CN105462947B - 利用浮萍生产纤维素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用浮萍生产纤维素酶的方法，采用浮萍或经过处理后的浮萍的残渣为底物发酵生产纤维素酶。浮萍具有易获得，资源广，价格低廉等好处，对于工业化诱导生产纤维素酶具有广阔的市场前景。

Description

利用浮萍生产纤维素酶的方法
技术领域
本发明涉及纤维素酶的生产技术领域。更具体地说，本发明涉及一种利用浮萍生产纤维素酶的方法。
背景技术
木质纤维素材料是地球上丰富的可在生资源，其可以被分解为葡萄糖、木糖等单糖被进一步利用生产乙醇等生物基化学品。目前，虽然将秸秆等农业废弃物经纤维素酶酶解生产乙醇的方法已经被广泛认同，但是受到秸秆转化为生物基化学品过程中几个关键因素的制约。纤维素酶水解效率低、生产成本高是制约因素之一。
纤维素酶的生产方法主要采用木质纤维素材料做底物微生物发酵，而木质纤维素材料的组成和结构影响其水解效率，从而影响纤维素酶的生产。研究中已经有报道的诱导纤维素酶的木质纤维素底物有玉米芯、玉米秸秆、稻草、麸皮等。他们均含有不同较高的木质素，且结构致密，难以被水解利用。也有研究人员制备槐糖等诱导物，在发酵培养基添加进行诱导纤维素酶的合成，但由于槐糖的制备工艺复杂，成本较高，在纤维素发酵生产难以进行推广应用。因此筛选一种木质素含量较少，结构疏松，能够高效诱导纤维素酶，价格低廉同时可以被高效利用的底物用于纤维素酶的发酵生产是很有必要的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种利用浮萍生产纤维素酶的方法，本发明的方法利用浮萍能够高效诱导木霉菌株产生纤维素，浮萍易获得且价格低廉，可以实现低成本工业化生产纤维素酶。
本发明还有一个目的是提供一种对浮萍进行前处理的方法，通过采用碳酸钠去除浮萍中的果胶成分，采用淀粉酶和糖化酶水解浮萍中的淀粉，浮萍残渣中含有较高含量的纤维素和半纤维素，可以提高其诱导产生纤维素酶的产量和酶活。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种利用浮萍生产纤维素酶的方法，采用浮萍为底物发酵生产纤维素酶。
优选的是，所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，所述浮萍包括细脉浮萍、小浮萍、青萍和紫背浮萍中的一种或多种的组合。
优选的是，所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，以浮萍为底物制备种子培养基和发酵培养基，其中种子培养基中其添加量为20g/L，发酵培养基中其添加量为30-50g/L。
优选的是，所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，用浮萍为底物发酵生产纤维素酶之前，对浮萍进行前处理，所述前处理的具体方式包括物理方式、化学方式或生物方式中的一种或几种的组合，所述物理方式包括粉碎、研磨或加热，所述化学方式包括酸处理、碱处理或自由基处理，所述生物方式包括酶处理。
优选的是，所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，所述前处理具体为：将浮萍粉碎得粉末，取2g浮萍粉末置于20ml pH 6的柠檬酸缓冲液中，加入淀粉酶300u、糖化酶150u和0.106g碳酸钠，置于水浴摇床中，旋转频率为100rpm，50℃震荡水解48h后，取出过滤后得残渣，水洗后置于60℃的鼓风干燥箱中干燥。
优选的是，所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，发酵采用的菌种为木霉。
优选的是，所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，发酵采用的菌种为里氏木霉。
本发明至少包括以下有益效果：本发明首次采用浮萍为底物诱导生产纤维素酶，浮萍易获得，且价格低廉，其他诱导生产纤维素酶的底物如微晶纤维素、槐糖等，不仅制备工艺复杂，使用成本甚高，本发明的方法为工业化生产纤维素酶提供了方向；本发明通过对浮萍进行前处理除去果胶和淀粉，提高了其诱导产生纤维素的产量和酶活，为大量生产纤维素酶奠定了基础。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所使用的菌种为里氏木霉(trichoderma reesei CCIC 13052)ATCC56765由中国微生物菌种保藏中心(CICC)购得。
