增反应的最终试剂浓度如下:1XTaqman通用主混合物II(UniversalMasterMixII);500nM的各引物;以及500nm的各探针。引物组3由如实施例1中详述的引物对组成,其扩增产物采用具有序列SEQIDNO:16的探针进行检测。引物组3探针被设计用于检测多种细菌。各个引物组3扩增反应的最终试剂浓度如下:1XTaqman通用主混合物II(UniversalMasterMixII);500nM的各引物;500nm的探针。根据TaqMan试剂盒制造商(LifeTechnologies—AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)的建议进行PCR扩增。针对各个模板,一式两份进行各次扩增,在表6中提供了每一次的CT(CT1和CT2)。如表6所示,多种探针产生了与实施例1中描述的探针-引物组所获得的结果相似的结果。探针SEQIDNO:12的结果正如基于其设计所针对的序列所预期的。SEQIDNO:14-15的结果正如基于其设计所针对的序列所预期的。例如,针对革兰氏阴性菌大肠杆菌,SEQIDNO:14产生了较早的CT。而且,针对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌,SEQIDNO:15产生了最早的CT,然而也能够检测大肠杆菌,虽然具有较晚的CT。
表6
实施例3:模拟的血小板样品-没有来自人类DNA的信号
从患者样品如血小板样品提取的DNA通常将包含人类基因组DNA。因此,在人类基因组DNA的存在下,在扩增反应中测试引物和探针的样品组。实时PCR反应如实施例1中所述准备,包含相同的引物和探针。然而,扩增反应包含10ng的人类基因组DNA(而不是细菌DNA)或者作为无模板对照的水,均为一式两份。人类DNA和无模板对照的实时PCR扩增结果的图示分别在图3A和3B中示出。直到约第39个循环仍没有获得人类DNA样品的扩增信号(FAM),表明该引物和探针对细菌序列具有特异性并且会特异性扩增在含有人类DNA的混合样品中的那些序列。而且,人类DNA样品的终点信号强度实际上比无模板对照的终点信号强度低,表明样品中的人类DNA实际上可能减少了后期循环时可能的非特异性扩增产物的形成。
实施例4:探针组比较
实施例1-3证明了根据本公开内容的引物和探针的细菌多核苷酸检测的特异性和灵敏度。在本实施例中,将实施例1中描述的引物和探针(统称“组3”)的灵敏度与Liu等人(Chin.J.BloodTransfusion,2008年9月,vol.21,No.9)和Nadkarni等人(Microbiology(2002),148,257–266)描述的引物和探针进行比较。Liu和Nadkarni描述了使用具有序列SEQIDNO:17(TCCTACGGGAGGCAGCAGT)和SEQIDNO:18(GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT)的引物来扩增细菌16SrRNA的466bp区域(用具有序列SEQIDNO:19(CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC)的探针检测),这些统称为“Liu组”。由于无法鉴定具有在多种细菌中足够保守的相应引物和探针靶序列的扩增子,因此Nadkarni描述了这种大扩增子的人工选择。在第一个比较中,比较了100pg金黄色葡萄球菌、100pg大肠杆菌或无模板对照(NTC)的实时PCR扩增的检测效率。100pg金黄色葡萄球菌的扩增和检测的结果在图4A中图形示出,其中组3的结果在上方而Liu组的结果在下方。100pg大肠杆菌的扩增和检测的结果在图4B中图形示出,其中组3的结果在上方而Liu组的结果在下方。这些图表明采用组3的检测是一致且鲁棒的(robust)。采用Liu组的即使100pg的检测也较弱,在较晚的CT处发生。
第二个比较采用更少量的靶DNA,重复了组3与Liu组比较的上述条件。在该第二个比较中,反应中仅包含10pg的大肠杆菌DNA,该反应与无模板对照反应一起进行。每个反应条件均一式两份运行。实时扩增结果在表7中示出。
表7
引物/探针 | 样品 | CT | 终点(在40个循环时) |
组3 | 10pg大肠杆菌 | 28.6 | 93763 |
组3 | 10pg大肠杆菌 | 28.6 | 94028 |
组3 | NTC | 35.9 | 55749 |
组3 | NTC | 35.3 | 57366 |
Liu组 | 10pg大肠杆菌 | 35.9 | 57975 |
Liu组 | 10pg大肠杆菌 | 34.9 | 60091 |
Liu组 | NTC | 40.0 | 51938 |
Liu组 | NTC | 40.0 | 52522 |
表7中第二个比较的结果表明,Liu组对于区分10pg的细菌DNA与无模板对照不够灵敏,因此不足以检测如此低水平的污染。相比之下,使用组3的10pgDNA的CT比无模板对照的CT早约七个循环,显示了其对细菌DNA的显著增加的灵敏度。不希望受到理论的限制,以下情况是可能的:较短的扩增子(组3为约143bp,对应于SEQIDNO:3;相比于Liu组的约466bp)和/或组3的扩增子内较低的可变性提高了该测定的灵敏度。导致Liu组的低灵敏度的其他潜在影响因素包括SEQIDNO:17引物的相对稳定的同源二聚化(图6A),以及该引物与SEQIDNO:19探针之间的杂交(图6B)。为了评估引物-引物以及引物-探针杂交,采用OligoAnalyzer3.1(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/),使用默认设置(靶标类型—DNA;寡核苷酸浓度—0.25μM;Na+浓度—50mM;Mg++浓度—0mM;dNTP浓度—0mM)测试了二聚体形成。鉴于Nadkarni的结果,令人惊讶且意想不到的是针对16SrRNA靶序列的引物和探针可以提供这样的跨越多种细菌物种和属的灵敏度和特异性。
