CN105473613A - 产生中和金黄色葡萄球菌lukgh(lukab)毒素的高效抗体 - Google Patents

产生中和金黄色葡萄球菌lukgh(lukab)毒素的高效抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN105473613A
CN105473613A CN201480038825.0A CN201480038825A CN105473613A CN 105473613 A CN105473613 A CN 105473613A CN 201480038825 A CN201480038825 A CN 201480038825A CN 105473613 A CN105473613 A CN 105473613A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
lukgh
mixture
antigen
lukg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480038825.0A
Other languages
English (en)
Inventor
E·纳吉
A·巴达罗
H·劳哈
Z·毛焦里奇
S·策特尔
M·B·巴托斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
X4 Pharmaceuticals Austria GmbH
Original Assignee
Arsanis Biosciences GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arsanis Biosciences GmbH filed Critical Arsanis Biosciences GmbH
Publication of CN105473613A publication Critical patent/CN105473613A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70553—Integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明主题涉及一种包含LukGH复合物的分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素抗原、一种与LukGH复合物特异性结合的抗体，及在确定金黄色葡萄球菌LukGH双组分溶细胞素的结合或毒性的方法中使用的人CD1lb/CD18复合物。

Description

产生中和金黄色葡萄球菌LUKGH(LUKAB)毒素的高效抗体
背景技术
金黄色葡萄球菌(S.aureus)是最重要的人类病原体之一，引发人类从无症状定植和中度皮肤感染到严重的深度组织感染、肺炎、血液感染和败血症等范围广泛的各种感染。这种病原体利用几种致病机制引发疾病和干扰宿主防御。它最有效的毒力因子之一是专门杀死白细胞，特别是吞噬细胞的杀白细胞素。LukGH(亦称为LukAB)是最近被鉴定出来的杀白细胞素，能够溶解多形核细胞(PMN)、单核细胞和树突状细胞(Dumontetal,2011；Venturaetal,2010)，还可以激活它们，产生促炎细胞因子。US20110274693A1描述了LukA或LukB抗体，特别是抗-LukA多克隆抗体。
LukGH是一种类似于HlgAB、HlgCB、LukED和LukSF(PVL)的双组分溶细胞素。LukH(S-组分)和LukG(F-组分)与上面提到的双组分杀白细胞素的S组分和F组分分别具有大约30％和40％的氨基酸同源性。
Malachova等人(TheJournalofInfectiousDiseases,Epub2012Aug.7,vol.206,no.8,pp1185-1193)描述了LukGH的纯化，采用SDS-PAGE分析时，LukGH具有两条独立的条带。
LukGH是最多变的双组分金黄色葡萄球菌毒素。虽然LukSF、LukED和HlgABC在不同的金黄色葡萄球菌菌株中高度保守，但是，LukGH显示高达14％的氨基酸变化。这种氨基酸差异水平几乎接近在两种不同毒素如HlgCvsLukS或LukSvsHlgAC或LukE之间观察到的水平(～16％差异性)。关于LukGH的作用的数据很少，而且数据都是采用彼此几乎相同的Newman菌株和LAC菌株(USA300)的两个序列得到的。人们不知道其它变体对人细胞是否有活性，特别是来自两种金黄色葡萄球菌基因组的两个序列——MRSA252(EMRSA16)和MSHR1132(“银”金黄色葡萄球菌)，它们被认为与USA300和其它金黄色葡萄球菌克隆复合物最不相同。
根据金黄色葡萄球菌培养上清液的PMN裂解活性，LukGH似乎是人类天生细胞最有效的白细胞毒素之一(Dumontetal,2013,Maiachowaetal,2012)。因此，有理由认为，在金黄色葡萄球菌引发的疾病期间，通过中和抗体抑制LukGH的毒素作用具有积极的效果，并且通过减少迁移到感染部位的吞噬细胞，支持宿主防御。我们的目的是利用中和LukGH毒素的单克隆抗体，开发出预防和治疗人类金黄色葡萄球菌感染的人类治疗方法。
根据文献，双组分杀白细胞素中的S组分识别细胞表面受体，这种相互作用诱导构象变化，导致F组分结合和形成LukSF和HlgAB的八聚体跨膜孔隙结构(Colin,InfectImmun,1994:3184；Meunier,BiochimBiophysActa,1997:275)。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌细胞毒素LukGH(亦称为LukAB)的抗体，这种抗体与这种毒素LukGH的不同变体具有交叉反应性，并提供交叉中和效力。
本发明的目的通过本发明的主题达到。
本发明提供一种包含LukGH复合物的分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素抗原。
特别是，该LukGH复合物包括LukG和LukH组分的二聚体或低聚体。特别是，LukGH复合物是异源二聚体或低聚体LukGH抗原。这种抗原特别是以水相中可溶的异源二聚体或低聚体的形式提供，特别是不与在LukGH结合时容易发生细胞溶解的细胞(如PMN、单核细胞或树突状细胞)的表面结合。
特别是，LukGH复合物由源自金黄色葡萄球菌菌株的重组蛋白与/或蛋白组成。
特别是，LukG和LukH组分由天然来源与/或共-重折叠纯化的重组宿主细胞共表达。
特别是，抗原是以可溶形式的蛋白复合物提供。
特别是，抗原能够与人CD11b/CD18受体结合。
本发明进一步提供一种与LukGH复合物特异性结合的抗体。特别是可以证明，与单独(单体)的LukG或LukH的结合相比，本发明抗体与异源二聚体或低聚体LukGH抗原的结合明显改善很多。
特别是，所述抗体能够中和LukGH复合物。
特别是，抗体与源自USA300克隆，优选源自TCH1516菌株的LukGH复合物，及至少一个LukGH复合物变体结合。
特别是，与源自USA300克隆的LukGH复合物相比，LukGH复合物变体在LukG或LukH任一组分的氨基酸序列中有至少一个点突变，例如，序列中一个或多个氨基酸残基的改变。甚至源自MRSA252和MSHR1132菌株的完全不同的LukGH复合物变体也可以与本发明的抗体交叉特异性结合和交叉中和。
特别是，源自USA300克隆的LukGH复合物包括含SEQID4氨基酸序列的LukG组分与/或含SEQID2氨基酸序列的LukH组分。
特别是，LukGH复合物变体包括含选自SEQID8、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的LukG组分与/或含选自SEQID6、10、21、22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的LukH组分。
特别是，抗体交叉中和LukGH复合物和LukGH复合物变体。
本发明进一步提供测定金黄色葡萄球菌LukGH双组分溶细胞素结合或毒性的方法中使用的人CD11b/CD18复合物。
特别是，CD11b/CD18复合物以其天然形式、或分离形式或固定形式使用。
本发明特别提供一种交叉中和抗体，其包括至少一个与源自USA300克隆(如菌株TCH_1516)的LukGH及至少一个LukGH变体结合的多特异性结合位点。特别是，LukGH毒素选自EMRSA16MRSA252菌株或MSHR1132菌株表达的基因。
出乎意料的是，我们发现，应用能够产生金黄色葡萄球菌其它双组分白细胞毒素的中和抗体的同一方法对LukGH毒素无效。本发明对这种毒素的不同作用模式进行描述，特别提供毒素复合物，而不是单一无毒组分用于选择和产生抗体。
特别是，本发明的抗体是全长单克隆抗体或其片段，所述片段包含至少一个含结合位点的抗体域，优选抗体选自鼠源、嵌合、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体(如VH、VHH或VL)，优选人IgG1抗体。
抗体优选结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M。
根据本发明的一个具体方面，在基于细胞的试验中，抗体显示出体外中和效力，IC50低于50:1mAb:毒素比率(mol/mol)，优选低于10:1，更优选低于1:1。
根据本发明另一个具体方面，抗体中和动物(包括人和非人的动物)中的靶向毒素，并抑制体内金黄色葡萄球菌的发病机理，优选任何肺炎、菌血症或败血症、腹膜炎和骨髓炎模型。
根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，其中在一定条件下培养或维持本发明的重组宿主细胞，以产生所述抗体。
根据本发明另一个方面，本发明提供一种鉴定候选保护抗体的方法，包括：
(a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样本；及
(b)评价样本中的抗体或样本产生的抗体与本发明LukGH复合物的结合，其中抗体和LukGH复合物之间呈阳性反应鉴定出抗体是候选保护抗体。
根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
(a)提供按照本发明鉴定方法鉴定的候选保护抗体；及
(b)产生单克隆抗体，或人源化或人形式的候选保护抗体，或其与候选保护抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
(a)采用本发明的LukGH复合物给非人动物免疫接种；
(b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
(c)筛选b)中获得的细胞系，以鉴定产生与LukGH复合物结合的单克隆抗体的细胞系；及
(d)产生所述单克隆抗体，或人源化或人形式的抗体，或其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
(a)采用本发明的LukGH复合物给非人动物免疫接种；
(b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
(c)筛选细胞系，以鉴定产生与LukGH复合物和至少一种LukGH复合物变体结合的单克隆抗体的细胞系；
(d)产生所述单克隆抗体，或人源化或人形式的抗体，或其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
根据另一个方面，本发明提供本发明抗体的医学用途，包括人类医学用途和兽类医学用途。特别是，抗体用于处理存在金黄色葡萄球菌感染风险或者患有金黄色葡萄球菌感染的主体，包括给主体施用有效量的抗体，以限制主体的感染，改善所述感染引起的病症或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病(pathogenesis)。
特别是，抗体用于防止金黄色葡萄球菌感染。
根据本发明的具体方面，进一步提供一种处理方法，其中存在金黄色葡萄球菌感染风险或患有金黄色葡萄球菌感染的主体被处理，该方法包括给主体施用有效量的抗体，以限制主体的感染，改善所述感染引起的病症或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病。
特别是，所述处理方法用于防止病原性金黄色葡萄球菌。
根据一个具体实施例，抗体以肠胃外或粘膜制剂施用。
根据本发明另一个方面，本发明提供本发明抗体的药物制剂，优选包括肠胃外或粘膜制剂，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
根据另一个方面，本发明提供本发明的抗体，用于检测任何金黄色葡萄球菌感染的诊断用途，所述感染包括高毒素产生的MRSA感染，如坏死性肺炎，和疖病和痈病中毒素的产生。
特别是，抗体提供用于本发明的用途，其中通过用所述抗体接触所述主体的体液样本，离体测定主体的全身性金黄色葡萄球菌感染，其中出现抗体的特异性免疫反应则确定存在感染。
根据本发明的一个具体方面，进一步提供一种诊断主体金黄色葡萄球菌感染的方法，包括高毒素产生的MRSA感染，如坏死性肺炎，和疖病和痈病中毒素的产生。
特别是，提供这种诊断方法，其中通过用所述抗体接触所述主体的体液样本，离体测定主体的全身性金黄色葡萄球菌感染，其中出现抗体的特异性免疫反应则确定存在感染。
根据本发明另一个方面，本发明提供本发明抗体的诊断制剂，任选包含带有标签的抗体与/或带有标签的其它诊断试剂。
根据本发明另一个方面，本发明提供一种免疫原，其包括：
(a)本发明的LukGH复合物；
(b)任选与(a)中所述LukGH复合物非天然相关的其它表位或抗原；及
(c)载体。
特别是，载体是药学上可接受的载体，优选包含缓冲物质与/或佐剂物质。
本发明的免疫原优选以疫苗制剂提供，优选用于肠胃外用途。
特别是，本发明的免疫原提供用于医学用途，特别是通过施用有效量的所述免疫原处理主体，以防止主体受金黄色葡萄球菌感染，或预防所述感染引发的病症，或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病。
特别是，本发明的免疫原提供用于引发保护性免疫应答。
根据本发明的一个具体方面，进一步提供一种处理方法，其中主体存在金黄色葡萄球菌感染风险，所述方法包括给主体施用有效量的免疫原，以预防主体感染，尤其是防止病原性金黄色葡萄球菌感染。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种编码本发明抗体的分离核酸，或编码本发明抗原的分离核酸，特别是编码LukGH复合物或融合蛋白的分离核酸。
附图说明
图1：A：如实例3所描述，采用源自USA300_TCH1516、MRSA252(CC30、ST36)和MSHR1132(CC75、ST1850)菌株的差异最大的三类LukG和LukH序列，通过人吞噬细胞确定LukGH的毒性。B：来自不同金黄色葡萄球菌株基因组的LukG和LukH序列的关联性；C：LukG和LukH序列变体的氨基酸序列比对(序列参见图12)：
LukG:ST36_MRSA252-SEQID8；
ST30_E1410-SEQID13；
CC133_ED133-SEQID4；
ST59_M013-SEQID20；
ST1_MW2-SEQID15；
ST8_COL-SEQID16；
ST5_USA300_TCH1516-SEQID4；
ST239_JKD6159-SEQID18；
ST398_0385-SEQID14；
CC10/ST10_H19-SEQID19；
ST1850_MSHR1132-SEQID12.