实施例1：未经处理的浮萍直接做底物发酵产纤维素酶
步骤一、浮萍经过粉碎后，用于配制种子培养基和发酵培养基，其中，
种子培养基组成：浮萍20g/L，玉米浆干粉10g/L，葡萄糖10g/L，pH 4.5。
发酵培养基组成：浮萍X，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L，吐温-802ml，葡萄糖10g/L，pH 5.0，其中浮萍的添加量X依次取为10、30、50、70g/L；
步骤二、将里氏木霉种子接种到PDA斜面，活化培养，30℃条件下培养7天；将活化后的斜面制备孢子悬液，按照3％(体积分数)的比例接种至种子培养基中，摇床28℃，180rpm条件下培养24h；种子培养后按照5％(体积分数)的比例接种至发酵培养基中，摇床26℃，180rpm条件下培养120h后停止发酵，采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定滤纸酶活，采用Bradford方法测定发酵液中的蛋白含量(即纤维素酶产量)见表1。
实施例2：经过处理的浮萍做底物发酵产纤维素酶
步骤一、取浮萍粉碎后的粉末，配制反应体系，按照10％的底物浓度，即2g浮萍置于20ml pH 6的柠檬酸缓冲液中，并在柠檬酸缓冲液中添加淀粉酶300u，糖化酶150u，0.106g碳酸钠(每1升柠檬酸缓冲液中添加0.05mol碳酸钠)，得到混合溶液；
步骤二、将上述混合溶液置于水浴摇床中，旋转频率为100rpm，50℃震荡水解48h后，取出过滤得残渣，将残渣水洗后置于鼓风干燥箱(60℃)中干燥得处理后的浮萍残渣；
步骤三、将上述浮萍残渣经过粉碎后，用于配制种子培养基和发酵培养基，
其中，种子培养基组成：浮萍残渣20g/L，玉米浆干粉10g/L，葡萄糖10g/L，pH 4.5；发酵培养基组成：浮萍残渣Y，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L，吐温-802ml，葡萄糖10g/L，pH 5.0，其中浮萍残渣的添加量Y依次取为10、30、50、70g/L；
步骤四、将里氏木霉种子接种到PDA斜面，活化培养，30℃条件下培养7天；将活化后的斜面制备孢子悬液，按照3％(体积分数)的比例接种至种子培养基中，摇床28℃，180rpm条件下培养24h；种子培养后按照5％(体积分数)的比例接种至发酵培养基中，摇床26℃，180rpm条件下培养120h后停止发酵，采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定滤纸酶活，采用Bradford方法测定发酵液中的蛋白含量见表1。
实施例3：将实施例1中的浮萍替换为细脉浮萍，其他诱导生产纤维素酶的方法同实施例1。
实施例4：将实施例2中的浮萍替换为小浮萍，其他诱导生产纤维素酶的方法同实施例1。
实施例5：将实施例3中的浮萍替换为青萍，其他诱导生产纤维素酶的方法同实施例1。
实施例6：将实施例4中的浮萍替换为紫背浮萍，其他诱导生产纤维素酶的方法同实施例1。
实施例7：将实施例4中的浮萍替换为紫背浮萍，其他诱导生产纤维素酶的方法同实施例1。
实施例8：在实施例2的基础上，浮萍替换为紫背浮萍、青萍、小浮萍、细脉浮萍中的一种或几种的混合物，并将浮萍经过下述前处理获得浮萍残渣，这里所说的前处理包括：物理方式、化学方式或生物方式中的一种或几种的组合，所述物理方式包括粉碎、研磨或加热，所述化学方式包括酸处理、碱处理或自由基处理，所述生物方式包括酶处理。本发明对浮萍进行前处理，其中之一个目的是为了去除浮萍中含有的淀粉、果胶等物质，使获得的浮萍残渣中含有较高含量的纤维素和半纤维素，从而提高其诱导产纤维素酶活性和产量的能力，物理方式或化学方式或其他生物方式的方法也可以去除淀粉和果胶成分，故本发明所说的对浮萍进行前处理的方法不限于实施例2中所采用的方法。
对照例1：
步骤一、配制种子培养基和发酵培养基，其中，
种子培养基组成：玉米浆干粉10g/L，葡萄糖10g/L，pH 4.5。
发酵培养基组成：玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L，吐温-802ml，葡萄糖10g/L，pH 5.0；
步骤二、将里氏木霉种子接种到PDA斜面，活化培养，30℃条件下培养7天；将活化后的斜面制备孢子悬液，按照3％(体积分数)的比例接种至种子培养基中，摇床28℃，180rpm条件下培养24h；种子培养后按照5％(体积分数)的比例接种至发酵培养基中，摇床26℃，180rpm条件下培养120h后停止发酵，采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定滤纸酶活，采用Bradford方法测定发酵液中的蛋白含量见表1。
