CN105462909B - 一种高效表达人促卵泡激素的cho细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，属于生物制药技术领域。本发明所提供的培养方法是将种子细胞配制成细胞悬液，在利用无血清基础培养基重悬后进行传代培养，获得种子悬液，再将所得的种子悬液接种到生物反应器中进行培养，培养过程中定期流加无血清补充培养基，并监测细胞生长情况并补充葡萄糖溶液，培养结束后收获细胞。本发明所提供的方法全程采用无血清悬浮培养，摇瓶复苏、扩增后转入发酵罐培养，工艺流程简单，并且细胞培养密度大，可达到4×107个/mL，细胞活率达到98％以上，在高密度和高活率下维持时间长，终产物收率可达到40mg/L，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，属于生物制药技术领域。
背景技术
人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类***，属于异二聚体糖蛋白家族，由独立的基因分别编码的两条非共价连接的α链和β链组成。FSHα链的两个潜在的天冬氨酰胺连接的糖基化位点，分别在52和78的位置，而β链的两个潜在的天冬氨酰胺连接的糖基化位点则分别在7和24的位置(Olijve W，de Boer W，Mulders JW等(1996)Molecular biology andbiochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone(Puregon).Mol.Hum.Reprod.2(5):371-382)。对于女性来说，其主要功能是卵巢细胞和***生成必需的一种生长因子、促分泌剂和细胞生长调节剂，在促使卵泡正常生长、成熟和性腺甾体类固醇的产生中不可缺少；对于男性来说，其主要功能是与***(LH)控制的***结合，从而激活和保持正常***的数目和质量。
最初医学使用的促卵泡激素是从绝经期妇女的尿液中提纯的，1961年Borth第一次将提取的人促卵泡激素用于人体实验，取得了较好效果。但是这种提纯的促卵泡激素内有***和其它人源蛋白的污染，不仅批次间产品会出现糖基结构的差异，而且对尿源的需求量巨大，很难满足快速增长的市场需求。随着分子生物学的快速发展，应用重组DNA技术生产的重组人促卵泡激素应运而生，与尿源促卵泡激素(uFSH)相比，rhFSH纯度更高，而且没有其他人源蛋白污染，批间纯度一致性更高。虽然二者在临床疗效上没有明显差别，但rhFSH在提高安全性和降低副反应方面更具优势。
现已上市的商品化重组FSH都是通过中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovarycell，CHO)基因组中***人FSH表达基因而构建的永久性表达细胞系所生产。最初，重组人FSH都采用含有血清的培养基进行转瓶或者微载体纸片贴壁培养(Recombinant folliclestimulating hormone:development of the first biotechnology product for thetreatment of infertility.Recombinant Human FSH Product Development Group.humReprod Update.1998,4(6):862-881)，由于其中使用动物来源的血清，既不利于纯化，也有潜在的动物病毒感染的风险。可是，在培养基中不添加血清的话，重组FSH的表达量将会显著降低。近年来也有关于大规模悬浮培养工艺研究的报道(CHO细胞表达rhFSH的大规模无血清培养工艺的研究，吉林大学，2012)，但该工艺种子复苏采用转瓶培养，需要转瓶机，没有摇瓶培养方便，而且表达量也不高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种采用含有人FSH基因的重组CHO细胞来克服现有的培养方法所致的人FSH表达量低的问题的方法。所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，该培养方法是将种子细胞配制成细胞悬液，在利用无血清基础培养基重悬后进行传代培养，获得种子悬液，再将所得的种子悬液接种到生物反应器中进行培养，培养过程中定期流加无血清补料培养基，并监测细胞生长情况并补充葡萄糖溶液，培养结束后收获细胞。
所述培养方法的步骤如下：
1)将重组CHO细胞复苏活化后，利用无血清基础培养基重悬后获得种子细胞溶液；
2)利用无血清基础培养基传代培养步骤1)所得的种子细胞，培养结束后获得细胞悬液；
3)将步骤2)所得的细胞悬液接种到生物反应器中进行培养，培养过程中定期流加无血清补料培养基，控制温度，检测细胞生长情况，并补充葡萄糖溶液；
4)培养结束后收获细胞。
优选地，所述无血清基础培养基，由浓度为15-20g/L的CD-CHO培养基、浓度为16～20g/L的CD Opti CHO培养基、浓度为2～5g/L的SFM4CHO培养基、浓度为17-19g/L的CDM4mab培养基或浓度为16-21g/L的Ex-cell 302培养基中的一种或几种组成；添加物由浓度为0.1～0.3mM的甲硫氨酸、0.2～0.4g/L的碳酸氢钠、0.5～2g/L的F68、3～5g/L的D-葡萄糖或1～2g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种或几种组成，pH6.8-7.4，渗透压280-380mOsmol·kg-1。
