CN105457085A - 一种胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法。以淡水鱼皮或鱼鳞为原料制取得到未变性胶原，将未变性胶原溶于0.1～0.5M/L的稀乙酸中，得5～20mg/mL胶原溶液，在不高于10℃下，调节胶原溶液pH，将1～20mg/mL的多巴胺溶液按胶原干重的1～20％加入胶原溶液中，反应1～4h加入交联剂，交联剂为胶原干重的1～10％，调控凝胶化过程，充分水洗后在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，在10～30kGy伽马射线辐照灭菌。本发明的水凝胶材料的凝胶pH值为6～8，黏接强度为0.05～2.0MPa，平均孔隙率为60～90％，可用作生物医学的仿生材料。

Description

一种胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法。
背景技术
贻贝仿生黏附材料因其广阔的市场应用前景，可用于外伤、手术和整形等导致的皮肤、肌肉、骨骼等损伤处的黏结与修复而受到广大科技工作者的追捧。贻贝仿生黏附材料的外在形式主要包括膜状、海绵状和水凝胶状，由于水凝胶状材料具有亲水的聚合物网络，与细胞所处正常生理环境相似，颇受组织和细胞亲睐，因此，水凝胶状的贻贝仿生黏附材料的研究最为集中也最为广泛。
理想的生物黏附材料既要满足一般黏附材料的黏附性能要求，又要面对生物医学应用中的特殊需求：良好的生物相容性，优异的生物诱导作用和严苛的使用环境(例如干/湿条件下的不同界面)。近年来，人们为解决当前各种合成高分子类生物黏附材料存在的诸多问题(例如生物相容性不够，润湿条件下黏附性能不够理想，生物诱导作用欠缺等)，逐步将研究工作聚焦于生物的黏附行为，以期从仿生的角度来实现这一目标，贻贝就是这类生物的典型代表。贻贝是一种大量生长在海洋及沿海地区的软体动物，通过分泌贻贝黏附蛋白(MAPs)可以在潮湿的环境中与基体材料表面形成很强的相互作用，其氨基酸序列中含有近30％的L-多巴和15％的赖氨酸残基。尽管从贻贝中直接提取MAPs或者采用基因重组技术来制备重组贻贝黏附蛋白在科学研究中也取得了较为不错的成绩，但是存在提取过程繁琐、成本较高、产率不足的固有局限，因此，采用高分子仿生的方法合成含有仿贻贝黏附蛋白功能元(3,4-二羟基***，多巴胺，Dopamine)的贻贝仿生黏附材料成为当前研究的热点。王尧等利用四臂聚乙二醇为主体分子，在其结构中通过偶联反应引入多巴胺以及双硫键，合成了端基功能化的基于PEG的凝胶因子(PEG-多巴胺)贻贝仿生黏附性水凝胶(王尧等.基于PEG-DOPA的可降解水凝胶的制备与性质[J].高分子通报，2014，8：84-89)；张峰等通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)将多巴胺的自由氨基通过酰胺键接枝到聚丙烯酸酯上，制备了含多巴胺的贻贝仿生聚丙烯酸酯黏附材料，多巴胺的引入大幅提升了丙烯酸酯的黏附性和亲水性(张峰等.多巴胺改性聚丙烯酸酯的合成及性能研究[J].材料研究与应用，2010，4(4)：711-715)；亦有报道，采用EDC将多巴胺与含羧基的聚氨酯结合制备含多巴胺的贻贝仿生聚氨酯黏附材料，其对金属的黏附强度提高了30％左右，并可与价格昂贵的贻贝黏附蛋白相媲美(孙培育等.含多巴胺的贻贝仿生聚氨酯[J].高分子学报，2009，8：803-808)；更有将多巴胺与胺化或羧基化的聚异丙基丙烯酰胺和聚乙烯醇等高聚物仅通过非共价键结合，制备基于合成高分子的贻贝仿生黏附膜材料，考察其对各类蛋白质和细胞的黏附能力(ZhangY,etal.Assemblyofpoly(dopamine)/poly(N-isopropylacrylamide)mixedfilmsandtheirtemperature-dependentinteractionwithproteins,Liposomes,andCells[J].Langmuir,2013,29(32):10213-10222)。但是这些合成高分子隶属于生物惰性组分，在终产物的生物诱导作用和生物相容性方面，仍不尽如人意。
随着贻贝仿生黏附材料的不断发展，人们对贻贝仿生生物黏附材料的要求不再局限于黏附性能，逐步加大了对生物诱导作用的重视。有报道将丝素通过碳化二亚胺盐酸盐与L-多巴通过共价键结合的方式偶联起来，以期获得兼具生物相容性和黏附作用的贻贝仿生黏附膜材料(高动动.多巴仿生粘附材料的制备及其应用[D].2013，东华大学，硕士毕业论文)；Lee课题组将牛血清蛋白通过多巴胺引入到了钛合金基底材料表面，制备了具有较好生物矿化表面的贻贝仿生钛合金功能膜黏附材料(RyuJ.B.,etal.Mussel-inspiredpolydopaminecoatingasauniversalroutetohydroxyapatitecrystallization[J].AdvancedFunctionalMaterials,2010,20(13):2132-2139)；Chen等将壳聚糖等通过自然涂覆的方式引入到了预先浸润了多巴胺溶液的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)膜表面，制备了具有良好成骨诱导生长作用的贻贝仿生PLGA黏附膜材料，但是该研究限于膜材料方向，且合成高分子PLGA为膜材料主体(ChenG,etal.EffectsofsurfacefunctionalizationofPLGAmembranesforguidedboneregenerationonproliferationandbehaviorofosteoblasts[J].JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,2013,101(1):44-53)；杨茜将多巴胺与胶原的降解产物明胶通过偶联剂化学键合，制备了基于多巴胺修饰的明胶基黏附材料，并将之用于植入金属材料表面的细胞黏附与生长，但明胶的生物活性已被大量证实远不如胶原(杨茜.