LukH:ST5_Mu50-o-SEQID23；
ST5_N315-SEQID24；
ST8_USA300TCH1516-SEQID2；
ST239_JKD6159-SEQID28；
ST80_11819-97-SEQID25；
ST22_EMRSA-15-SEQID27；
ST59_M013-SEQID26；
ST1850_MSHR1132-SEQID10；
ST10_H19-SEQID21；
ST398_ST398-SEQID22；
ST36_MRSA252-SEQID6。
图2：如实例3所描述，LukG或LukH产生的抗体缺少LukGH毒素中和。
图3：如实例3所描述，如果mAb首先与单组分结合，用LukG或LukH产生的抗体检测LukGH毒素中和。
图4：如实例4所描述，不接触靶细胞，LukH和LukG形成复合物。
图5：如实例4所描述，LukH和LukG以二聚体的形式存在于溶液中。
图6：如实例5所描述，利用分化的HL-60细胞，采用LukGH复合物选择而发现的高效LukGH中和抗体。A：采用重组LukGH_TCH1516复合物进行测试；B：采用金黄色葡萄球菌USA300_TCH1516分泌的和细菌培养上清液中存在的天然LukGH进行测试。
图7：如实例5所描述，利用刚分离的人PMN，采用LukGH复合物选择而发现的高效LukGH中和抗体。A：采用重组LukGH_TCH1516复合物进行测试；B：采用重组LukGH_MRSA252复合物进行测试。C.如实例5所描述，LukGH抗体与LukG、LukH和LukGH变体在Forte-Bio中结合。
图8：如实例5所描述，LukGH毒素中和mAb抑制LukGH与人吞噬细胞结合。
图9：如实例6所描述，CD11b/CD18复合物被鉴定为人LukGH受体。A：纯化蛋白的银染SDS-PAGE凝胶；B：胰蛋白酶肽的质谱分析；C：采用抗-人CD11b抗体的纯化复合物的蛋白质印迹分析。
图10：A.LukGH八聚体的结构，LukG为黑色，LukH为灰色。B.LukG–LukH界面1，涉及静电相互作用的残基以棒条表示，盐桥以虚线表示。C.LukG-LukH界面2，涉及静电相互作用的残基(在小图中标记)以棒条表示，盐桥以虚线表示。
图11：A.在Forte-Bio中，LukG与固定在链霉亲和素传感器上的生物素化的LukH或LukH2结合。B.在20mMHepespH7.5+50mMNaCl中，在1mM戊二醛存在下，在37℃培养指示的一段时间，采用SDS-PAGE监测，LukG和LukH(WT和变体，每种35μg/ml)的交联情况。
图12：序列ID
SEQID1：USA300TCH1516菌株的LukH核苷酸序列
SEQID2：USA300TCH1516菌株的LukH氨基酸序列
SEQID3：USA300TCH1516菌株的LukG核苷酸序列
SEQID4：USA300TCH1516菌株的LukG氨基酸序列
SEQID5：MRSA252菌株的LukH核苷酸序列(Genbank，登记号：BX571856)
SEQID6：MRSA252菌株的LukH氨基酸序列
SEQID7：MRSA252菌株的LukG核苷酸序列
SEQID8：MRSA252菌株的LukG氨基酸序列
SEQID9：MSHR1132菌株的LukH核苷酸序列(Genbank，登记号：FR821777)
SEQID10：MSHR1132菌株的LukH氨基酸序列
SEQID11：MSHR1132菌株的LukG核苷酸序列
SEQID12：MSHR1132菌株的LukG氨基酸序列
SEQID13：LukGST30_E1410氨基酸序列
SEQID14：LukGST398_0385氨基酸序列
SEQID15：LukGST1_MW2氨基酸序列
SEQID16：LukGST8_COL氨基酸序列
SEQID17：LukGCC133_ED133氨基酸序列
SEQID18：LukGST239_JKD6159氨基酸序列
SEQID19：LukGCC10/ST10_H19氨基酸序列
SEQID20：LukGST59_M013氨基酸序列
SEQID21：LukHST10_H19LukH氨基酸序列
SEQID22：LukHST398_ST398氨基酸序列
SEQID23：LukHST5_Mu50-o氨基酸序列
SEQID24：LukHST5_N315氨基酸序列
SEQID25：LukHST80_11819-97氨基酸序列
SEQID26：LukHST59_M013氨基酸序列
SEQID27：LukHST22_EMRSA-15氨基酸序列
SEQID28：LukHST239_JKD6159氨基酸序列
具体实施方式
本发明中使用的词语“抗体”指的是由抗体域组成或包括抗体域的多肽或蛋白质，抗体域理解为具有或不具有连接序列的免疫球蛋白的重链与/或轻链的恒定域与/或可变域。如果多肽包含β-桶状结构，所述β-桶状结构由环序列连接的抗体域结构的至少两条β条带组成，则多肽理解为抗体域。抗体域可能具有天然结构或通过突变或衍生修饰，例如，修饰抗原的结合性质或任何其它性质，如稳定性或功能性，例如，与Fc受体FcRn与/或Fcgamma受体结合。
本发明使用的抗体具有结合一个或多个抗原或这些抗原的一个或多个表位的特异性结合位点，特别是包括单一可变抗体域如VH、VL或VHH的CDR结合位点，或可变抗体域对如VL/VH对的结合位点，包含VL/VH域对和恒定抗体域的抗体，如Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。
本发明所述“抗体”特别指的是包含或由以下组成的抗体形式：单一可变抗体域，如VH、VL或VHH，或可变与/或恒定抗体域的组合，带或不带连接序列或铰链区，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域或由VL/VH域对和恒定抗体域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。词语“全长抗体”可用于指任何包含Fc域及其它天然抗体单体中通常发现的其它域的至少大部分的任何抗体分子。本发明使用此术语用于强调具体的抗体分子并非抗体片段。
词语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上无其它针对不同靶抗原的抗体或包含抗体域的不同结构安排。但是，分离抗体可能包含在组合制剂中，所述组合制剂包含分离抗体，例如，与至少一种其它抗体(如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段)的组合。
词语“抗体”应适用于动物来源抗体，包括人类，如哺乳动物，包括人、鼠科动物、兔子、山羊、羊驼、牛和马或鸟类，如母鸡。
词语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列(如鼠科动物和人序列)的嵌合抗体。
谈到抗体时使用的词语“嵌合”指的是那些抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分，与源自特定物种的抗体或属于特定类别的抗体中的对应序列同源，而链的其余片段与另一物种或类别的对应序列同源。一般说来，轻链和重链的可变区模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一种哺乳动物的抗体序列同源。例如，可变区利用来自非人宿主有机体的容易获得的B-细胞或杂交瘤，从目前已知的来源获得，与恒定区组合，所述恒定区源自，例如，人细胞制备物。
词语“抗体”进一步适用于人源化抗体。
谈及抗体时的词语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点基本上源自非人类物种的免疫球蛋白，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构与/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或仅为接枝到可变域合适框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或经修饰的，例如，被一个或多个氨基酸替换修饰，优选经修饰后更接近人免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体包含了来自小鼠抗体的所有六个CDR)。其它形式相对原抗体有一个或多个CDR被更改。
词语“抗体”进一步适用于人抗体。
谈及抗体时使用的词语“人”理解为包括源自人生殖系免疫球蛋白序列的具有可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外随机或定点突变或体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或包括从动物转基因得到的一个或多个人免疫球蛋白的分离的抗体。
该词语特别适用于任何类别或子类别的抗体。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体可以分为抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM大类，这些中的几个可以进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
该词语进一步适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，重组抗体包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构，例如，源自动物的抗体，所述动物如哺乳动物，包括人，包括来自不同来源的基因或序列，例如，嵌合抗体、人源化抗体或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从重组体、抗体组合文库或抗体域分离的抗体，或通过其它涉及将抗体基因序列剪接到其它DNA序列上的方法制备、表达、产生或分离的抗体。
应理解，词语“抗体”还指的是抗体的衍生物，尤其是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一种或多种抗体域或抗体与/或融合蛋白的任何组合，其中抗体的任何域可在一种或多种其它蛋白，如其它抗体的任何位置融合，如包含CDR环的结合结构、受体多肽，还有配体、支架蛋白、酶、毒素等。抗体的衍生物可通过各种化学方法，如共价偶联、静电相互作用、二硫键连接等与其它物质联合或结合而获得。与抗体结合的其它物质可以是脂类、糖类、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前体药物或药物)。在具体实施例中，抗体是包含能够与生物学上可接受的化合物特异性相互作用的其它标记的衍生物。本发明可以使用的标记并没有特别的限制，只要其对抗体与它的目标的结合没有任何不良影响或不良影响可以忍受即可。合适的标记实例包括His-标记、Myc-标记、FLAG-标记、Strep-标记、钙调蛋白-标记、GST-标记、MBP-标记和S-标记。在本发明的另一个具体实施例中，抗体是包含标签的衍生物。此处使用的词语“标签”指的是可以检测到的化合物或组合物，其与抗体直接或间接结合，从而产生“带标签”的抗体。标签可以是本身可以检测到的标签，例如，放射性同位素标签或荧光标签，或者，在酶标签的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物发生化学变化。
本发明所描述的优选衍生物在抗原结合方面是功能活性的，优选具有中和金黄色葡萄球菌的效力与/或是保护抗体。
应理解，词语“抗体”还指的是抗体的变体。
词语“变体”应尤其指的是，例如，通过突变方法得到的抗体，如突变抗体或抗体片段，尤其是删除、交换氨基酸序列、引入***到特定抗体氨基酸序列中或区域中或化学衍生氨基酸序列，如在恒定区中，从而改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变域中，从而改善抗原结合性质，如通过本领域可以实现的亲和力成熟技术。可以采用本领域熟悉的任何突变方法，包括期望位置处的点突变，如通过随机化技术获得。在某些情况下，位置是随机选择的，例如，采用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。词语“突变”指的是本技术领域认可的改变多核苷酸或多肽序列的任何技术。优选的突变类型包括易错PCR突变、饱和突变或其它定点突变。
词语“变体”应特别包括功能活性变体。
此处使用的抗体的“功能活性变体”指的是，例如，通过***、删除或替换一个或多个氨基酸，或化学衍生氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列内的核苷酸，或在序列的任一端或两个远端处的核苷酸，对此序列(亲本抗体或亲本序列)进行修饰得到的序列，所述修饰并不影响(尤其是不损害)此序列的活性。若为对选定的靶抗原具有特异性的结合位点，则抗体的功能活性变体将仍然具有预定的结合特异性，虽然这可能会改变，例如，以改变特定表位的精细特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。特别是，本发明抗体的功能活性变体具有结合Hla和金黄色葡萄球菌双组分毒素中至少一种毒素的多特异性结合位点，这将在下面进一步进行描述。