更优选地，所述无血清基础培养基，是浓度为17～19g/L的CD-CHO培养基、16～18g/L CD Opti CHO培养基或3～4g/L的SFM4CHO培养基中的一种或几种；添加物为0.15～0.25mM的甲硫氨酸、0.28～0.35g/L的碳酸氢钠、0.8～1.2g/L的F68或2～4g/L的D-葡萄糖中的一种或几种，pH7.0-7.2，渗透压300-360mOsmol·kg-1。
优选地，所述无血清补料培养基，由浓度为38～45g/L的Feed B培养基，6～12g/L的Cell Boost 5，10～15g/L CM1027或18～22g/L Feed C培养基中的一种或几种组成；添加物由浓度10～15g/L的D-葡萄糖，1～3mM的甲硫氨酸，8～10g/L的D-半乳糖或8～10g/L的N-乙酰葡萄糖胺中的一种或者几种组成，pH6.8-7.4，渗透压600-1200mOsmol·kg-1。
更优选地，所述无血清补料培养基，由浓度为40～42g/L的Feed B培养基，19～21g/L Feed C培养基或8～10g/L的Cell Boost 5中的一种或者几种组成；添加物由浓度为1.5～2.5mM的甲硫氨酸或8～10g/L的D-葡萄糖组成，pH7.0-7.2，渗透压800-1000mOsmol·kg-1。
优选地，步骤3)所述生物反应器中进行培养，条件为转速130-200rpm，溶氧30-80％，pH6.8-7.4，初始培养温度为36-38℃；所述控制温度，是在培养5-7d后将温度调整至32-35℃；培养过程中细胞活率为60-100％。
更优选地，所述生物反应器中进行培养，条件为转速150-180rpm，溶氧40-60％，pH7.0-7.2，初始培养温度为36.6-37℃；所述控制温度，是在培养5-7d后将温度调整至33-34℃，培养过程中细胞活率为80-100％。
优选地，步骤3)所述定期流加无血清补充培养基，是在发酵后第2-9天流加，流加次数为2-5次，流加比例为8-15％。
更优选地，所述定期流加无血清补料培养基，是在发酵后第3-8天流加，流加次数为3-4次，流加比例为10-12％。
优选地，步骤3)所述补充葡萄糖溶液，是使培养液中葡萄糖浓度在1-8g/L。
所述的方法的具体步骤如下：
1.将低温保存的重组CHO细胞取出后在37℃水浴融化后离心留取沉淀，再利用无血清基础培养基重悬，获得种子细胞溶液；
2.利用无血清基础培养基传代培养步骤1)所得的种子细胞，培养条件为：转速120rpm，温度37℃，湿度75％，CO2浓度5％，培养7天经过4级传代培养后获得细胞悬液；
步骤1)和步骤2)所用无血清基础培养基是由18g/L CD-CHO培养基、3.5g/LSFM4CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成，pH7.2，渗透压340mOsmol·kg-1；
3.将步骤2)所得的细胞悬液接种到生物反应中进行培养，反应器体积为3L，接种细胞密度为5ⅹ105个/mL，初始培养条件为：转速150rpm，溶氧40％，温度37℃，pH值7.2，在培养的第4,6和8天分别补充10％的无血清补充培养基，培养的第7天将温度调节为33℃；培养过程中检测细胞生长情况，并补充葡萄糖溶液使培养液中葡萄糖含量不低于1g/mL；所用无血清补料培养基由40g/L的Feed B培养基、20g/L Feed C培养基和2mM甲硫氨酸组成；
4.培养结束后收获细胞。
以上任一所述方法在生产人促卵泡激素中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明获得的有益效果如下：
本发明从种子复苏、传代至放大到发酵罐培养，全程采用无血清培养，所用培养基均为化学成分限定培养基或无血清培养基，使培养工艺更稳定可控，产物的批次间质量更稳定。
细胞生长密度高，能达到4×107个/mL，细胞活率达到98％以上，在高密度和高活率下维持时间长，终产物收率可达到40mg/L。
本发明全程采用无血清悬浮培养，摇瓶复苏、扩增后转入发酵罐培养，工艺流程简单，适合工业化生产。
附图说明
图1细胞培养的流程图。
图2为实施例1细胞的培养天数和活率变化曲线。
图3为实施例2细胞的培养天数和活率变化曲线。
图4为实施例3细胞的培养天数和活率变化曲线。
图5为实施例4细胞的培养天数和活率变化曲线。
图6为实施例5细胞的培养天数和活率变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1
本实施例提供了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，步骤如下：
从液氮罐取出种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心4min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基重悬后，所述基础培养基由18g/L的CD-CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成。于250ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速120rpm，温度37℃，湿度75％，5％CO2。种子扩增按照250ml摇瓶-500ml摇瓶-1000ml摇瓶-2000ml摇瓶的顺序逐级传代，经过7d的扩增，细胞培养体积达到500ml，密度为3.0×106个/ml。