多巴结构用于材料表面的仿生修饰及其生物学基础研究[D].2014，吉林大学，博士毕业论文)。
综上所述，当前专利文献或非专利文献多局限于合成高分子与多巴胺的相互作用，终产物生物诱导作用有限，在生物活性天然高分子的贻贝仿生设计上不尽如人意，尤其是在胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法方面尚未见诸报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法。该方法不仅使所制备的贻贝仿生黏附性水凝胶相对于从贻贝足丝中提取的黏附蛋白价格更低，而且兼具胶原优异的生物活性。不仅开发了新的仿生黏附性水凝胶材料，而且为淡水鱼胶原的高值转化开辟了新的领域。本发明所制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，其化学组成主要为淡水鱼胶原、多巴胺和交联剂，其中淡水鱼胶原为100份，多巴胺为1～20份，交联剂为1～10份。优选地，淡水鱼胶原为100份，多巴胺为2～12份，交联剂为5～9份。进一步的优选，淡水鱼胶原为100份，多巴胺为10份，交联剂为8份。该水凝胶材料外观为浅灰色或黑色凝胶体，无肉眼可见之杂质，凝胶pH值为6～8，黏接强度为0.05～2.0MPa，平均孔隙率为60～90％，细胞毒性不大于0级。
具体地，本发明的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的制备方法如下所述：
(1)按照常规的“酸-酶结合法”从淡水鱼皮或鱼鳞中提取未变性淡水鱼胶原，经盐析、离心、分离、酸溶、透析后冷冻干燥得到海绵状未变性淡水鱼胶原；
(2)将所提未变性胶原溶于稀酸溶液中，得到一定浓度的胶原溶液，通过低温调节pH后，再将配制好的多巴胺溶液按照一定比例加入所述胶原溶液中；
(3)择机加入交联剂，通过调控凝胶化过程、充分水洗、透析、辐照灭菌后即可制备出胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
上述步骤(1)中所述的淡水鱼胶原的原料鱼种类涵盖常见的七大家鱼(例如青鱼、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼、团头鲂)，但不排除其它种类的淡水鱼品种。
上述步骤(1)中所述的提取未变性淡水鱼胶原的“酸-酶结合法”中，酸的种类包括乙酸、柠檬酸，酸的浓度范围为0.1～0.5M/L，酶为胃蛋白酶，酶的用量为底物干基质量的0.5～2.0％，整个提取过程的温度控制在0～4℃，提取得到的胶原分子量约为30万道尔顿，经SDS-PAGE检测可观察到典型的α1、α2和β、γ条带。
上述步骤(2)中所述的稀酸溶液为乙酸，浓度为0.1～0.5M/L；胶原溶液的浓度为5～20mg/mL；调节pH的温度条件不高于10℃，调节pH后的胶原溶液pH为6～8；多巴胺溶液的浓度为1～20mg/mL，其中多巴胺与胶原的质量百分比为1～20％，反应时间为1～4h。
上述步骤(3)中所述的交联剂为氧化海藻酸钠、植物单宁、京尼平中的任一种，交联剂的用量为胶原干基重量的1～10％，交联剂加入的时机可以为凝胶化过程之前、凝胶化过程中或凝胶化过程之后的任一阶段，优选地，交联剂的加入时机为凝胶化过程中，凝胶化过程的调控主要通过控制溶液的pH值、温度和时间来实现，其中pH值范围为7.0～8.0，温度为35～42℃，时间为1～12h；辐照剂量为10～30kGy。
实施本发明的产品的具体技术方案如下所述：
一种利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，通过下述步骤制备得到：
按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺1～20份；
交联剂1～10份；
制备步骤为：
(1)未变性淡水鱼胶原的制备：
将新鲜淡水鱼皮或鱼鳞在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分；用10％的异丙醇搅拌4h脱除脂肪成分；在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的0.5％，在10000r/min离心10min，取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的淡水鱼鱼皮胶原；其分子量为30万道尔顿，经SDS-PAGE检测可观察到典型的α1、α2和β、γ条带；