对比例2：
步骤一、配制种子培养基和发酵培养基，其中，
种子培养基组成：微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉10g/L，葡萄糖10g/L，pH 4.5。
发酵培养基组成：微晶纤维素50g/L，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L，吐温-802ml，葡萄糖10g/L，pH 5.0；
步骤二、将里氏木霉种子接种到PDA斜面，活化培养，30℃条件下培养7天；将活化后的斜面制备孢子悬液，按照3％(体积分数)的比例接种至种子培养基中，摇床28℃，180rpm条件下培养24h；种子培养后按照5％(体积分数)的比例接种至发酵培养基中，摇床26℃，180rpm条件下培养120h后停止发酵，采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定滤纸酶活，采用Bradford方法测定发酵液中的蛋白含量见表1。
表1 不同条件下测定的纤维素酶活和发酵液中蛋白含量
从表1可以看出，由实施例1和对比例1可知，直接将浮萍作为底物对诱导里氏木霉生产纤维素酶是有显著的作用，酶活由0.6FPU/mL可提高至6.8FPU/mL，酶产量由0.2g/L可提高至2.94g/L，酶活和酶产量随着浮萍在发酵培养基中的用量的增大而呈现先增大后减小的变化，同时，当浮萍在发酵培养基中添加了过大时，发酵液过于粘稠；
由实施例1和实施例2可知，对浮萍进行前处理去除果胶和淀粉后得到的浮萍残渣作为底物诱导里氏木霉生产纤维素酶，相比直接使用浮萍进行诱导生产纤维素酶，得出前处理后的浮萍残渣更有助于提高产生纤维素酶的酶活，由蛋白含量可以看出，纤维素的产量也是显著增加的，且均随着浮萍残渣在发酵培养基中的用量的增加呈现先增大后减小的变化，故而浮萍或浮萍残渣在发酵培养基中的含量以30-50g/L为宜。
由实施例1和对比例2可知，虽然实施例1采用不同量的浮萍诱导生产的纤维素酶没有使用等同重量的微晶纤维素产生的纤维素酶多，但是浮萍原料易获得，成本也低，采用实施例1中X取50g/L(浮萍)、实施例2中Y取50g/L(浮萍残渣)、以及对比例2(微晶纤维素)的三种方法，制备1×106FPU的纤维素酶成本对比见表2，由表2可知，产生百万FPU的纤维素酶，以浮萍、浮萍残渣使用的成本比微晶纤维素的低，且以浮萍残渣的成本最低，另外，微晶纤维素原料较浮萍不易获得，生产花费的劳动量也大，相比之下，浮萍更适于工业化大规模生产纤维素酶使用的底物。
表2 浮萍、浮萍残渣与微晶纤维素作诱导物成本对比
注：按照实施例中发酵培养基组成计算(50g/l浮萍，50g/l浮萍残渣，50g/l微晶纤维素对比)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (4)

1.一种利用浮萍生产纤维素酶的方法，其特征在于，采用浮萍为底物发酵生产纤维素酶；
以浮萍为底物制备种子培养基和发酵培养基，其中种子培养基中其添加量为20g/L，发酵培养基中其添加量为30-50g/L；
用浮萍为底物发酵生产纤维素酶之前，对浮萍进行前处理，所述前处理的具体方式包括物理方式、化学方式或生物方式中的一种或几种的组合，所述物理方式包括粉碎、研磨或加热，所述化学方式包括酸处理、碱处理或自由基处理，所述生物方式包括酶处理；
所述前处理具体为：将浮萍粉碎得粉末，取2g浮萍粉末置于20ml pH 6的柠檬酸缓冲液中，加入淀粉酶300u、糖化酶150u和0.106g碳酸钠，置于水浴摇床中，旋转频率为100rpm，50℃震荡水解48h后，取出过滤后得残渣，水洗后置于60℃的鼓风干燥箱中干燥。
2.如权利要求1所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述浮萍包括细脉浮萍、小浮萍、青萍和紫背浮萍中的一种或多种的组合。
3.如权利要求1所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，其特征在于，发酵采用的菌种为木霉。
4.如权利要求3所述的利用浮萍生产纤维素酶的方法，其特征在于，发酵采用的菌种为里氏木霉。
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