实施例4:不同猝灭剂的影响
因为实施例4中使用的反应条件和Liu中所用的反应条件相当,所以测试了使用不同猝灭剂的可能的影响。实施例3中的组3探针采用ZenTM内部猝灭剂(IntegratedDNATechnologies,Inc.;Coralville,IA),而Liu组探针采用3’端IowaBlackR猝灭剂(IntegratedDNATechnologies,Inc.;Coralville,IA)(Liu等人所用的原始位置)。为了测试不同猝灭剂的影响,采用组3引物和相应的具有Zen猝灭剂或3’端IowaBlack猝灭剂的FAM标记的探针,如实施例1所述准备实时PCR反应。测试这些引物-探针组合对于一系列量的大肠杆菌DNA的检测,如下所示。每个模板的反应均一式两份准备。实时扩增结果在表8中示出。如这些猝灭剂的可比较的结果所示,所用的猝灭剂的差异并不能解释灵敏度的差异。
表8
实施例5:检测血小板样品中的模仿葡萄球菌
将模仿葡萄球菌在37℃下在ATCC营养肉汤中培养过夜。将培养物用纯水稀释并接种在营养琼脂平板上,并且在37℃温育过夜后对活菌落进行计数,以确定菌落形成单位(cfu)的浓度。将模仿葡萄球菌培养物滴定并标准化至5μL的纯水中,以产生5μL具有100000、10000、1000、100、50、25或0cfu的样品。0cfu样品仅为水,并用作阴性对照。然后将这些5μL细菌样品中的每一个添加至六天前通过单采术采集的195μL回收的人类血小板中。这些样品的有效cfu/mL分别为500000、50000、5000、500、250、125和0。采用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒(GeneJETGenomicDNAPurificationKit)(ThermoScientific)从200μL样品中提取DNA,其中DNA洗脱至45μL洗脱缓冲液中。采用如实施例1中的探针和引物以及约14uL的每种洗脱液,一式三份准备并运行30个循环的实时PCR反应,使得每个反应的cfu数分别为约31250、3125、312.5、31.3、15.6、7.6和0。反应还含有GoTaqMDx热启动聚合酶(GoTaqMDxHotStartPolymerase)(Promega),并且采用StepOnePlus实时PCR仪(StepOnePlusrealtimePCRmachine)(LifeTechnologies)进行。在图7A中提供了所得扩增曲线的图,其中沿x轴的每个方块代表两个循环。从左向右的曲线组对应于31250、31250、3125、312.5、31.3和15.6,其中7.6和0在最右侧。因此该实验的检测极限至少低至15.6cfu,其中平均CT为约26.9。图7A图示了在这些条件下的定量线性度。在图8A-G中分别图示了每个反应31250、31250、3125、312.5、31.3、15.6、7.6和0cfu的单独的扩增曲线。还在表9中总结了实时扩增结果。模仿葡萄球菌滴定的结果与上述采用DNA掺加(spike-in)过程的实施例中获得的结果相似。PCR扩增效率较高,并且没有观察到非特异性扩增结果。
表9
实施例6:检测血小板样品中的多种不同的活细菌
制备了表10中列出的18种细菌物种的细菌样品,并且如实施例5所述与回收的血小板合并。对于含有表10中细菌1-12的样品,以及对于12个仅含血小板的样品,采用Maxwell16MDx仪器(Promega)和Maxwell16LEV血液DNA试剂盒(Maxwell16LEVBloodDNAkit)(Promega)提取DNA。对于含有表10中细菌13-18的样品,以及对于6个仅含血小板的样品,采用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒(GeneJETGenomicDNAPurificatioionKit)(ThermoScientific)手动提取DNA。一式三份准备30个循环的实时PCR反应,并且如实施例5所述(采用如实施例1中所述的探针和引物)运行。在表11中提供了包括每个反应的cfu数的结果。总共测试了72个血小板样品。对于所有含有细菌的样品,均检测到阳性信号,而对于仅含血小板的对照则没有检测到阳性信号。因此,该测定在这些复合物-混合物条件下是100%灵敏且100%特异的。
表10
细菌 | 供应商 | 产品编号 | |
1 | 单核细胞增生利斯特氏菌 | ATCC | ATCC 19115 |
2 | 粪肠球菌 | ATCC | ATCC 19433 |
3 | 金黄色葡萄球菌Mu50 | ATCC | ATCC 700699 |
4 | 克氏柠檬酸杆菌 | ATCC | ATCC BAA-895 |
5 | 肺炎克雷伯氏菌 | ATCC | ATCC 700603 |
6 | 铜绿假单胞菌 | ATCC | ATCC 10145 |
7 | 大肠杆菌 | ATCC | ATCC 700928 |
8 | 酿脓链球菌 | ATCC | ATCC 49399 |
9 | 肺炎链球菌 | ATCC | ATCC 6301 |
10 | 无乳链球菌 | ATCC | ATCC BAA-611 |