(2)胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的制备：
按配方量将未变性的淡水鱼胶原溶于0.1～0.5M/L的稀乙酸中，得到浓度为5～20mg/mL的胶原溶液，随后在不高于10℃的条件下，调节胶原溶液的pH至6～8，再按配方量将配制好的浓度为1～20mg/mL的多巴胺溶液按照胶原干重的1～20％加入到所述的胶原溶液中，反应1～4h后，按配方量加入所述的交联剂，所述交联剂的用量为胶原干重的1～10％，调控凝胶化过程，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后利用10～30kGy的伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
其中所述交联剂选自氧化海藻酸钠、植物单宁、京尼平中的一种。
本发明的优选方案之一是，利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺2～12份；
交联剂5～9份。
本发明的优选方案之二是，利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺10份；
交联剂8份。
所述交联剂的加入时机为凝胶化过程之前或凝胶化过程中或凝胶化过程之后的任一阶段，优选加入时机为凝胶化过程中。
申请人提供了一种利用淡水鱼胶原制备胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的方法，包括下列步骤：
按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺1～20份；
交联剂1～10份；
制备步骤如下：
(1)未变性淡水鱼胶原的制备：
将新鲜淡水鱼皮或鱼鳞在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分；用10％的异丙醇搅拌4h脱除脂肪成分；在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的0.5％，在10000r/min离心10min，取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的淡水鱼鱼皮胶原；其分子量为30万道尔顿，经SDS-PAGE检测可观察到典型的α1、α2和β、γ条带；
(2)胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的制备：
按配方量将未变性的淡水鱼胶原溶于0.1～0.5M/L的稀乙酸中，得到浓度为5～20mg/mL的胶原溶液，随后在不高于10℃的条件下，调节胶原溶液的pH至6～8，再按配方量将配制好的浓度为1～20mg/mL的多巴胺溶液按照胶原干重的1～20％加入到所述的胶原溶液中，反应1～4h后，按配方量加入所述的交联剂，所述交联剂的用量为胶原干重的1～10％，调控凝胶化过程，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后利用10～30kGy的伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
上述制备方法中所述交联剂选自氧化海藻酸钠、植物单宁、京尼平中的一种。
上述制备方法中所述交联剂的加入时机为凝胶化过程之前或凝胶化过程中或凝胶化过程之后的任一阶段。优选地，交联剂的加入时机为凝胶化过程中。
本发明的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶可作为生物医学领域仿生材料的应用。
本发明所制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶是通过化学键作用将胶原与多巴胺进行结合的，形成的凝胶体系中避免了胶原与多巴胺组分的相分离，终产物水凝胶的黏结强度为0.05～2.0MPa；所制备的水凝胶兼具贻贝蛋白独特的黏附能力和胶原优异的生物活性，可因模具变化以各种形体广泛应用于外伤、手术和整形等导致的皮肤、肌肉等损伤处的黏结与修复。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶与传统的合成高分子黏附性水凝胶相比，具有优异的黏附能力、生物诱导作用和可生物降解性。
2、本发明交联剂的加入改善了水凝胶的力学性能，同时，与传统胶原水凝胶采用的戊二醛或碳化二亚胺交联剂相比，本发明所用的交联剂属于生物型交联剂，避免了传统化学交联剂(戊二醛或碳化二亚胺)从源头上引入的潜在生物毒性。
3、与从天然贻贝中直接提取贻贝黏附蛋白相比，本发明所用的原料来源广泛，所得产品的成本相对更低。
4、与采用基因工程生物合成贻贝黏附蛋白相比，本发明工艺相对简单、成熟、易于操作控制和规模化生产。
5、本发明工艺可通过调控反应物用量以及凝胶化过程，使产品具有可调控的黏附性能。
表1本发明制备得到的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的一组性能表征结果
附图说明
图1：为本发明制备得到的一组胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶材料(柱状形体)。