功能活性变体可以通过以下方法得到：例如通过改变亲本抗体的序列，但在除结合位点之外的抗体区内进行修饰，或源自亲本抗体，通过不损害抗原结合的修饰，并且优选具有与亲本抗体类似的生物活性，包括结合金黄色葡萄球菌LukGH复合物的能力与/或中和金黄色葡萄球菌的特定效力，例如，具有基本上相同的生物活性，生物活性采用靶向金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌毒素的特异性结合试验或功能性测试确定。此处所用的词语“基本上相同的生物活性”指的是其活性是确定的亲本抗体活性的至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或甚至至少100％，或至少110％，或至少120％，或至少130％，或至少140％，或至少150％，或至少160％，或至少170％，或至少180％，或至少190％，例如，高达200％。
在优选的实施例中，亲本抗体的功能活性变体：
a)是抗体的生物活性片段，所述片段包括分子序列的至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；
b)源自至少一个氨基酸替换、增加与/或删除的抗体，其中功能活性变体与分子或分子的一部分具有序列一致性，如序列一致性至少50％的抗体，优选至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；与/或
c)由抗体或其功能活性变体及另外至少一个与多肽或核苷酸序列同源的氨基酸或核苷酸组成。
在本发明一个优选的实施例中，本发明抗体的功能活性变体基本上与上面描述的变体相同，但是，其多肽或核苷酸序列分别不同，不同之处在于它是源自不同物种的同源序列。这些都称为天然变体或类似物。
词语“功能活性变体”还包括天然存在的等位变体，以及突变体或任何其它非天然存在的变体。正如本技术领域熟悉的那样，等位变体是一种(多)肽替代形式，其特征在于替换、删除或增加一个或多个氨基酸，基本上不改变多肽的生物功能。
功能活性变体可通过改变多肽或核苷酸序列中的序列得到，例如，通过一个或多个点突变，其中，当与本发明一起使用时，所述序列改变保留了未变动多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于，(保守)替换、增加、删除、突变和***。
具体的功能活性变体有CDR变体。CDR变体包括CDR区中至少一个氨基酸被修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学或部分变化，所述修饰使变体保留未修饰序列的生物学特性。CDR氨基酸序列的部分改变可以是删除或替换一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或增加或***一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，以一个疏水氨基酸替换另一个疏水氨基酸。
保守替换是那些在其侧链和化学性质方面相关的氨基酸家族内发生的替换。这些氨基酸家族的实例有具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香族铡链的氨基酸、具有不带电极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸及具有大侧链的氨基酸等。
点突变尤其理解为多核苷酸改造，其导致不同于非改造氨基酸序列的氨基酸序列的表达，不同之处在于一个或多个单(非保守)或双联氨基酸替换或交换、删除或***成为不同的氨基酸。
优选的点突变指的是相同极性与/或电荷的氨基酸的交换。在此方面，氨基酸指的是六十四个三联体密码子编码的20种天然氨基酸。这20种氨基酸可以分成具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下面给出了“中性”氨基酸及其各自的三字母和单字母的代码和极性：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gin，Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；及
组氨酸：(His，H)极性，带正电荷(10％)，中性(90％)。
带“正”电荷的氨基酸有：
精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；及
赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。
带“负”电荷的氨基酸有：
天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；及
谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。
本文谈及抗体序列和同系物时描述的“氨基酸序列一致性的百分数(％)”定义，为了得到最大的序列一致性百分数，在比对序列和引入缺口(如果需要的话)后，候选序列中与特定多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数，任何保守替换并不视为序列一致性的一部分。熟悉本领域的技术人员能够确定衡量比对的合适参数，包括被比较的全长序列实现最大比对所需的任何算法。
抗体变体特别理解为包括同系物、类似物、片断、具有特定糖基化形式的修饰或变体，例如，通过糖工程产生，其是功能性的和可以作为功能等同物，例如，与特定靶结合和具有功能性质。本发明所描述的优选变体在抗原结合方面是功能活性的，优选具有中和金黄色葡萄球菌的效力与/或是保护抗体。
本发明的抗体可以具有或不具有Fc效应子功能。虽然作用模式主要是通过中和抗体调节，并没有Fc效应子功能，但是，Fc可以募集补体，通过形成免疫复合物，帮助从循环内消除靶抗原，如毒素。
特异性抗体可以缺少活性Fc部分，因此，由不含抗体Fc部分或不包含Fcgamma受体结合位点的抗体域组成，或包括缺乏Fc效应子功能的抗体域，例如，通过修饰，减少Fc效应子功能，特别是，消除或降低ADCC与/或CDC活性。可以通过改造替代抗体，掺入修饰，以增加Fc效应子功能，尤其是增强ADCC与/或CDC活性。
这种修饰可通过突变，例如，Fcgamma受体结合位点中的突变引起，或通过衍生物或试剂引起，以干扰抗体形式的ADCC与/或CDC活性，从而减少或增加Fc效应子功能。
Fc效应子功能显著降低通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性测定的Fc效应子功能低于未修饰(野生型)形式的10％，优选低于5％。
Fc效应子功能显著增加通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性测定的Fc效应子功能是未修饰(野生型)形式的至少10％，优选至少是20％、30％、40％或50％。
谈及抗体序列时使用的词语“糖基化改造”变体应指的是因糖基化改造而具有改进的免疫原特性、ADCC与/或CDC的糖基化变体。所有抗体在重链恒定区的保守位置处含有糖结构，每个同种型具有N-连接糖结构的不同排列，可变地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是每个CH2域中Asn297处具有保守的N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双头(bi-antennary)低聚糖埋藏在CH2域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，它们的存在对抗体介导效应子功能是必不可少的，例如，抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。通过使N297突变，例如，突变为A，或T299，脱除N-聚糖，通常得到ADCC下降的无糖基化抗体形式。
抗体糖基化的主要区别在于细胞系，甚至在不同培养条件下培养的给定细胞系也会出现小的区别。菌细胞中的表达通常提供无糖基化抗体。据报道，具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化平分型GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调控表达的CHO细胞，具有改善的ADCC活性(Umanaetal.,1999,NatureBiotech.17:176-180)。除宿主细胞选择之外，影响重组产生抗体期间糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。
词语“抗原结合位点”或“结合位点”指的是抗体参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(“H”)与/或轻链(“L”)N-端可变(“V”)区或其可变域的氨基酸残基形成的。重链和轻链V区内的三个高度发散伸展，称为“超可变区”，插在较保守的侧翼伸展(称为框架区)之间。抗原结合位点提供与结合的表位或抗原三维表面互补的表面，超可变区被称为“互补决定区”或“CDR”。CDR中掺入的结合位点在本发明中亦称为“CDR结合位点”。
本发明所用词语“抗原”可与词语“靶”或“靶抗原”互换，指的是抗体结合位点识别的整个靶分子或所述分子的片段。特别是，抗原的子结构，例如，多肽或糖结构，通常称为“表位”，例如，B-细胞表位或T-细胞表位，这些表位是免疫相关的，可由这样的结合位点识别。
本发明所用的词语“表位”应特别指的是完全构成抗体结合位点特异性结合伴侣或特异性结合伴侣一部分的分子结构。表位可以是由糖、肽结构、脂肪酸、有机物质、生化物质或无机物质组成或是它们的衍生物和它们的任何组合。如果表位包括在肽结构中，如肽、多肽或蛋白质中，它通常包括至少3个氨基酸，优选5至40个氨基酸，更优选大约10-20个氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或糖链一级序列的单片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由通过将多肽重叠形成三级结构而在一起的氨基酸或糖类组成，在线性序列中，氨基酸不必彼此相邻。特别是，关于多肽抗原，构象或非连续表位的特征在于存在两个或多个在一级序列中被分开的两个或多个离散氨基酸残基，但是，当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，所述离散氨基酸残基在分子表面上组装形成一致的结构。
此处词语“表位”应尤其指的是抗体识别的单一表位，或包括表位变体的表位混合物，每个表位被交叉反应性抗体识别。
特别是，靶向LukGH复合物的抗体识别的表位位于LukG和LukH结合形成的抗原区内，例如，位于与LukH和LukG两者都接触的蛋白质结构域上面，例如，边缘(rim)域或盖(cap)域，但仍然可以接近，从而，当LukG和LukH组分复合，在溶液中形成二聚体或低聚体时，并且暴露或可以接近而被抗体结合时，形成本发明抗体特异性识别的LukGH复合物表位。
特别是，在抗体与可溶LukGH复合物结合时，表位位于这种在其它情况下与易感细胞受体接触的蛋白质域上，并抑制可溶LUKGH复合物与其推定的细胞受体结合。因此，抗LukGH复合物的这种表位的抗体将与LukGH复合物结合，与受体结合进行竞争。
特别是，表位仅位于可溶LukGH复合物可接近，而当LukGH与易感细胞结合时不能接近的这种蛋白质结构域上。
词语“表达”应按下述方式理解。含表达产物(如本发明所述抗体)的期望的编码序列和控制序列(如可操作连接的启动子)的核酸分子可用于表达目的。利用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码蛋白质。为了引发转化，表达***可以包括在载体中；但是，相关DNA也可以整合到宿主染色体内。特别是，该词语指的是宿主细胞和相容的载体，在合适的条件下，例如，通过载体携带且引入到宿主细胞内的外源DNA，表达编码的蛋白质。
编码DNA是一种DNA序列，其编码特定多肽或蛋白质，如抗体的特定氨基酸序列。启动子DNA是引发、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自同一基因或不同基因，可以来自同一有机体或不同有机体。重组克隆载体将通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制***，一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)，及一种或多种表达盒。
