CN105463058A - Msc促进血管新生能力的定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测间充质干细胞(MSC)促进血管新生能力的定量方法，其特征在于建立共培养体系，在这一体系中MSC通过因子分泌的方式来促进内皮细胞的增殖，检测内皮细胞的增殖数目，由内皮细胞的增殖数目来反映MSC促进内皮细胞增殖的能力，对MSC的促血管新生能力进行量化和评价。可适用于检测不同来源的MSC样品的促血管新生能力。

Description

MSC促进血管新生能力的定量方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体而言，涉及MSC促进血管新生能力的定量方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSC)是一类源于中胚层的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，其中，胎盘和脐带来源的MSC具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便，没有道德理论问题的限制、易于工业化制备等特征，是最具临床前景的多功能干细胞之一。
血管是人体的重要组成部分，它构成了循环***的主体。长期以来，对于人自体血管内皮细胞的各项研究绝大多数是基于人脐静脉内皮细胞(Humanvascularendothelialcell，HUVEC)。一方面，脐带来源丰富，容易获取；另一方面，脐带血管没有分支，便于操作，而且脐带有着理想的长度，能够保证细胞的足够量。
MSC的促血管新生的特性对肢体缺血的治疗有着非常重要的临床意义。但是目前缺乏评价MSC的促血管新生能力的方法，阻碍了MSC在治疗肢体缺血方面的临床应用。
本发明旨在建立一种MSC促进血管新生能力的定量方法，对MSC促进血管新生能力进行评价，以指导临床应用，保证MSC的疗效。
发明内容
本发明的第一技术方案为一种MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在，建立共培养体系，
在该共培养体系中共培养MSC和内皮细胞，其中，MSC通过因子分泌的方式来促进内皮细胞的增殖，
检测所述内皮细胞的增殖数量，
由所述内皮细胞的增殖数量，对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
第二方案基于第一技术方案，其特征在于，所述内皮细胞为HUVEC细胞。
第三方案基于第二技术方案，其特征在于，还检测VEGF因子，由VEGF因子的数量对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
第四方案基于第三技术方案，其特征在于，在建立共培养体系时，确定孵育时间、共培养时间、MSC和内皮细胞的细胞数的比例。
第五方案基于第四技术方案，其特征在于，所述孵育时间为2h、共培养时间为72h、MSC和内皮细胞的细胞数的比例为1/10。
第六技术方案基于第一至第五中的任一技术方案，其特征在于，在建立共培养体系时，应用不同来源的MSC与内皮细胞进行共培养，选择促进内皮细胞增殖数量最少的MSC细胞，进行移植治疗，确认其促血管新生能力。
附图说明
图1示出了培养的HUVEC细胞；
图2示出了CCK8孵育HUVEC细胞2h后标准曲线；
图3示出了CCK8孵育HUVEC细胞4h后标准曲线；
图4示出了外源添加VEGF因子量与HUVEC细胞数之间标准曲线；
图5示出了MSC和HUVEC共培养48h后HUVEC的增殖量；
图6示出了MSC和HUVEC共培养72h后HUVEC的增殖量；
图7示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖；
图8示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖；
图9示出了不同来源的MSC样品促进HUVEC的增殖；
图10示出了激光多普勒检测缺血下肢的血流灌注量，证明MSC在体内能够促进血管新生。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方案对本发明进行说明，具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不应以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
本实施方式中，共培养体系中，在上腔中种植MSC，通过分泌因子而不是直接接触作用于下腔的HUVEC，促进HUVEC的增殖，应用CCK8试剂盒检测HUVEC的增殖数量，以此来衡量MSC促血管新生能力，评价其生物学效力。