取种子悬液接种生物反应器，接种后培养体积为3L，密度5×105个/ml。初始培养条件为：转速150，溶氧60％，温度37℃，pH值7.2。在反应器培养的第4，6，8d分别补充培养体积10％的补料培养基，所述补料培养基由40g/L的Feed B培养基、8g/L Cell Boost 5培养基和2mM甲硫氨酸组成。第7天调节温度为33℃。每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充500g/L的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于1g/L，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化。本次反应器培养一共12d，细胞生长最高密度2.67×107个/ml，收获细胞培养液3.5L，人促卵泡激素的表达量为20mg/L，共收获70mg人促卵泡激素。
本实施例的细胞的培养天数和活率变化曲线图如图2所示。
实施例2
本实施例提供了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，步骤如下：
从液氮罐取出种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心4min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基重悬后，所述基础培养基由18g/L的CD Opti CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成。于250ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速120rpm，温度37℃，湿度75％，5％CO2。种子扩增按照250ml摇瓶-500ml摇瓶-1000ml摇瓶-2000ml摇瓶的顺序逐级传代，经过8d的扩增，细胞培养体积达到500ml，密度为3.5×106个/ml。
取种子悬液接种生物反应器，接种后培养体积为3L，密度5×105个/ml。初始培养条件为：转速160，溶氧45％，温度37℃，pH值7.2。在反应器培养的第4，6，8d分别补充培养体积10％的补料培养基，所述补料培养基由20g/L的Feed C培养基、12g/L Cell Boost 5培养基和2mM甲硫氨酸组成。第7天调节温度为33℃。每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充500g/L的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于1g/L，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化。本次反应器培养一共12d，细胞生长最高密度2.66×107个/ml，收获细胞培养液3.5L，人促卵泡激素的表达量为25mg/L，共收获87.5mg人促卵泡激素。
本实施例的细胞的培养天数和活率变化曲线如图3所示。
实施例3
本实施例提供了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，步骤如下：
从液氮罐取出种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心4min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基重悬后，所述基础培养基由20g/L的Ex-cell 302培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成。于250ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速120rpm，温度37℃，湿度75％，5％CO2。种子扩增按照250ml摇瓶-500ml摇瓶-1000ml摇瓶-2000ml摇瓶的顺序逐级传代，经过8d的扩增，细胞培养体积达到500ml，密度为3.1×106个/ml。
取种子悬液接种生物反应器，接种后培养体积为3L，密度5×105个/ml。初始培养条件为：转速175，溶氧40％，温度37℃，pH值7.2。在反应器培养的第3，5，7d分别补充培养体积10％的补料培养基，所述补料培养基由20g/L的Feed C培养基、8g/L Cell Boost 5培养基和2mM甲硫氨酸组成。第7天调节温度为33℃。每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充500g/L的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于1g/L，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化。本次反应器培养一共11d，细胞生长最高密度2.4×107个/ml，收获细胞培养液3.5L，人促卵泡激素的表达量为18mg/L，共收获63mg人促卵泡激素。
本实施例的细胞的培养天数和活率变化曲线如图4所示。
实施例4
本实施例提供了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，步骤如下：