此处使用的词语“载体”定义为合适的宿主有机体中克隆重组核苷酸序列转录，即重组基因转录及其mRNA翻译所需的DNA序列。
“表达盒”指的是对规定限制位点处***到载体内的表达产物进行编码的DNA编码序列或DNA片段。表达盒限制位点设计用于确保表达盒插在合适的阅读框内。通常，外源DNA在载体DNA的一个或多个限制位点处***，然后，随同可转移载体DNA一起由载体携带进入到宿主细胞内。具有***或增加DNA(如表达载体)的DNA片段或序列也可以称为“DNA构建体”。
表达载体包括表达盒和另外通常包括宿主细胞自主复制起始点或基因组整合位点、一个或多个可选择的标记(例如，氨基酸合成基因或抗生素抗性基因，所述抗生素如zeocin(博来霉素)、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制性酶切位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组分是可操作地连接在一起的。此处所用词语“载体”包括自主复制核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。载体的常见类型是“质粒”，质粒通常是双链DNA的自包含分子，容易接受其它(外源)DNA和容易被引入到合适的宿主细胞内。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，具有一个或多个适合***外源DNA的限制位点。特别是，词语“载体”或“质粒”指的是一种媒介体，DNA或RNA序列(例如，外源基因)通过该媒介体可以被引入到宿主细胞内，从而转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)。
此处使用的词语“宿主细胞”应指的是转化产生特定重组蛋白质如本发明所述的抗体的原代主体细胞，及其任何子代。应该理解的是，并非所有子代都与亲本细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，但是，只要子代保留了与原转化细胞相同的功能性，这些词语包括这些改变了的子代。词语“宿主细胞系”指的是用于表达重组基因以产生重组多肽如重组抗体的宿主细胞的细胞系。此处使用的词语“细胞系”指的是已经获得了长期增殖能力的特定细胞类型的已建立的克隆。这种宿主细胞或宿主细胞系可以在细胞培养物中维持与/或培养以产生重组多肽。
本发明使用的词语“LukGH复合物”应指的是二聚体或低聚体，包括LukG和LukH组分1:1的二聚体，或任何其它比例，优选包括至少1LukG组分和至少1LukH组分的复合物，或LukG或LukH每种组分或任一种组分或LukG和LukH两种组分至少是2，或至少是3，或至少是4。LukGH二聚体理解为包含1LukG分子和1LukH分子结合形成二聚体复合物的LukGH复合物。LukGH四聚体理解为包含2LukG分子和2LukH分子结合形成四聚体复合物的LukGH复合物。LukGH六聚体理解为包含3LukG分子和3LukH分子结合形成六聚体复合物的LukGH复合物。LukGH八聚体理解为包含4LukG分子和4LukH分子结合形成八聚体复合物的LukGH复合物。三聚体或五聚体LukGH复合物通常包括1:1以外的比例，例如1LukG分子和2LukH分子(或反之亦可)形成三聚体，或2LukG分子和3LukH分子(或反之亦可)形成五聚体。
对组合物，例如免疫原组合物，此处亦称为“免疫原”(包含此处所述的抗原或表位，或疫苗)的“免疫应答”是在宿主或主体中引发针对目标组合物或疫苗的细胞与/或抗体介导的免疫应答。通常，这种应答由主体产生的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、与/或细胞毒性T细胞组成，特异性导向包括在目标组合物或疫苗中的抗原。
“保护性免疫应答”理解为与未免疫群体相比，提供显著改善的诱导或自然感染或毒素挑战结果的免疫应答。针对毒素的保护性免疫应答主要通过高亲和力中和抗体(例如，Kd小于10-8M)介导。毒素中和的好处是保护靶细胞和防止炎症。通过从循环中清除毒素(通过RES细胞)，Fc介导的免疫复合物形成也有一些作用。
免疫原或免疫原组合物通常包括抗原或表位和载体，特别是可以包含佐剂。词语“佐剂”指的是一种化合物，当其与抗原一起施用时增强与/或重新定向针对抗原的免疫应答，但是，当其单独施用时，并不会产生针对抗原的免疫应答。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括淋巴细胞募集、刺激B细胞与/或T细胞及刺激巨噬细胞。示例性载体有脂质体或阳离子肽；示例性佐剂有磷酸铝或氢氧化铝、MF59或CpG寡核苷酸。
此处谈到核酸、抗体或其它化合物时使用的词语“分离的”或“分离”应指的是此种化合物已经与其自然相关的环境充分分离，从而以“基本上纯”的形式存在。“分离”并不一定指的是不包括与其它化合物或材料的人工或合成混合物，或存在不干扰基本活性的杂质，及例如由于不完全纯化，可能存在杂质。特别是，本发明的分离核酸分子还指包括那些化学合成的核酸分子。
谈及本发明的核酸时，有时采用词语“分离核酸”。该词语应用于DNA时，指的是与起始有机体天然基因组直接邻接序列分离的DNA分子。例如，“分离核酸”包括***到载体内的DNA分子，如质粒或病毒载体，或整合到原核或真核细胞或宿主有机体基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，词语“分离核酸”主要指的是由上文定义的分离DNA分子编码的RNA分子。或者，该词语指的是在其自然状态(即在细胞中或组织中)与其缔合的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离核酸”(DNA或RNA)进一步指的是采用生物或合成手段直接产生并与其产生期间存在的其它组分分离的分子。
谈到多肽或蛋白质，如本发明的抗体或表位时，词语“分离”特别指的是不含或基本不含其自然相关的材料，如在其自然环境中，或其制备环境(如细胞培养)中发现的其它化合物，制备是采用重组DNA技术在体外或体内进行。分离的化合物可以采用稀释剂或佐剂配制，但对于实际用途来说仍然是分离的–例如，用于诊断或疗法时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
特别是，本发明的分离LukGH复合物是从生理表面，如细胞表面分离，其中LukG和LukH将被固定，在易被这种LukGH双组分毒素细胞溶解的细胞表面上形成LukGH双组分成孔毒素。
此处所用词语“中和”或“中和作用”指的是广义，指的是任何分子，不考虑实现中和的机制，所述任何分子抑制病原体如金黄色葡萄球菌感染主体，或抑制病原体通过产生有效的蛋白质毒素促进感染，或抑制毒素损害主体的靶细胞。中和可以通过抑制金黄色葡萄球菌毒素与其靶细胞上的同源受体结合与/或相互作用的抗体而实现。在一些实施例中，此处描述的抗体可以中和毒素活性，其中毒素和靶细胞如红血细胞之间的体内和体外相互作用影响被降低或消除。通过抑制形成活性毒素，例如，在金黄色葡萄球菌双组分溶细胞素的情况下，通过抑制S-组分和F-组分的结合或细胞膜内低聚体孔的形成而进一步发生中和。
抗体抗溶细胞毒素的中和效力通常采用标准试验，通过测量对给定毒素敏感的细胞活性或功能性的增加而确定。中和可以以有抗体和没有抗体时活细胞的百分数表示。对高效价抗体来说，优选的表示中和效力的方式是抗体/毒素摩尔比，其中数值越低，效力越高。数值在1以下表明效力非常高。
本发明使用的词语“交叉中和”应指的是中和LukGH复合物的主要变体，包括USA300克隆的LukGH复合物和至少一种LukGH变体。
词语“金黄色葡萄球菌”或“S.aureus”或“病原性S.aureus”应按下述方式理解。金黄色葡萄球菌通常在人和动物的皮肤上或鼻子内发现。这种细菌通常是无害的，除非它们通过切口或其它伤口进入体内。一般说来，对健康的人来说，感染是微小的皮肤问题。过去，采用广谱抗生素(如甲氧西林)处理感染。然而，现在，已经出现了一些耐甲氧西林和其它β-内酰胺抗生素如青霉素和先锋霉素的菌株。它们被称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(亦称为耐多药金黄色葡萄球菌，或“MRSA”)。
金黄色葡萄球菌感染，包括MRSA，通常一开始是出现与丘疹、疖子或蜘蛛咬伤类似的红色小肿块。这些肿块或斑点会迅速转为需要手术引流的痛苦的深度脓肿。有时候细菌限于皮肤上。有时候，它们会深入到体内，在范围广泛的人组织，包括皮肤、软组织、骨、关节、手术伤口、血流、心瓣膜、肺或其它器官中引发可能威胁生命的感染。因此，金黄色葡萄球菌感染会导致与其有关的病症，这些病症可能是致命的疾病，如坏死性筋膜炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合症，及各种形式的肺炎(包括坏死性肺炎)，及疖病和痈病中的毒素产生。MRSA感染在医院或疗养院这些地方尤其麻烦，这些地方的病人存在裸露伤口、侵入器械及免疫***弱化的风险或发生这些风险的可能性很大，因此，比普通大众存在更大的感染风险。
中和金黄色葡萄球菌毒素的抗体干扰病原体和病理反应，从而能够限制或防止感染与/或减轻这种感染引起的疾病症状，或抑制金黄色葡萄球菌发病，特别是肺炎发病。在此方面，“保护性抗体”理解为负责在主动或被动免疫中对观察到的感染源免疫的抗体。特别是，此处描述的保护性抗体能够中和分泌的毒力因子(外毒素)的毒性效应(如细胞溶解、靶细胞诱导的促炎性细胞因子表达)及因此干扰金黄色葡萄球菌的致病潜力。
此处使用的词语“重组”应指的是“基因工程制备的或基因工程导致的”。重组宿主特别包括表达载体或克隆载体，或其已经通过基因工程改造而包含重组核酸序列，尤其是采用对宿主来说是外源的核苷酸序列。重组蛋白通过在宿主内表达各重组核酸产生。此处使用的词语“重组抗体”包括采用重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，如(a)从转基因或染色体转移得到人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)分离的抗体，或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化而表达抗体的宿主细胞分离的抗体，如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组体、组合人抗体文库分离的抗体，及(d)采用涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组抗体包括经改造而包括例如抗体成熟期间发生的重排和突变的抗体。
此处使用的词语“特异性”或“特异性结合”指的是分子异质群体中目标同源配体的决定性的结合反应。因此，在指定条件下(例如，免疫试验条件下)，抗体与其特定靶特异性结合，并不以显著量与样本中存在的其它分子结合。特异性结合指的是就靶识别而言，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果结合常数或结合动力学相差至少10倍，优选相差至少100倍，更优选相差至少1000倍，通常实现选择性结合。
若抗体对与多种抗原交叉反应的表位是特异性的，在这种情况下，特异性抗体能够与携带交叉反应性表位的各种抗原结合，词语“特异性”也适用这种情况。具有与交叉反应性表位结合的特异性的抗体的这种结合位点或抗体，亦分别称为多特异性或交叉特异性结合位点和抗体。例如，抗体可以具有多特异性结合位点，与和多个不同抗原交叉反应的表位特异性结合，这些不同抗原在表位内具有序列同源性与/或结构类似性，以提供结构基本上相同的构象表位，例如，与至少Hla和金黄色葡萄球菌的双组分毒素交叉反应。
抗体的免疫特异性、其结合能力和抗体展示的用于交叉反应性结合序列的伴随亲和力，由抗体与其发生免疫反应(结合)的交叉反应性结合序列决定。交叉反应性结合序列特异性可(至少部分)由免疫球蛋白重链可变区的氨基酸残基、抗体与/或轻链可变区氨基酸残基序列定义。
词语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指的是相当的单克隆抗体表现出相同的或基本相同的，即类似的免疫反应(结合)特点，竞争与预先选定的靶结合序列的结合。用于特定靶的抗体分子的相对特异性可以通过竞争试验相对确定，例如，Harlow,etal.,ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1988)所描述述的试验。
此处使用的词语“主体”应指的是温血哺乳动物，特别应指的是人类或非人动物。MRSA是至关重要的人病原体，其在兽医中也引起了人们的关注。它在范围广泛的非人动物物种中存在。因此，词语“主体”还特别指的是包括狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽的动物。特别是，本发明的医学用途或各种处理方法适用于需要预防或治疗与金黄色葡萄球菌感染有关的病症的主体。主体可以是存在金黄色葡萄球菌感染风险的患者或患有疾病包括早期或晚期疾病的患者。词语“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其它哺乳动物主体。因此，词语“处理”包括预防性和治疗性处理。