11 | 小肠结肠炎耶尔森氏菌 | ATCC | ATCC 23715 |
12 | 表皮葡萄球菌 | ATCC | ATCC 12228 |
13 | 模仿葡萄球菌 | ATCC | ATCC 11631 |
14 | 藤黄微球菌 | ATCC | ATCC 4698 |
15 | 产气肠杆菌 | ATCC | ATCC 13048 |
16 | 蜡状芽孢杆菌 | ATCC | ATCC 14893 |
17 | 粘质沙雷氏菌 | ATCC | ATCC 8100 |
18 | 嗜酸乳杆菌 | ATCC | ATCC 4356 |
表11
实施例7:检测全血和血沉棕黄层中由活细菌引起的污染
从斯坦福血液中心(StanfordBloodCenter)获得回收的全血和血沉棕黄层样品。向样品中掺加大肠杆菌细菌(如实施例5)或大肠杆菌DNA。采用DNeasyBlood&Tissue试剂盒(Qiagen)从掺杂的(spiked)样品中提取DNA。采用如实施例1中所述的探针和引物,以每个反应104cfu或每个反应10pg细菌DNA,一式三份准备并运行40个循环的实时PCR反应。采用StepOnePlus实时PCR仪(LifeTechnologies),如实施例5所述(采用如实施例1中所述的探针和引物)进行实时PCR。在表12和表13中分别提供了掺杂的全血样品和掺杂的血沉棕黄层样品的结果。即使在这些低水平下仍检测到污染,表明该方法可以用于脓毒症的早期检测。
表12
表13
实施例8:血小板样品中金黄色葡萄球菌DNA的DNA滴定和检测
从ATCC(产品编号700698D-5)获得金黄色葡萄球菌Mu3基因组DNA。将DNA滴定并标准化至5μL纯水中,以产生5μL具有10000.0pg、3333.3pg、1111.1pg、370.4pg、123.5pg或0pg细菌DNA的样品。0pg样品仅为水,并用作阴性对照。然后将这些5μL细菌DNA样品中的每一个添加至10天前通过单采术采集的200μL回收的人类血小板中。这些样品的有效pg/mL分别为48780.5、16260.2、5420.1、1806.7、602.2和0。采用Maxwell16MDx仪器(Promega)和Maxwell16LEV血液DNA试剂盒(Promega)通过自动化程序从这些205μL样品中提取DNA。一式三份准备30个循环的实时PCR反应(其中6个重复用于阴性对照),并且如实施例5所述(采用如实施例1中所述的探针和引物)运行。每个反应含有2μL的DNA提取洗脱液(从总共50μL中),分别代表每个反应约400pg、133.3pg、44.4pg、14.8pg、4.9pg和0pg的起始DNA(假设100%有效回收)。在图9中提供了所得扩增曲线的图,其中沿x轴的每个方块代表两个循环。从左向右的曲线组对应于含有400pg、133.3pg、44.4pg、14.8pg、4.9pg和0pg的反应。在表14中总结了定量结果。对于血小板样品中的细菌DNA滴定获得的结果与在缓冲液中稀释(如实施例1中的)获得的结果相似。检测的灵敏度较高,且样品在约27.5的CT处的阳性检测信号代表约4.9pg或更少的起始物质。特异性也较高,因为6个阴性对照样品中的任一个均没有检测到阳性信号。预期自动化提取将最小化由过程污染引起的假阳性。
表14
实施例9:使用主题引物和DNA结合剂对细菌污染的检测
使用含有250pg金黄色葡萄球菌Mu3DNA(ATCC700698D-5)、SEQIDNO.51和52的引物对和DNA结合染料(例如,绿)以及FastGreenMasterMix(ABAppliedBiosystems)中提供的其他试剂的反应混合物进行实时PCR。图10A示出了显示金黄色葡萄球菌DNA的指数扩增的实时扩增图。结果代表一式三份(triplet)实验。然后对所得PCR反应进行解链曲线分析。图10B示出了在预期指示金黄色葡萄球菌DNA的特异性扩增的温度下的单峰。该实验证明,主题引物对适合于扩增的细菌核酸的基于染料的检测。
实施例10:采用主题引物对许多种不同类型的细菌菌株的检测
本文公开了能够检测来自20多种细菌菌株的任意类型细菌的大量引物对,这些细菌菌株常被发现作为生物样品中的污染源。特别地,已经测试了表2和表3中描述的所有引物和探针,并且证明这些引物和探针能够利用本文公开或本领域已知的方法特异性扩增表1中的一种或多种靶细菌序列。另外,表15列出了序列的示例性配对,这些序列已经被测试和/或通过序列同源性被证明是能够利用上述实施例中公开的方法特异性扩增所列出的细菌菌株的有效引物。具体来说,含有两种引物(SEQIDNO9和10)的引物组3已经被测试并且被证明在单个扩增反应中特异性扩增并由此检测20多种细菌菌株,这些菌株包括金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、颗粒丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。
在该引物组中的其他SEQIDNO(即SEQIDNO.47和48)是任选的,因为它们对于在单一反应中扩增以上提到的细菌菌株不是必需的。当与SEQIDNO.9和10在同一反应混合物中使用时,SEQIDNO.47和/或SEQIDNo.48能够提高扩增灵敏度并因此增强丙酸杆菌属种的检测。