以下对MSC促血管新生能力的量化和评价进行说明。在本实施方式中，内皮细胞采用HUVEC。具体方法如下：
(1)从脐带中分离HUVEC细胞，在T75细胞培养瓶中进行培养，培养条件是37℃，5％CO2。
(2)将MSC和培养后的HUVEC共培养，共培养条件为：上下腔中MSC/HUVEC为1/10，共培养72h后按照CCK8的试剂盒说明加入CCK8检测液，孵育2h后检测细胞增殖的数量和VEGF因子的量。
(3)由HUVEC细胞增殖的数量和VEGF因子的量，对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
细胞增殖的数量和VEGF因子的量的检测，通过以下方法进行。
通过共培养实验制作标准曲线：1)制作HUVEC细胞数与OD值之间的标准曲线；2)制作VEGF因子的量与HUVEC细胞数之间的标准曲线。
孵育2h后取其上清液进行酶标OD450/630的测定，结合标准曲线对细胞增殖的数量以及分泌的因子数进行分析得到。
以下以实施例的方式对共培养体系的建立和条件进行说明。
实施例1.HUVEC细胞的扩增及鉴定
从新鲜的脐带中分离得到HUVEC细胞，种在T75细胞培养瓶中在37℃，5％CO2进行培养，培养到P5代，对细胞进行表型鉴定。鉴定的结果如表一和图1所示，细胞保持明显的HUVEC形态和特征。
表一、HUVEC表型鉴定
脐静脉内皮细胞标志 造血系细胞表面标记
％CD31+：96.30％ ％CD34+：1.07％
％VWF+：83.06％ ％CD45+：0.07％
实施例2.CCK8孵育时间的选择及HUVEC标准曲线的制定。
在24孔板中种植不同密度HUVEC细胞，待贴壁后，按照CCK8试剂盒使用说明加入CCK8检测液进行孵育，分别在孵育2h和4h的时候取部分上清液进行酶标测定(OD450/630)，实验结果显示孵育不同时间后检测的活细胞数与OD值均存在一定的线性关系。图2是CCK8孵育2h后标准曲线，图3是CCK8孵育4h后标准曲线。随着孵育时间的延长，OD值变大，但是2hr和4hr的斜率是一样的，所对应的细胞数一样。最终确定孵育时间为2h，即最佳孵育时间为2h。
实施例3.共培养时间的选择及VEGF标准曲线的制定
在24孔板中种植HUVEC细胞，饥饿培养后正常培养，在培养液中添加VEGF因子，梯度为4ng，2ng，1ng，0ng，每组设定3个复孔，以此绘制标准曲线，检测共培养体系中MSC分泌到培养液中的VEGF因子的量。选取剩余孔加悬挂式培养皿(transwell)，在transwell中种植MSC，MSC/HUVEC细胞数的比为2/15、1/15、1/30、1/60，每组设定3个复孔。共培养时间设定48h和72h，以确定共培养最佳的时间。按照使用说明加入CCK8进行孵育，孵育2h后取部分上清液进行酶标OD450/630的测定，结合标准曲线对细胞增殖的数量以及分泌的因子数进行分析。图4是外源添加VEGF因子量与HUVEC细胞数之间标准曲线，根据该标准曲线能够根据HUVEC细胞数确定VEGF因子量。图5是共培养48h后HUVEC的增殖量，图6是共培养72h后HUVEC的增殖量。
图5、图6的实验结果显示共培养48h和72h后，下腔的HUVEC细胞数会随着上腔中的MSC的增加而增加，但两个时间点比较，HUVEC的增殖在共培养72h后更加明显，选定共培养时间为72h，即，共培养的最佳时间为72h。
实施例4.上下腔中MSC/HUVEC细胞数比例的选择
应用实施例3的实验方法，首先选取MSC/HUVEC细胞数的比为2/15、1/15、1/30、1/60进行共培养实验，共培养时间为72h。图7、8示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖。培养72h后，2/15和1/15的比例较好，2/15比1/15的细胞数加倍，但其促增殖能力没有倍增，因此再次选取MSC/HUVEC细胞数的比为1/10和1/15，结果表明1/10比例反映单个细胞的促进HUVEC细胞的增殖能力最佳，最终确定上下腔中MSC/HUVEC细胞数比值为1/10。
实施例5.检测样品MSC细胞的促内皮细胞增殖能力
实验中选取了6对不同个体来源的脐带和胎盘MSC细胞按照已经建立的共培养条件进行实验，其中脐带MSC编号为UC，胎盘MSC编号为CV，不同个体的编号是1-6；其中UC1与CV1来源于同一个体，以此类推。用于检测的细胞均为P5代，以此12支细胞作为样品细胞对共培养的方法进行验证。表二示出了不同样品细胞促进HUVEC增殖率及VEGF分泌量，图9示出了不同来源的MSC样品促进HUVEC的增殖。