对主体进行处理，以预防或治疗金黄色葡萄球菌疾病状况。特别是，对处于感染风险或患有此类疾病或疾病复发的主体，或患有此类感染与/或与此类感染有关疾病的主体进行处理。
特别是，词语“预防”指的是包括防止发病的预防措施或降低发病风险的预防措施。
特别是，此处所描述处理、防止或延迟主体疾病状况的方法，是通过干扰作为所述状况的致病因子的金黄色葡萄球菌发病机理实现的，其中发病机理包括在主体细胞膜上形成孔的步骤，例如，通过特定毒力因子或毒素。
金黄色葡萄球菌的毒力是多种毒力因子组合的结果，包括使细菌粘附在真核细胞膜上的表面相关蛋白质、防止其调理吞噬作用的荚膜多糖，及几种外毒素。金黄色葡萄球菌主要通过产生分泌的毒力因子，如溶血素、肠毒素和中毒性休克综合征毒素引发疾病。这些分泌的毒力因子通过使宿主体内的许多免疫机制失活而抑制免疫响应，并导致组织破坏和帮助建立感染。后者由一组成孔毒素实现，其中最重要的是Hla，这是金黄色葡萄球菌肺炎的关键毒力因子。
金黄色葡萄球菌产生多种其它毒力因子和毒素，使这种细菌能够中和及经受不同种免疫细胞的攻击，特别是构成体内主要防御***的白细胞亚群的攻击。这些毒力因子和毒素的产生使金黄色葡萄球菌能够保持感染状态。在这些毒力因子中，金黄色葡萄球菌产生几种双组分白细胞毒素，其通过两种不相关蛋白质或亚基的协同作用，破坏宿主防御细胞和红细胞的膜。在这些双组分毒素中，γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)及Pantone-Valentine杀白细胞素(PVL)是其中表征最好的毒素。
杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两种组分的作用。第一种亚基被称为S类组分，第二个亚基被称为F类组分。S亚基和F亚基协同作用，以在白细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞(统称为吞噬细胞)上形成孔。已知金黄色葡萄球菌产生的双组分白细胞毒素集合(repertoire)包括F组分和S组分的同源和非同源对，例如，LukGH。
词语“基本上纯”或“纯化”应指的是包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物如核酸分子或抗体的制备物。纯度采用适合所述化合物的方法测定(例如，色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、HPLC分析等)。
化合物例如本发明的抗体或免疫原的“治疗有效量”与词语“有效量”或“足量”可以互换，它是施用于主体时足够产生有益或期望结果(包括临床结果)的量或活性，因此，有效量或其同义词取决于其应用的语境。
有效量指的是足以治疗、预防或抑制此类疾病或障碍的化合物的量。在疾病语境中，此处所描述抗体的治疗有效量特别用以治疗、调节、减弱、逆转或影响从抑制金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌发病机理中受益的疾病或状况。
与这种有效量对应的化合物的量将根据各种因素而变化，如给定药物或化合物、药物配方、给药途径、疾病或障碍类型、接受处理的主体或宿主的身份等，但是，这些都是熟悉本领域的技术人员可常规确定的。
本发明的抗体或免疫原可预防性用于抑制金黄色葡萄球菌感染发作，或治疗性地用于处理金黄色葡萄球菌感染，特别是难治的MRSA等金黄色葡萄球菌感染，或在特定主体情况下，已证明用其它传统抗生素疗法难治的金黄色葡萄球菌感染。
此处所描述抗体的治疗有效量，如提供给需要其的人患者的治疗有效量，可以特别是0.5-500mg，优选是1-400mg，甚至更优选是不超过300mg，不超过200mg，不超过100mg或不超过10mg，虽然，治疗急性疾病状况时，可能需要较高的剂量。
此外，采用治疗有效量的本发明抗体处理或预防主体的方案可由单次施用组成或包括一系列应用。例如，抗体可以至少每年施用一次，至少半年施用一次或至少一个月施用一次。但是，在另一个实施例中，对于给定处理，主体从大约每周一次至大约每天一次施用抗体。治疗期长短取决于各种因素，例如，疾病的严重程度、是急性还是慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还应该理解的是，在特定治疗或预防方案期间，用于治疗或预防的有效剂量可以增加或减少。剂量的变化是本领域熟知的标准诊断试验可以得到和显而易见的。在某些情况下，需要慢性给药。
此处所描述免疫原的有效量，如提供给存在患上与金黄色葡萄球菌感染有关疾病状况风险的患者，可特别是1-15mg/kg每剂量。
例如，根据初免-加强免疫方案，免疫原可能作为第一剂施用，然后在某一时间框架内施用一次或多次加强剂量，以诱导对金黄色葡萄球菌感染长期有效的免疫应答。优选的疫苗接种计划将包括施用三剂，例如，第0天施用第1剂，在第5-40天施用第2剂，在第10-100天施用第3剂，优选三剂分别在第0天、28天和90天施用。根据优选的加快计划，可在第0天、7天和14天进行施用。加快计划可用于预防，例如，针对面临择期手术的患者。通常明矾被作为佐剂使用，例如，作为磷酸盐或氢氧化物。
本发明的优选抗体与所述LukGH复合物抗原以高亲和力特异性结合，特别是具有高结合速率与/或低解离速率，或高结合亲合力。抗体的结合亲和力通常以一半的抗原结合位点被占据时的抗体的浓度表征，被称为解离常数(Kd或KD)。通常，Kd<10-8M，优选Kd<10-9M，甚至更优选Kd<10-10M的结合物被视为高和力的结合物。
然而，在特别优选的实施例中，抗原的结合亲和力是中等亲和力，例如，当与至少两个抗原结合时，Kd小于10-6M和不超过10-8M。
本发明可以提供中等亲和力结合物，优选连同亲和力成熟过程，如果必要的话。
亲和力成熟是抗体对靶抗原的亲和力增加的过程。根据本发明此处公开的各种实施例，为了产生亲和力成熟的抗体，可以采用本领域可以利用的任何一种或多种制备方法与/或利用亲和力成熟文库。示例性的亲和力成熟的方法和用途，如随机突变、细菌突变株传代、定点突变、突变热点靶向、限定性突变、抗体重排、轻链重排、重链重排、CDR1与/或CDR1突变，及产生和利用可用于实施本发明公开的各种实施例的方法和用途的亲和力成熟文库的方法，包括，例如，在Prassleretal.(2009)；Immunotherapy,Vol.1(4),pp.571-583；Sheedyetal.(2007),Biotechnol.Adv.,Vol.25(4),pp.333-352；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679中公开的那些方法。
随着抗体结构的变化，包括氨基酸突变或作为免疫球蛋白基因片段体细胞突变的结果，产生和选择出较大亲和力的抗原结合位点变体。亲和力成熟的抗体的亲和力比亲本抗体大几个log。单一亲本抗体可以经历亲和力成熟。或者，与靶抗原具有类似结合亲和力的抗体库可以视为亲本结构，这些亲本结构经过变化得到亲和力成熟的单一抗体或亲和力成熟的这种抗体的库。
本发明优选的亲和力成熟的抗体变体，其结合亲和力至少增加10倍，优选至少增加100倍。在采用各亲本分子文库的筛选活动过程中，可以采用具有中等亲和力的抗体的亲和力成熟，得到本发明具有结合亲和力Kd<10-8M的特异性靶结合性质的抗体。或者，可以通过本发明的抗体亲和力成熟，甚至更大地提高亲和力，得到高亲和力的抗体，对应的Kd小于10-9M，优选小于10-10M，或甚至小于10-11M，最优选处于皮摩尔范围。
吞噬效应细胞可以通过采用补体活化的另一种途径活化。与微生物表面抗原结合的抗体利用其Fc区吸引补体级联第一成分，启动“经典”补体***的活化。这导致刺激吞噬效应细胞，通过补体依赖的细胞毒性(CDC)，吞噬效应细胞最终杀灭靶标。
根据一个具体实施例，采用标准ADCC或CDC试验确定，本发明的抗体在免疫效应细胞存在下具有细胞毒活性。如果与对照相比，细菌溶解百分数明显增加的话，表明本发明抗体具有ADCC或CDC试验确定的细胞毒活性。与ADCC或CDC相关的细胞毒活性优选测定为绝对百分数增加，优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。
本发明的LukGH复合物可用于从抗体文库，例如，酵母展示抗体文库筛选抗体。
鉴定具有期望中和性质的抗体的筛选方法可以是抑制与靶细胞结合的毒素，抑制二聚体或低聚体的形成。抑制孔的形成，抑制细胞溶解，抑制细胞因子、淋巴因子及任何促炎信号诱导，与/或抑制对动物的体内影响(死亡、溶血现象、过度发炎、器官功能障碍)。反应性可以，例如，采用标准试验，根据与期望毒素的直接结合进行评价，或者，根据与LukGH复合物的结合跟与单独LukG或LukH(单体)抗原结合相比的差别进行评价。
一旦鉴定出具有期望性质的抗-LukGH抗体，可以确定抗体识别的优势表位。表位定位的方法是本领域所熟悉并公开在，例如，EpitopeMapping:APracticalApproach,WestwoodandHay,eds.,OxfordUniversityPress,2001中。
表位定位涉及抗体结合表位的鉴定。对于熟悉本领域的技术人员来说，有许多种测定蛋白质上表位位置的方法，包括抗体-抗原复合物的结晶学分析、竞争试验、基因片段表达试验和基于合成肽的试验。谈到参照抗体时所称“结合相同表位”的抗体此处应按下述方式理解。当两个抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体被称为结合相同或基本上相同或大体上相同的表位。确定两个抗体是否与相同或空间上重叠的表位结合的常用方法是竞争试验，该试验采用标记抗原或标记抗体，可以所有数量的不同形式配置。通常，抗原固定在96孔板上，采用放射性或酶标记测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
一旦鉴定出具有期望中和性质的抗体，就可以采用本领域熟悉的方法包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术产生这种抗体，包括抗体片段。
在杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，经免疫诱发淋巴细胞，其产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，采用合适的融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
对杂交瘤细胞在其中生长的培养基进行试验，测定产针对抗原的单克隆抗体的产生。优选杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外结合试验如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)进行确定。
重组单克隆抗体可以，例如，如下产生：通过分离编码要求抗体链的DNA并转染具有用于表达的编码序列的重组宿主细胞，可以采用熟悉的重组表达载体，例如，本发明的质粒或包括编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，如前文所述的那些细胞。
根据具体的方面，核苷酸序列可用于基因操作，以对抗体进行人源化或改善亲和力，或抗体的其它特点。例如，恒定区可以经改造，使其与人恒定区更类似，从而如果抗体在临床试验中使用和治疗人类时，可以避免免疫应答。基因操作抗体序列，以使其与靶向毒素的亲和力更大及抗金黄色葡萄球菌的效力更大，是符合期望的。显然，对于熟悉本领域的技术人员来说，可以对抗体作出一种或多种多核苷酸改变，却仍然保持其对靶向毒素的结合能力。
采用各种方法产生抗体分子，通常是人们熟悉的。例如，美国专利6331415(Cabillyetal)描述了一种重组产生抗体的方法，其中重链和轻链从单一载体或从单一细胞中两个独立的载体同时表达。Wibbenmeyeretal.,(1999,BiochimBiophysActa1430(2):191-202)和LeeandKwak(2003,J.Biotechnology101:189-198)描述了采用大肠杆菌独立培养物中表达的质粒，从独立产生的重链和轻链制备单克隆抗体。与抗体产生有关的其它各种技术在，例如，Harlow,etal.,ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,(1988)中进行了描述。
另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述分离核酸包括编码产生本发明重组抗体的序列。