相似地,引物组1-2和4-25均已经被测试和/或通过序列同源性被证明能够扩增所列出的细菌菌株。标注为“包括”的引物表现出与在“细菌靶标覆盖范围”列中列出的细菌菌株的保守区域至少85%、90%或95%的序列同源性。指定为“任选”的引物已经被测试和/或通过序列同源性被预测在与一种或多种“包括的”引物一起使用时提供所列出的细菌基因组的更具特异性的扩增。当最佳对齐时,“任选的”序列通常表现出与靶细菌基因组至少99%或100%的序列同源性。这一系列的发现证明了这些引物组的技术优势,因为它们既具有特异性又能够覆盖宽范围的、通常常在生物样品中出现的细菌菌株。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案,但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解,本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围,并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (47)
1.一种检测由至少八种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法,其包括:
在单个反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且所述保守序列在所述至少八种细菌物种中是相同的;以及
检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的杂交产生可检测信号,所述可检测信号指示由所述至少八种细菌物种中的任何物种引起的所述血小板样品的细菌污染。
2.一种检测血小板样品的细菌污染的方法,其包括:
在单个反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且所述样品或其一部分在扩增前没有在35℃以上的温度下进行培养;以及
检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的杂交产生指示所述血小板样品的细菌污染的可检测信号。
3.一种在获得血小板样品后24小时内快速检测该血小板样品的细菌污染的方法,其包括:
在单个反应混合物中采用单个引物对和单种可检测探针,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼,所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列,并且来自任一种物种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及
在获得所述样品后约24小时内,检测所述探针与所述扩增子的杂交,其中由所述探针进行的所述杂交产生指示所述血小板样品的细菌污染的可检测信号,由此在获得所述样品后约24小时内检测所述污染。
4.一种检测受试者的生物样品中由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染的方法,其包括:
用单个引物对对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应,以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800个碱基的扩增子,其中来自所述物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及
采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子,其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交,并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。
5.根据权利要求1-3所述的方法,其中所述血小板样品是通过单采术分离的血小板浓缩物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中使从少于5mL的所述血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。
7.根据权利要求3所述的方法,其中所述检测产生指示血小板样品具有约1.0个菌落形成单位/mL(CFU/mL)的细菌负荷的细菌污染的可检测信号。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于以下的一个或多个:
(a)其中阴性对照样品的CT比含有来自所述多种细菌物种中的任一种的1pg-5pgDNA的样品的CT高至少5个循环;
(b)其中所述生物样品是血小板样品;
(c)其中所述一种或多种可检测探针包括不超过5种不同的探针或不超过2种不同的探针;以及
(d)其中所述一种或多种可检测探针包括不超过2种不同的探针。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述扩增子由细菌16SrRNA多核苷酸模板产生。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于以下的一个或多个:
(a)其中所述细菌污染的检测在向接受者输注之前完成;
(b)其中所述扩增反应产生可检测量的不超过300个碱基或不超过150个碱基的扩增子;
(c)其中所述扩增反应产生可检测量的100-200个碱基的扩增子;
(d)其中所述单个引物对包含第一引物和第二引物,所述第一引物包含如SEQIDNO:4、7或9中所示序列的至少10个连续核苷酸,所述第二引物包含如SEQIDNO:5、6、8或10中所示序列的至少10个核苷酸;