图2：为本发明制备得到的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的一组弹性模量测定结果。
图3：为本发明制备得到的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的一组黏性模量测定结果。
图4：为本发明制备得到的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的一组损耗因子测定结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护的范畴。
实施例1
将新鲜草鱼皮在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分。接着用10％的异丙醇搅拌4h脱除脂肪成分。接着在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的0.5％，10000r/min离心10min取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的草鱼皮胶原。
采用0.1M/L的乙酸溶解未变性的草鱼皮胶原(5mg/mL)，在0℃下调节胶原溶液pH值至7.0，随后加入20mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的20％，充分搅拌均匀，反应1h。
加入胶原干重10％的氧化海藻酸钠反应4h后调节pH值至7.5，置于37℃烘箱中恒温4h，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在10kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
实施例2
将新鲜鲢鱼(例如花鲢，俗称胖头鱼或白鲢)皮在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分。接着用10％的丙酮搅拌4h脱除脂肪成分。接着在0.2M的柠檬酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的1.0％，10000r/min离心10min取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的鲢鱼皮胶原。
采用0.2M/L的乙酸溶解未变性的鲢鱼皮胶原(10mg/mL)，在4℃下调节胶原溶液pH值至6.0，随后加入10mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的10％，充分搅拌均匀，反应3h。
加入胶原干重8％的植物单宁后立即调节pH值至7.0，置于37℃烘箱中恒温4h，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在15kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
实施例3
将新鲜鲫鱼皮在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分。接着用10％的丙酮搅拌4h脱除脂肪成分。接着在0.2M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的1.5％，10000r/min离心10min取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的鲫鱼皮胶原。
采用0.5M/L的乙酸溶解未变性的鲫鱼皮胶原(15mg/mL)，在4℃下调节胶原溶液pH值至7.5，随后加入15mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的15％，充分搅拌均匀，反应3h。
调节上述体系pH值至8.0，置于37℃烘箱中恒温4h，期间缓慢加入胶原干重10％的京尼平进行交联，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在20kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
实施例4
将新鲜鳙鱼皮在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分。接着用10％的异丙醇搅拌4h脱除脂肪成分。随后在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的2.0％，10000r/min离心10min取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的鳙鱼皮胶原。
采用0.2M/L的乙酸溶解未变性的鳙鱼皮胶原(5mg/mL)，在0℃下调节胶原溶液pH值至8.0，随后加入10mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的20％，充分搅拌均匀，反应4h。
将上述体系置于37℃烘箱中恒温4h，期间缓慢加入胶原干重8％的氧化海藻酸钠进行交联，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在30kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