另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述核酸包括编码产生本发明重组表位或包括本发明这种表位的分子的序列。但是，本发明的表位也可以合成产生，例如，采用本领域熟悉的任何合成方法产生。
编码核酸的抗体或表位可以具有任何合适的特点和包括任何合适的特点或其组合。因此，例如，编码核酸的抗体或表位可以是DNA、RNA或它们的杂合物的形式，并可以包括非天然碱、修饰骨架，例如，促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或它们两者。核酸有利地可掺入到本发明的表达盒、载体或质粒内，包括促进靶宿主细胞中期望的表达、复制与/或选择的特点。这些特点的实例包括复制起始点组分、选择基因组分、启动子组分、增强子元件组分、聚腺苷酸化序列组分、终止组分等众多已知的合适的实例。
本发明进一步提供包含本发明所描述一种或多种核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体与载体一起使用，所述载体例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，编码任何公开抗体的DNA分子***载体内。
利用培养基中的连续细胞系，采用产生抗体分子的任何方法产生单克隆抗体。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohleretal.(1975,Nature256:495-497)描述的杂交瘤方法和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；和Brodeuretal.,1987,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,(MarcelDekker,Inc.,NewYork),pp51-63)。
此外，本发明提供药物组合物，其包括本发明所描述的抗体或免疫原及药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可以按照本发明以推注或输注或持续输注的方式施用。适合辅助这种施用手段的药物载体是本领域熟悉的。
药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体或相关组合物或组合生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的任何组合。
一方面，抗体可与适合要求给药途径的一种或多种载体组合，抗体可以，例如，与任何的乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、***树胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和任选进一步片剂化或胶囊化用于传统给药。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧基甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、麻油、黄蓍胶与/或各种缓冲溶液。其它载体、佐剂和给药方式是药学领域熟悉的。载体可以包括控释材料或时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯单独使用或与蜡一起使用，或本领域熟悉的其它材料。
其它药学上可接受的载体是本领域熟悉的，例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES中进行了描述。液体配方可以是溶液、乳液或悬浮液，并可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
本发明还提供药物组合物，其中配制本发明的抗体或免疫原及一种或多种治疗活性剂。将具有要求纯度的所述免疫球蛋白与任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，配制本发明抗体或免疫原的稳定制剂，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。体内施用使用的配方特别是无菌的，优选是无菌水溶液形式。通过无菌过滤膜过滤或其它方法，很容易实现这一点。本发明公开的抗体和其它治疗活性剂还可以配制为免疫脂质体，与/或装在微胶囊中。
包含本发明抗体或免疫原的药物组合物的施用可以采用各种方式进行，包括经口、皮下、静脉内、鼻内、囊内(intraotically)、经皮、粘膜、局部施用，例如，凝胶、软膏、洗液、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内施用，例如，采用可吸入技术或肺部递送***、***、肠胃外、直肠或眼内施用。
肠胃外施用的示例性配方包括那些适合皮下、肌肉内或静脉注射的配方，例如，无菌溶液、乳液或悬浮液。
在一个实施例中，本发明的抗体或免疫原是给主体施用的唯一的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防单药疗法。
或者，本发明的抗体或免疫原与一种或多种其它治疗剂或预防剂一起施用，包括但不限于标准处理，例如，抗生素、炎症的类固醇和非类固醇抑制剂，与/或基于其它抗体的疗法，如采用抗菌剂或消炎剂。
一种组合疗法特别采用标准方案，例如，用于处理MRSA感染的方案。这种方案可包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、利奈唑胺、甲氧西林与/或万古霉素。
在组合疗法中，抗体作为混合物施用，或伴随一种或多种其它治疗方案，例如，在伴随疗法之前、同时或之后使用。
在某些情况下，免疫原的预防性施用可以采用包括本发明免疫原的疫苗，即单价疫苗。但是，可以采用包括不同免疫原的多价疫苗，以诱导针对相同或不同靶向病原体的免疫应答。
本发明抗体、免疫原或各药物制剂的生物学特性可以离体在细胞、组织和整个有机体实验中进行表征。正如本领域熟悉的那样，药物通常在动物体内测试，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子，以测量药物对处理疾病或疾病模型的效力，或测量药物的药代动力学、药效动力学、毒性和其它特性。动物可能称为疾病模型。治疗通常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入或敲除)。这种实验可以提供确定抗体作为治疗或预防潜力的有意义的数据，包括合适的半衰期、效应子功能、(交叉-)中和活性与/或主动或被动免疫疗法时的免疫应答。任何有机体，优选哺乳动物，可用于测试。例如，由于与人的遗传相似性，灵长类动物、猴子适合治疗模型，从而可用于测试主题试剂或组合物的效力、毒性、药代动力学、药效动力学、半衰期或其它特性。药物要获得批准，最终需要在人体内进行测试，因此，当然需要设计这些实验。因此，本发明的抗体、免疫原和各药物组合物可以在人体内测试，以确定其治疗效果或预防效果、毒性、免疫原性、药代动力学与/或其它临床特性。
本发明还提供本发明的主题抗体用于诊断目的，例如，在检测和定量确定生物流体样本中毒素或作为免疫试剂的抗体或靶的浓度的方法中使用。
本发明还提供检测生物标本(如体液)中毒素水平或金黄色葡萄球菌感染程度的方法，包括将标本与本发明的抗体接触的步骤。本发明的抗体可以在任何熟悉的试验方法中使用，如竞争结合试验、直接和间接夹心试验、免疫沉淀试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。
本发明使用的体液包括主体的生物样本，如组织提取物、尿、血、血清、大便和痰。
在一个实施例中，所述方法包括在允许抗体附着到固体支持物表面的条件下，采用与靶(如本发明抗体靶向的毒素中的至少一种毒素)特异性形成复合物的过量的某种类型的抗体片段接触固体支持物。得到抗体附在其上的固体支持物，然后，用生物流体样本接触固体支持物，从而生物流体中的靶与抗体结合，形成靶-抗体复合物。所述复合物可以采用可以检测的标记进行标记。或者，靶或抗体可以在形成复合物之前进行标记。例如，可以检测的标记(标签)可以与抗体缀合。然后，所述复合物可以检测和定量测定，从而检测和定量测定生物流体样本中靶的浓度。
针对具体应用，本发明的抗体与标记或报告分子结合，标记或报告分子选自有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物。与标记或报告分子缀合的抗体可用于，例如，试验***中或诊断方法中，例如，用于诊断金黄色葡萄球菌感染或与其有关的疾病。
本发明的抗体可以与其它分子缀合，可以在，例如，结合试验(如ELISA)和结合研究中简单检测出所述缀合。
本发明的另一个方面提供一种包括抗体的试剂盒，所述试剂盒除包括一种或多种抗体之外，还可以包括各种诊断剂或治疗剂。试剂盒还可以包括诊断方法或治疗方法的说明书。这样的说明书可以，例如，提供在试剂盒包含的器械上，例如，工具或器械，以制备用于诊断目的的生物样本，如在测定各毒素来诊断疾病之前分离含细胞与/或蛋白质的部分。所述试剂盒优选包括抗体和诊断剂或可在本发明所描述的一种或多种诊断方法中使用的试剂。在另一个优选的实施例中，试剂盒包括抗体，例如，冻干形式的抗体，以及药学上可接受的载体，可在使用之前将它们混合，以形成短期可施用的注射组合物。
实例
实例1：重组毒素的产生
在大肠杆菌(BL21、Rosetta或TunerDE3)内重组产生了六种金黄色葡萄球菌毒素——LukH_TCH1516、LukH_MRSA252、LukH_MSHR1132、LukG_TCH1516、LukG_MRSA252和LukG_MSHR1132。成熟蛋白质的毒素基因(采用SignalP4.1Server确定)根据公开的金黄色葡萄球菌菌株USA300_TCH1516、MRSA252和MSHR1132的基因组序列，经密码子优化用于大肠杆菌表达，并通过基因合成产生(图1A，SeqID1–12，图10)。所有毒素均以无标记的不溶形式表达，蛋白质从包涵体重折叠并纯化；纯化由用于LukH的尺寸排阻柱上的两个步骤，及用于LukG的阳离子交换的一个步骤和阴离子交换的一个步骤组成。如实例3所描述，在体外试验中分析蛋白质的纯度(采用SDS-PAGE)和单体状态(采用尺寸排阻法)，以及功能性(图1B)。所有蛋白质均采用氨基反应性试剂Sulfo-NHS-LC生物素进行标记。
实例2：筛选LukG和LukH结合人单克隆抗体
通过按照WO2009/036379A2、WO2012009568和WO2010105256建立的酵母表面展示文库筛选出毒素结合抗体。毒素分子表达为重组大肠杆菌产生的蛋白质，并用生物素标记，如实例1所描述。
在不同浓度下，采用生物标记毒素，与经改造表达全长人IgG1抗体、多样性大约109-10的酵母细胞文库一起温育。通过磁珠分选法和荧光激活细胞分选法(FACS)，采用链霉亲和素二级试剂，在连续几次(高达5次)筛选回合中，分离出表达具有与毒素结合能力的抗体的酵母细胞。然后，通过筛选出的酵母克隆产生抗体，并通过蛋白A亲和层析法纯化。采用ForteBioOctetRed仪器[PallLifeSciences]，通过干涉测量，证实了单个可溶mAb与不同毒素的结合；生物素化抗原或抗体被固定在传感器上，并分别测量了溶液中抗体Fab片段或抗原的结合和解离(通常是200nM)。亲和力(Kd值)根据测量的动力学参数(kon和koff)计算。
实例3：人mAb的LukGH中和活性分析
在人嗜中性粒细胞的活力试验中，评价了针对LukGH毒素的人mAb——如实例2所描述，采用LukH_TCH1516和LukG_TCH1516筛选出——的中和活性。为此，从红十字会(肝素化)获得或通过静脉穿刺从正常健康志愿者身上获取的放在K-EDTA真空采血管(BD，美国)的新鲜人全血中，分离出嗜中性粒细胞。为了聚集红细胞，向5份血中加入1份HetaSep溶液(法国StemCellTechnologies公司)，混合，在37℃培养，直到血浆/红细胞中间相占总体积的大约50％。将富白细胞的血浆层小心铺在2步Percoll梯度上(73％和63％PercollPlus，稀释在HBSS中，GEHealthcare)，并在680xg，RT离心分离30分钟，关闭刹车。通过抽吸法，取出转后梯度的第一层和第二层(主要是血清和单核细胞)。从第二不透明层中收获嗜中性粒细胞，并在50mlHBSS(美国Gibco公司)+10mM葡萄糖中洗涤两次。采用血球计，利用台盼蓝染料排除法，对存活细胞数进行计数。采用描述的分离方法，50ml全血通常得到1-5x10E8嗜中性粒细胞，活力>95％。为了进行活力试验，将细胞重悬于补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和Pen/Strep(＝嗜中性粒细胞介质)的RPMI1640(奥地利PAALaboratories)中。或者，也可以采用HL-60(ATCCCCL-240TM)人早幼粒细胞性白血病细胞系作为嗜中性粒细胞类细胞的来源(Gallagher,Blood,1979:713；Collins,PNAS,1978:2458)。将细胞在嗜中性粒细胞介质中培养，并采用DMF(N,N-二甲基甲酰胺，100mM)分化5天，如Romero-Steiner,ClinDiagnLabImmunol,1997:415所描述。根据文献(如Collado-Escobar,BiochemJ,1994:553；Trayner,LeukRes,1998:537；Watanabe,JLeukBiol,1993:40)中描述的标准方法，采用BrilliantViolet421缀合的抗-CD11b(克隆ICRF44，BioLegend，USA)和PE缀合的抗-CD71单克隆抗体(克隆OKT9,eBioscience,USA)，通过CD71颜色消失和CD11b出现颜色确定分化。