(e)其中所述探针包含如表3中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列;
(f)其中所述核酸扩增反应包含来自所述细菌污染的少于5pg的起始核酸;
(g)其中所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行:聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增;
(h)其中所述核酸扩增反应在孔中、在板中、在管中、在腔室中、在小滴中、在流动池中、在载玻片中、在芯片中、附于固体基底上、附于珠子上或在乳液中进行。
11.根据权利要求1或4中任一项所述的方法,其中所有的细菌物种均为革兰氏阳性菌。
12.根据权利要求1或4中任一项所述的方法,其中所有的细菌物种均为革兰氏阴性菌。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少八种细菌物种包括多种革兰氏阳性菌种和多种革兰氏阴性菌种。
14.根据权利要求4所述的方法,其中所述多种细菌物种包括来自不同属的多种革兰氏阳性菌种和来自不同属的多种革兰氏阴性菌种。
15.根据权利要求0所述的方法,其中所述一种或多种可检测探针包含第一探针和第二探针,所述第一探针与在革兰氏阳性菌种中共有但不存在于革兰氏阴性菌种中的保守序列特异性杂交,所述第二探针与在革兰氏阴性菌种中共有但不存在于革兰氏阳性菌种中的保守序列特异性杂交。
16.根据权利要求1或4所述的方法,其中所述细菌物种选自:金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、颗粒丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。
17.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其包括检测由样品中至少十种细菌物种或样品中至少十五种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述可检测信号具有跨越至少5log的线性检测范围。
19.根据权利要求18所述的方法,其进一步包括根据探针信号确定细菌污染的量。
20.根据权利要求4所述的方法,其中所述探针产生具有跨越至少5log的线性检测范围的信号。
21.根据权利要求20所述的方法,其进一步包括根据所述探针信号确定所述多种细菌物种的丰度。
22.一种用于扩增和检测16SrRNA多核苷酸的一部分的组合物,所述部分的长度小于约800个核苷酸,所述组合物包含:
第一引物,其包含如SEQIDNO:9中所示序列的至少10个连续核苷酸;
第二引物,其包含如SEQIDNO:10中所示序列的至少10个连续核苷酸;以及
探针,其包含如SEQIDNO:16中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。
23.根据权利要求22所述的组合物,其中所述组合物在容器中。
24.一种用于扩增和检测16SrRNA多核苷酸的一部分的组合物,所述部分的长度小于约800个核苷酸,所述组合物包含:
引物,该引物在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中扩增长度为至少50个核苷酸的扩增子,当最佳对齐时所述扩增子与SEQIDNO:1-3中的任一个具有90%的序列同一性;以及
探针,该探针与所述扩增子的任一条链特异性杂交。
25.根据权利要求24所述的组合物,其中所述组合物在容器中。
26.根据权利要求24所述的组合物,其中,在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中,使用所述引物和探针对来自多种目标物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)。
27.一种用于扩增和检测16SrRNA多核苷酸的一部分的反应混合物,所述部分的长度小于约800个核苷酸,所述反应混合物包含:
样品核酸;
引物,该引物在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中扩增长度为至少50个核苷酸的扩增子,当最佳对齐时所述扩增子与SEQIDNO:1-3中的任一个具有90%的序列同一性;
探针,该探针与所述扩增子的任一条链特异性杂交;以及
聚合酶;
其中所述反应混合物在反应位置中。
28.根据权利要求27所述的反应混合物,其中所述反应位置是小滴、孔、板、管、腔室、流动池或芯片。
29.根据权利要求27所述的反应混合物,其中,在与靶16SrRNA多核苷酸的扩增反应中,使用所述引物和探针对来自多种目标物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)。
30.一种用于检测血小板样品的细菌污染的试剂盒,所述试剂盒包含:
第一引物,其包含如SEQIDNO:9中所示序列的至少10个连续核苷酸;
第二引物,其包含如SEQIDNO:10中所示序列的至少10个连续核苷酸;
探针,其包含如SEQIDNO:16中所示序列的至少10个连续核苷酸,或其互补序列。
31.一种使用根据权利要求0所述的试剂盒的方法,所述方法包括:
用单个引物对对样品或其一部分进行核酸扩增反应,以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800个碱基的扩增子,其中来自不同属的多种细菌物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT);以及