从液氮罐取出种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心4min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基重悬后，所述基础培养基由18g/L的CDM4mab培养基、3.5g/L的SFM4CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成。于250ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速120rpm，温度37℃，湿度75％，5％CO2。种子扩增按照250ml摇瓶-500ml摇瓶-1000ml摇瓶-2000ml摇瓶的顺序逐级传代，经过7d的扩增，细胞培养体积达到500ml，密度为3.3×106个/ml。
取种子悬液接种生物反应器，接种后培养体积为3L，密度5×105个/ml。初始培养条件为：转速150，溶氧50％，温度37℃，pH值7.2。在反应器培养的第4，6，8d分别补充培养体积10％的补料培养基，所述补料培养基由40g/L的Feed B培养基、20g/L Feed C培养基和2mM甲硫氨酸组成。第7天调节温度为33℃。每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充500g/L的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于1g/L，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化。本次反应器培养一共12d，细胞生长最高密度3.1×107个/ml，收获细胞培养液3.5L，人促卵泡激素的表达量为30mg/L，共收获105mg人促卵泡激素。
本实施例的细胞的培养天数和活率变化曲线如图5所示。
实施例5
本实施例提供了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，步骤如下：
从液氮罐取出种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心4min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基重悬后，所述基础培养基由18g/L的CD-CHO培养基、3.5g/L的SFM4CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成。于250ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速120rpm，温度37℃，湿度75％，5％CO2。种子扩增按照250ml摇瓶-500ml摇瓶-1000ml摇瓶-2000ml摇瓶的顺序逐级传代，经过7d的扩增，细胞培养体积达到500ml，密度为3.2×106个/ml。
取种子悬液接种生物反应器，接种后培养体积为3L，密度5×105个/ml。初始培养条件为：转速150，溶氧40％，温度37℃，pH值7.2。在反应器培养的第4，6，8d分别补充培养体积10％的补料培养基，所述补料培养基由40g/L的Feed B培养基、20g/L Feed C培养基和2mM甲硫氨酸组成。第7天调节温度为33℃。每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充500g/L的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于1g/L，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化。本次反应器培养一共14d，细胞生长最高密度4.12×107个/ml，，收获细胞培养液3.5L，人促卵泡激素的表达量为40mg/L，共收获140mg人促卵泡激素。
本实施例的细胞的培养天数和活率变化曲线如图6所示。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (2)
1.一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将低温保存的重组CHO细胞取出后在37℃水浴融化后离心留取沉淀，再利用无血清基础培养基重悬，获得种子细胞溶液；
2)利用无血清基础培养基传代培养步骤1)所得的种子细胞，培养条件为：转速120rpm，温度37℃，湿度75％，CO2浓度5％，培养7天经过4级传代培养后获得细胞悬液；
步骤1)和步骤2)所用无血清基础培养基是由18g/L CD-CHO培养基、3.5g/LSFM4 CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成，pH7.2，渗透压340mOsmol·kg-1；
将步骤2)所得的细胞悬液接种到生物反应中进行培养，反应器体积为3L，接种细胞密度为5ⅹ105个/mL，初始培养条件为：转速150rpm，溶氧40％，温度37℃，pH值7.2，在培养的第4，6和8天分别补充10％的无血清补料培养基，培养的第7天将温度调节为33℃；培养过程中检测细胞生长情况，并补充葡萄糖溶液使培养液中葡萄糖含量不低于1g/mL；所用无血清补料培养基由40g/L的Feed B培养基、20g/L Feed C培养基和2mM甲硫氨酸组成，pH7.0-7.2，渗透压800-1000mOsmol·kg-1；培养过程控制细胞活率在90％以上；
3)细胞活率低于90％时，培养结束收获细胞。