将单克隆抗体在嗜中性粒细胞介质中作系列稀释，并按固定浓度与毒素混合，所述固定浓度降低细胞活力>95％[～1nM,60ng/ml]。活力试验在预培养步骤30分钟后开始，让抗体与毒素结合。每孔加入25000个细胞，在37℃，5％CO2加湿环境中反应培养4小时。采用商业细胞活力试验试剂盒，根据细胞ATP-水平的发光测量(发光法细胞活力试验；Promega，USA)，按照生产商的说明，对PMN的活力进行评价。相对模拟处理对照，计算％活力。利用下述公式，计算毒素活性的％抑制。％抑制＝[(仅毒素时的活力–抑制活性)/(仅毒素时的活力)]x100。所有试验中都包括对照mAb(针对不相关抗原产生的：鸡卵溶菌酶)。
采用这种方法，我们无法鉴定LukG或LukH毒素组分产生的那些抗体中的有效中和抗体(实例如图2所示)。在试图寻找解释的过程中，我们假设筛选出的抗体在其它组分存在时不能与同源毒素组分结合。在一系列采用forteBio测量的结合研究中，我们确定了，在LukH存在下，LukGmAb与LukG的结合受到了抑制，反之亦然，在LukG存在下，LukHmAb与LukH的结合受到了抑制。为了证实这一怀疑，我们制备了针对在LukH和LukG之间接触的蛋白质域的，在有所改动的情况下，开展中和试验。在加入其它毒素组分之前，mAb采用同源毒素组分单独预培养。实际上可以看到，大多数LukG和LukHmAb的毒素中和有很大的改进(图3所示实例)。但是，这些抗体无法中和金黄色葡萄球菌产生的、细菌培养上清液中存在的天然毒素。所有这些实验表明，在与靶细胞结合之前，LukG和LukH在溶液中形成复合物，金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素未见有这种报道。
实例4：当共表达并在溶液中形成二聚时从大肠杆菌裂解液中共纯化重组LukG和 LukH
我们采用两种含不同抗生素抗性标记的质粒，每个质粒携带lukH或lukG基因，共转染到相同的大肠杆菌细胞中，共表达了。LukG表达为融合蛋白，NusA/His6在N-端，使复合物可以进行金属亲和纯化，而LukH以未标记形式表达。表达的诱导采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在20℃进行20小时实现。在可溶部分中发现两种蛋白质，这两种蛋白通过固定化金属离子亲和色谱(IMAC)共纯化。NusA/His6标记通过(肠激酶)蛋白质水解脱除，得到无标记的成熟的LukGH复合物，该复合物通过阳离子交换色谱进一步纯化。
共表达稳定了各个蛋白质。虽然单个组分总是表达在大肠杆菌的不溶部分中(参见实例1)，但是，在可溶部分中发现了共表达的LukGH。
SDS-PAGE表明，复合物中LukG:LukH的化学计量是1:1。为了确定溶液中复合物的大小，我们采用配备静态光散射检测器的DynoProNanoStar(Wyatt)仪器开展动态光散射(DLS)测量(图5)。静态光散射检测器(MW-S)测定的分子量与异源二聚体的计算分子量73kDa十分一致。
实例5：采用重组LukGH复合物筛选高效LukGH中和mAb
按照实例2所描述的相同方式，采用生物素化LukGH复合物为抗原，通过酵母表面展示，开展抗体筛选。筛选出了84个具有独特CDR序列的人mAb。按照实例3所描述，利用分化的HL-60细胞或新鲜分离的人PMN，测量中和活性，抗体预培养采用高效LukGH复合物或在补充有1％酪蛋白氨基酸的RPMI-1640培养基中培养的金黄色葡萄球菌细胞产生的天然LukGH(培养上清液)完成。与采用LukG或LukHmAb得到的结果相反，采用LukGH复合物筛选出的抗体被证明是有效的，它们中的3/4的半数最高抑制浓度(IC50)小于300nM。最有效mAb的IC50<30nM(大约是10mAb:毒素比)。实例如图6所示，图中示出了采用分化HL-60细胞时重组LukGH复合物(图6A)或天然LukGH(图6B)的情况。当采用新鲜分离的人PMN作为靶细胞时，发现了同样的效力等级次序(图7A)。
由于LukGH以不同的变体存在，一个重要的方面是筛选能够中和不同金黄色葡萄球菌菌株表达的所有LukGH变体的mAb。为此，在毒素中和试验中，还测试了MRSA252菌株表达的差异最大的序列变体LukGH–属于CC30(克隆复合物)和ST36(序列类型)。该试验具有非常大的区别能力，因某些mAb被证明高效，而其它并未显示出功能性(图7B)。当抗体被固定在抗人捕捉传感器上，并对溶液(100nM，溶于PBS+3％BSA)中毒素的结合进行监测时，根据ForteBio测量的响应值，效力被证明与和LukGH复合物变体的结合相关。mAb与LukGH复合物变体的结合显著优于与LukG或LukH变体的结合(图7C)。
为了揭露LukGH中和抗体的作用模式，在没有或存在LukGHmAb的情况下，采用荧光链霉亲和素(与生物素结合)，在基于流式细胞术的表面染色试验中，对生物素化LukGH复合物的结合进行监测。抗体的存在与缺乏荧光表面信号相关，表明在mAb与毒素结合时，与推定受体的结合受到抑制(图8)。
总之，溶液中LukG和LukH形成复合物的发现导致防止人吞噬细胞溶解的有效毒素中和抗体的鉴定。抗体的亚群具有广泛的结合特异性，交叉中和差别很大的LukGH序列。中和LukGHmAb抑制了毒素和吞噬细胞的结合，从而防止溶解。mAb的这些特点使它们适合广泛的临床应用。
实例6：CD11b/CD18复合物作为LukGH人受体的鉴定
我们采用基于流式细胞术的表面染色法确定了，LukGH复合物与人PMN和分化的HL-60细胞结合，但不与未分化HL-60细胞结合。这与毒素灵敏度有关，因为后者的细胞类型完全耐受LukGH(未检测到任何细胞溶解)。这些数据表明，LukGH受体被PMN和分化HL-60细胞表达。为了鉴定这种受体，利用生物素标记的LukGH(2μg)和108个细胞，开展拉下实验。将生物素化LukGH和其结合伴侣收集在链霉亲和素琼脂糖树脂(结合生物素)上，并采用SDS-PAGE分析。PMN和分化HL-60拉下样本中出现分子量150-和90-kDa的两种独特的蛋白质条带，而未分化HL-60部分和未加LukGH纯化的PMN样本中均没有这些条带(图9A)。将这些条带从凝胶中切去，并开展质谱分析(肽质量指纹图谱)。将凝胶带消化(胰蛋白酶)，得到的肽采用纳米-LC-MS/MS测定，并对Mascot(http://www.matrixscience.com)数据库，查询MS/MS谱图。根据胰蛋白酶肽的质量，两种蛋白质被鉴定为CD11b(150-kDa)和CD18(90-kDa)(图9B)。已知CD11b和CD18在PMN和分化HL-60细胞表面上形成复合物，亦称为补体受体3(CR3)，或白细胞整合素Mac-1(FEMSImmunol.Med.Microbiol.2002,34,255)。在抗-CD11b特异性mAb(Abeamab52478)的蛋白质印迹法中，证实了在PMN和分化HL-60拉下材料中存在CD11b(图9C)。这是一个耐人寻味的发现，完全解释了LukGH的细胞类型特异性，据报道，对表达CD11b/CD18的人PMN、单核细胞和树突状细胞都有毒。普遍还认为，未分化HL-60细胞缺乏这种复合物的表面表达。实际上，阳性CD11b/CD18染色经常用作体外HL-60细胞高效分化的标记。肽质量分析也以较低分值鉴定了从PMN分离的150kDa条带中的CD11d(图9B)。CD11d还与CD18形成复合物，得到整合素αDβ2，整合素αDβ2在炎性巨噬细胞上显示上调并调节巨噬细胞的粘附性及其迁移(Exp.Celt.Res.2008,314,2569)。αDβ2在氨基酸水平上58％与CR3相同，是LukGH的一种可能的替代受体。
这些数据还解释了对小鼠和兔子细胞的毒素活性的缺乏或非常低的毒素活性(文献Maiachowaetal,2012报道，并被我们证实)，因为啮齿动物CD11b/CD18与它们的人对应物仅有～75％的氨基酸一致性。同样，人CD11d与小鼠变体仅～70％相同。
实例7：LukGH八聚体的晶体结构鉴定了对二聚体形成很重要的残基
对2.8分辨率的LukGHUSA300的结构进行了解析，结果显示为八聚体孔式结构，在不对称单元中有两个八聚体，每个八聚体由四个交替的LukG和LukH亚单元组成(图10A)，与采用HIgAB(PNAS108,17314,2011)获得的类似。毒素原体涉及八聚体中两种类型的界面：链A和B之间的界面(界面1)及链B和C之间的界面(界面2)。界面1和界面2埋藏的表面积分别是2188和2461 2。在界面1，盖域(capdomain)之间发生主要的相互作用(图10B)，而在界面2，在盖域之间和两个单体的边缘域()之间都存在相互作用(图10C)。LukGH八聚体两个界面之间的接触残基的分析表明，界面1被34个氢键和一系列涉及来自LukH的残基Asp39、Asp75和Asp197及来自LukG的残基Lys56、Lys58、Arg23和Lys218的静电相互作用稳定。在界面2，一共有56个氢键，以及涉及盖域之间来自LukH的残基Arg49和Arg240及来自LukG的残基Asp49和Glu171及边缘域之间来自LukH的残基Arg215和Arg234和来自LukG的残基Asp189和Asp191的静电相互作用。当与HlgAB八聚体(pdb代码3B07)观察到的盐桥相比时，在盖域之间发现的那些盐桥在LukGH和HIgAB八聚体之间(也在其它S和F组分之间)大多数是保守的，而在边缘域之间(在界面2)，盐桥仅在LukGH中发现，涉及的残基在LukGH变体之间是完全保守的(图1C)。根据两个界面中埋藏的表面积的大小，及在其它F组分和S组分时，在界面2中缺少盐桥残基保守，LukGH二聚体最可能的界面是界面2(图10C)。为了证实这种假设，如下文所述，我们将涉及静电相互作用的残基改为Ala，产生了界面突变体。LukH中的Asp75和Asp197突变为Ala，得到LukH1(界面1LukH突变体)，LukG中的Arg23和Lys218突变为Ala，得到LukG1(界面1LukG突变体)。为了制备第2界面突变体LukH2和LukG2，将LukH中的Arg215、Arg234和Arg240及LukG中的Asp189、Asp191和Glu171分别突变为Ala。
LukGH变体被共转化，在20℃诱导复合物的共表达，如对WT复合物的一样。所有复合物都在类似水平共表达，但是，不同变体之间可溶复合物的含量有变化；界面1的突变体：LukG1H、LukGH1和LukG1H1具有与WT复合物类似的溶解性，而界面2突变体：LukG2H、LukGH2和LukG2H2大部分不溶。因此，界面1突变体复合物采用与WTLukGH类似的程序纯化，得到类似的收率。采用圆二色谱(CD)检查纯化LukGH变体的折叠，它们的CD谱图基本上与WT复合物的相同，表明这些突变对复合物的二级结构没有任何影响。
单个组分：如WTLukG和LukH一样，对LukG1、LukG2及LukH1和LukH2进行了表达和包涵体纯化。LukG1、LukG2和LukH2的收率与WT对应部分类似：LukH2的CD谱图与WTLukH吻合良好，LukG的变体同样如此，虽然在蛋白质配制和获得谱图的pH10.0缓冲液中，所有LukG蛋白质都主要表现出无规卷曲结构。LukH1的收率显著低于WT蛋白质，这一点得到了LukH1是部分折叠的这一事实的支持，因此，在进一步的实验中未将其包括进去。
将生物素化LukH或LukH2固定在链霉亲和素传感器上，测定LukG与预载传感器结合的响应值，在Forte-Bio中对从单个组分形成LukGH复合物的情况进行监测。与LukH的结合显著高于与LukH2的结合(图11A)，这与LukH2中的突变影响二聚体界面相符。LukG和LukH变体的混合物与戊二醛的交联(图11B)证实，界面2突变体不能形成LukGH二聚体，但是界面1LukG突变体能够形成二聚体，其水平与WT组分中观察到的类似。
参考文献
MalachowaN，KobayashiSD，BraughtonKR，WhitneyAR，ParnellMJ，GardnerDJ，DeleoFR.StaphylococcusaureusIeukotoxinGHpromotesinflammation.JInfectDis.2012Oct；206(8)：1185-93.Epub2012Aug7.