实验结果显示此12支细胞均能促进HUVEC增殖，但是存在个体差异(图9)，其中，促进HUVEC增殖量最少的为CV6细胞。
表二、不同样品细胞促进HUVEC增值率及VEGF分泌量
实施例6.MSC促HUVEC增殖阈值的评定
选用CV6细胞对下肢缺血裸大鼠进行移植治疗，衡量其促血管新生能力。实验分为3组，即细胞治疗组(2×106)，对照组(局部注射PBS)，正常组(局部注射，2×106)。下肢缺血手术方法是阻断动物的左下肢股静脉、大隐动静脉及股动静脉肌支的血流。造模成功后，在术肢手术部位局部注射MSC，细胞治疗3周后，利用激光多普勒检测术肢的血流灌注量，血流恢复情况，由此来评价细胞的促血管新生能力。由图9可见，裸大鼠经过下肢缺血手术后其左后肢明显缺血(检测显示为蓝色、黑色)，3周后对照组的术肢仍然缺血明显，而经过细胞治疗的裸大鼠下肢的血流恢复明显(检测显示为黄色、红色)，基本上恢复到和正常肢的血流情况。由此得出结论，所有样品MSC细胞具有促血管新生能力，能够利用该共培养体系，由MSC通过因子分泌的方式来促进内皮细胞的增殖，通过检测内皮细胞增殖数目来反映MSC促进内皮细胞增殖的能力，以此来对MSC的促血管新生能力进行量化和评价。
由上可知，本发明不仅能够对MSC的促血管新生的生物学效力进行定量和评价，还可以同时检测多个样本，通过样本间的比对来定量和评价。并能够检测MSC分泌VEGF的水平，且此方法还适用于检测MSC分泌其他的促血管新生因子的水平。
以下对MSC促进促血管新生的机理进行分析
血管生成(angiogenesis)是从已有血管发芽生成新血管的过程，整个血管的内表面都是由一层内皮细胞所覆盖的，血管的生成与血管内皮细胞迁移和增殖相关。促血管新生的因子可以与内皮细胞表面的特异受体结合，引起微血管内皮细胞增殖，迁移，血管基底膜与血管外基质降解，形成毛细血管腔结构，经过血管重塑，最后组成毛细血管网。在血管新生过程中，血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子，是生理与病理状态下最重要的血管生成调节物质。提高细胞分泌VEGF的水平，可以促进内皮细胞的增殖，并可以促进内皮细胞的迁移和参与血管的新生。
体内外实验证明MSC具有治疗性血管生成作用，它可以通过直接分化成内皮细胞或者血管平滑肌细胞参与血管新生，另外它还能够分泌多种促血管形成因子，改善微环境，促进血管内皮细胞增殖和迁移，进而促进血管新生。
本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念体现于具体的上下文中。在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。

Claims (6)

1.一种MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在于
建立共培养体系，
在该共培养体系中共培养MSC和内皮细胞，其中，MSC通过因子分泌的方式来促进内皮细胞的增殖，
检测所述内皮细胞的增殖数量，
由所述内皮细胞的增殖数量，对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
2.根据权利要求1记载的MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在于，所述内皮细胞为HUVEC细胞。
3.根据权利要求2记载的MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在于，还检测VEGF因子，由VEGF因子的数量对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
4.根据权利要求3记载的MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在于，在建立共培养体系时，确定孵育时间、共培养时间、MSC和内皮细胞的细胞数的比例。
5.根据权利要求4记载的MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在于，所述孵育时间为2h、共培养时间为72h、MSC和内皮细胞的细胞数的比例为1/10。
6.根据权利要求1至5中任一项所记载的MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在于，在建立共培养体系时，应用不同来源的MSC与内皮细胞进行共培养，选择促进内皮细胞增殖数量最少的MSC细胞，进行移植治疗，确认其促血管新生能力。
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