2.权利要求1所述方法在生产人促卵泡激素中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Guojun Inventor after: Jiang Yuanyuan Inventor after: Liu Shanshan Inventor after: Zhang Yiwen Inventor after: Liu Yuting Inventor after: Ge Jingcheng Inventor after: Huang Yan Inventor after: Ding Hui Inventor after: Liu Jiaji Inventor after: Zhang Xinyan Inventor after: Yuan Shujie Inventor after: Yang Xinchun Inventor after: Li Zhengwu Inventor after: Wang Rui Inventor after: Guan Lufan Inventor after: Gao Jing Inventor after: Zhao Huanan Inventor after: Yuan Yuan Inventor after: Zhang Daoxu Inventor after: Zhang Xueting Inventor after: Lv Zhonghua Inventor after: Wang Ying Inventor after: Meng Qingyong Inventor after: Zhang Lei Inventor after: Gao Hongmei Inventor before: Yuan Shujie Inventor before: Guan Lufan Inventor before: Jiang Yuanyuan Inventor before: Lv Zhonghua Inventor before: Gao Hongmei Inventor before: Gao Jing Inventor before: Zhao Huanan Inventor before: Li Zhengwu Inventor before: Li Guojun Inventor before: Wang Ying Inventor before: Yuan Yuan Inventor before: Zhang Xueting Inventor before: Wang Rui Inventor before: Meng Qingyong Inventor before: Zhang Lei |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CI03 | Correction of invention patent |
Correction item: Inventor Correct: Li Guo Jun|Yang Xin Chun|Zhang Dao Xu|Zhang Xue Ting|Lv Zhong Hua|Wang Ying|Meng Qing Yong|Zhang Lei|Gao Hong Mei|Jiang Yuan Yuan|Liu Pan Pan|Zhang Yi Wen|Liu Yu Ting|Ge Jing Cheng|Huang Yan|Ding Hui|Liu Jia Ji|Zhang Xin Yan|Yuan Shu Jie|Li Zheng Wu|Wang Rui|Guan Lu Fan|Gao Jing|Zhao Hua Nan|Yuan Yuan False: Li Guo Jun|Yang Xin Chun|Zhang Dao Xu|Zhang Xue Ting|Lv Zhong Hua|Wang Ying|Meng Qing Yong|Zhang Lei|Gao Hong Mei|Jiang Yuan Yuan|Liu Shan Shan|Zhang Yi Wen|Liu Yu Ting|Ge Jing Cheng|Huang Yan|Ding Hui|Liu Jia Ji|Zhang Xin Yan|Yuan Shu Jie|Li Zheng Wu|Wang Rui|Guan Lu Fan|Gao Jing|Zhao Hua Nan|Yuan Yuan Number: 21-02 Volume: 35 |
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| CI03 | Correction of invention patent | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221026 Address after: No. 68, Limin West 4th Street, Limin Development Zone, Harbin, Heilongjiang 150500 Patentee after: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP HOLDING Co.,Ltd. Patentee after: HARBIN PHARMACEUTICAL Group TECHNOLOGY CENTER Address before: 150025 Xi'an Street, Limin Development Zone, Harbin, Heilongjiang Patentee before: HARBIN PHARMACEUTICAL Group TECHNOLOGY CENTER |
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| TR01 | Transfer of patent right |