VenturaCL，MalachowaN，HammerCH，NardoneGA，RobinsonMA，KobayashiSD，DeLeoFR.IdentificationofanovelStaphylococcusaureustwo-componentIeukotoxinusingcellsurfaceproteomics.PLoSOne.2010Jul16；5(7)：e11634.
DumontAL，YoongP，SurewaardBG，BensonMA，NijlandR，vanStrijpJA，TorresVJStaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABToMediateEscapefromwithinHumanNeutrophils.InfectImmun.2013May；81(5)：1830-41.doi：10.1128/IAI.00095-13.Epub2013Mar18.
DumontAL，NygaardTK，WatkinsRL，SmithA，KozhayaL，KreiswirthBN，ShopsinB，UnutmazD，VoyichJM，TorresVJ.CharacterizationofanewcytotoxinthatcontributestoStaphylococcusaureuspathogenesis.MolMicrobiol.2011Feb；79(3)：814-25.Epub2010Dec13.
Agramonte-HeviaA.，FEMSImmunol.Med.Microbiol.2002，34，255
Yakubenko，V.P.，Exp.Cell.Res.2008，314，2569

Claims (15)

1.一种分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素抗原，其包含LukGH复合物。
2.根据权利要求1所述的抗原，其中LukGH复合物包括LukG和LukH组分的二聚体或低聚体。
3.根据权利要求1或2所述的抗原，其中LukGH复合物由源自金黄色葡萄球菌菌株的重组蛋白与/或蛋白组成。
4.根据权利要求3所述的抗原，其中LukG和LukH组分由天然来源纯化的重组宿主细胞共表达与/或共重折叠。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗原，其中抗原是以可溶形式的蛋白复合物的形式提供。
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗原，其中所述抗原能够与人CD11b/CD18受体结合。
7.一种抗体，其与LukGH复合物特异性结合。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中抗体中和LukGH复合物。
9.根据权利要求7或8所述的抗体，其中抗体与源自USA300克隆，优选源自TCH1516菌株的LukGH复合物及至少一种LukGH复合物的变体结合。
10.根据权利要求7至9任一项所述的抗体，其中与源自USA300克隆的LukGH复合物相比，LukGH复合物变体在LukG或LukH任一组分的氨基酸序列中有至少一个点突变。
11.根据权利要求7至10任一项所述的抗体，其中LukGH复合物变体包括含有选自SEQID8、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的LukG组分与/或含选自SEQID6、10、21、22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的LukH组分。
12.根据权利要求7至11任一项所述的抗体，其中源自USA300克隆的LukGH复合物包括含SEQID4氨基酸序列的LukG组分与/或含SEQID2氨基酸序列的LukH组分。
13.根据权利要求7至12任一项所述的抗体，其中抗体交叉中和LukGH复合物和LukGH复合物变体。
14.人CD11b/CD18复合物，其用于确定金黄色葡萄球菌LukGH双组分溶细胞素结合或毒性的方法中。
15.根据权利要求14使用的CD11b/CD18复合物，其中CD11b/CD18复合物是以其天然形式或分离形式或固定化形式使用。
CN201480038825.0A 2013-05-21 2014-05-16 产生中和金黄色葡萄球菌lukgh(lukab)毒素的高效抗体 Pending CN105473613A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13168631.3 2013-05-21
EP13168631 2013-05-21
PCT/EP2014/060123 WO2014187746A2 (en) 2013-05-21 2014-05-16 Generation of highly potent antibodies neutralizing the lukgh (lukab) toxin of staphylococcus aureus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105473613A true CN105473613A (zh) 2016-04-06

Family

ID=48470786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480038825.0A Pending CN105473613A (zh) 2013-05-21 2014-05-16 产生中和金黄色葡萄球菌lukgh(lukab)毒素的高效抗体

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20160108106A1 (zh)
EP (1) EP2999713A2 (zh)
JP (2) JP6560195B2 (zh)
CN (1) CN105473613A (zh)
AU (1) AU2014270598B2 (zh)
BR (1) BR112015028650A2 (zh)
CA (1) CA2913088A1 (zh)
MX (1) MX2015015965A (zh)
RU (1) RU2015154792A (zh)
WO (1) WO2014187746A2 (zh)
ZA (1) ZA201508287B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110913883A (zh) * 2017-06-13 2020-03-24 综合生物治疗疫苗公司 包含金黄色葡萄球菌杀白细胞素luka和lukb来源的多肽的免疫原性组合物

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015055814A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 Arsanis Biosciences Gmbh Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences
CA2931327A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Arsanis Biosciences Gmbh Antibodies directed against the lukgh (lukab) toxin of staphylococcus aureus and antibody sequences
RU2017139800A (ru) * 2015-04-17 2019-05-17 Арсанис Байосайенсиз Гмбх Комбинированный препарат антител против staphylococcus aureus
WO2017205377A2 (en) 2016-05-23 2017-11-30 New York University Compositions and methods for antibodies targeting staphylococcal leukotoxins
US10981979B2 (en) 2017-03-06 2021-04-20 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to Staphylococcus aureus lukab toxin

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466406A (zh) * 2006-06-12 2009-06-24 Nabi生物制药公司 α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途
CN101535811A (zh) * 2006-10-18 2009-09-16 生物梅里埃公司 用于体外诊断产pvl金黄色葡萄球菌的方法
WO2011140337A2 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 New York University Staphylococcus aureus leukocidins, therapeutic compositions, and uses thereof
CN102481352A (zh) * 2009-06-22 2012-05-30 惠氏有限责任公司 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
EP3753947A1 (en) 2007-09-14 2020-12-23 Adimab, LLC Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CN103282560B (zh) 2010-07-16 2016-08-03 阿迪马布有限责任公司 抗体文库
PL2668208T3 (pl) * 2012-04-17 2015-12-31 Arsanis Biosciences Gmbh Krzyżowo reaktywne przeciwciało rozpoznające Staphylococcus aureus
CA2871152A1 (en) * 2012-05-02 2013-11-07 New York University Methods of treating and preventing staphylococcus aureus infections and associated conditions

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466406A (zh) * 2006-06-12 2009-06-24 Nabi生物制药公司 α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途
CN101535811A (zh) * 2006-10-18 2009-09-16 生物梅里埃公司 用于体外诊断产pvl金黄色葡萄球菌的方法
CN102481352A (zh) * 2009-06-22 2012-05-30 惠氏有限责任公司 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物
WO2011140337A2 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 New York University Staphylococcus aureus leukocidins, therapeutic compositions, and uses thereof
CN103025352A (zh) * 2010-05-05 2013-04-03 纽约大学 金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUMONT 等: "Characterization of a new cytotoxin that contributes to Staphylococcus aureus pathogenesis", 《MOLECULAR MICROBIOLOGY》 *
MALACHOWA 等: "Staphylococcus aureus Leukotoxin GH Promotes Inflammation", 《THE JOURNAL OF INFECTION DISEASES》 *
THOMSEN 等: "Children with invasive staphylococcal disease exhibit a potent neutralizing antibody response to the newly described cytotoxin, LukAB/LukGH", 《IDSA ANNUAL MEETING》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110913883A (zh) * 2017-06-13 2020-03-24 综合生物治疗疫苗公司 包含金黄色葡萄球菌杀白细胞素luka和lukb来源的多肽的免疫原性组合物

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014187746A3 (en) 2015-03-12
JP2019142921A (ja) 2019-08-29
RU2015154792A (ru) 2017-06-22
JP2016526033A (ja) 2016-09-01
WO2014187746A2 (en) 2014-11-27
EP2999713A2 (en) 2016-03-30
RU2015154792A3 (zh) 2018-03-21
AU2014270598B2 (en) 2018-09-20
JP6560195B2 (ja) 2019-08-14
AU2014270598A1 (en) 2015-11-26
MX2015015965A (es) 2016-07-11
US20160108106A1 (en) 2016-04-21
ZA201508287B (en) 2017-01-25
CA2913088A1 (en) 2014-11-27
BR112015028650A2 (pt) 2017-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9914767B2 (en) Cross-reactive Staphylococcus aureus antibody
AU2006257774B2 (en) Use of Panton-Valentine Leukocidin for treating and preventing Staphylococcus infections
US20160244511A1 (en) Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences
CN105473613A (zh) 产生中和金黄色葡萄球菌lukgh(lukab)毒素的高效抗体
EP3083679B1 (en) Antibodies directed against the lukgh (lukab) toxin of staphylococcus aureus and antibody sequences
TW201610153A (zh) 革蘭氏陽性菌特異性結合的化合物
US20170145079A1 (en) E. coli specific antibody sequences
KR20170136637A (ko) 항-스타필로코커스 아우레우스 항체 배합 제제
KR20170137111A (ko) 에스. 아우레우스의 면역글로불린 결합 단백질에 대해 지시된 항체

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160406