采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子,其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交,并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。
32.一种用于检测由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的***,其包括:
被配置用于接收客户请求以对样品进行检测反应的计算机;
响应所述客户请求,对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应的扩增***,其中所述扩增反应采用单个引物对和单种探针产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800个碱基的扩增子,并且进一步地,其中来自至少五个属中的任一个的1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的CT;以及
向接收者发送报告的报告生成器,其中所述报告含有由所述探针产生的信号强度的检测结果。
33.根据权利要求0所述的***,其中所述报告生成器根据由所述探针产生的信号强度将所述样品确定为污染的或未污染的。
34.根据权利要求0所述的***,其中所述接收者是客户。
35.一种检测由至少五种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法,其包括:
在反应混合物中,使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应,所述反应混合物包含第一正向引物和第一反向引物,其中所述第一正向引物和第一反向引物各自与单独的区域杂交,该单独的区域在至少5种不同的细菌基因组中是保守的;
从所述反应混合物检测指示所述量的扩增子的存在的信号,由此检测由所述至少五种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述第一正向引物和第一反向引物各自与在至少15种不同的细菌基因组中保守的单独的区域杂交。
37.根据权利要求35所述的方法,其中当最佳对齐时,所述第一正向引物和第一反向引物各自表现出与所述单独的区域至少80%的序列同源性。
38.根据权利要求35所述的方法,其中反应混合物进一步包含第二正向引物,当与所述至少五种细菌基因组中的任一种或全部最佳对齐时,所述第二正向引物表现出至少80%的序列同源性。
39.根据权利要求35所述的方法,其中反应混合物进一步包含第二反向引物,当与所述至少五种细菌基因组中的任一种或全部最佳对齐时,所述第二反向引物表现出至少80%的序列同源性。
40.根据权利要求35所述的方法,其中所述反应混合物进一步包含可检测标记物。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述可检测标记物是DNA结合染料。
42.根据权利要求35所述的方法,其中所述扩增子包含靶16SrRNA多核苷酸。
43.根据权利要求35所述的方法,其中所述至少五种细菌物种选自:金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、颗粒丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。
44.根据权利要求35所述的方法,其中在使得来自所述至少五种细菌物种中的任一种的约1pg-5pgDNA具有小于30的循环阈值(CT)的条件下进行核酸扩增。
45.根据权利要求3所述的方法,其中所述细菌污染的检测在将所述血小板样品输注接受者体内之前完成。
46.根据权利要求35所述的方法,其中所述细菌污染的检测在将所述血小板样品输注接受者体内之前完成。
47.一种计算机可读介质,其包含代码,该代码在由一个或多个处理器执行时,实施检测由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法,所述方法包括:
接收客户请求以对样品进行检测反应;
响应所述客户请求,对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应,其中所述扩增反应采用单个引物对和单种探针产生可检测量的、16SrRNA的不超过约800个碱基的扩增子,并且进一步地,其中来自至少五个属中的任一个的1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的CT;以及
生成含有由所述探针产生的信号强度的检测结果的报告。
Priority Applications (1)
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Address after: American California Applicant after: Decheng Molecular Diagnosis Address before: American California Applicant before: DCH MOLECULAR DIAGNOSTICS INC. |
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