实施例5
将新鲜青鱼鳞清洗干净，在料液比为1：20的0.05M的Na2CO3溶液中处理12h，以疏松鱼鳞结构；并在0.2M的HCl溶液中浸泡12h脱钙，在0.05M的NaOH溶液中浸泡8h脱除脂肪成分；接着在0.2M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的1.5％，10000r/min离心10min取上清液，用NaOH调pH至中性，用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的青鱼鳞胶原。
采用0.5M/L的乙酸溶解未变性的青鱼鳞胶原(10mg/mL)，在4℃下调节胶原溶液pH值至7.0，随后加入15mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的10％，充分搅拌均匀，反应4h。
将上述体系置于42℃烘箱中恒温1h，随后加入胶原干重5％的氧化海藻酸钠反应4h，充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在20kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
实施例6
将新鲜鲤鱼鳞清洗干净，在料液比为1：20的0.05M的Na2CO3溶液中处理12h，以疏松鱼鳞结构；并在0.2M的HCl溶液中浸泡12h脱钙，在0.05M的NaOH溶液中浸泡8h脱除脂肪成分；接着在0.1M的柠檬酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的1.0％，10000r/min离心10min取上清液，用NaOH调pH至中性，用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在0℃下进行，即得未变性的鲤鱼鳞胶原。
采用0.5M/L的乙酸溶解未变性的鲤鱼鳞胶原(15mg/mL)，在4℃下调节胶原溶液pH值至7.0，随后加入10mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的10％，充分搅拌均匀，反应2h。
将上述体系置于35℃烘箱中恒温4h，随后加入胶原干重8％的京尼平反应4h，充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在25kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
实施例7
将新鲜鲂鱼鳞清洗干净，在料液比为1：20的0.05M的Na2CO3溶液中处理12h，以疏松鱼鳞结构；并在0.2M的HCl溶液中浸泡12h脱钙，在0.05M的NaOH溶液中浸泡8h脱除脂肪成分；接着在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的2.0％，10000r/min离心10min取上清液，用NaOH调pH至中性，用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的鲂鱼鳞胶原。
采用0.5M/L的乙酸溶解未变性的鲂鱼鳞胶原(20mg/mL)，在10℃下调节胶原溶液pH值至6.0，随后加入1mg/mL的多巴胺溶液，其中多巴胺用量为胶原质量的1％，充分搅拌均匀，反应4h。
将上述体系调节pH至8.0，置于37℃烘箱中恒温12h，随后加入胶原干重1％的京尼平反应4h，充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后在30kGy强度下伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。

Claims (10)

1.一种利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，其特征在于所述的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶通过下述步骤制备得到：
按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺1～20份；
交联剂1～10份；
(1)未变性淡水鱼胶原的制备：
将新鲜淡水鱼皮或鱼鳞在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分；用10％的异丙醇搅拌4h脱除脂肪成分；在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的0.5％，在10000r/min离心10min，取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的淡水鱼鱼皮胶原；其分子量为30万道尔顿，经SDS-PAGE检测可观察到典型的α1、α2和β、γ条带；
(2)胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的制备：
按配方量将未变性的淡水鱼胶原溶于0.1～0.5M/L的稀乙酸中，得到浓度为5～20mg/mL的胶原溶液，随后在不高于10℃的条件下，调节胶原溶液的pH至6～8，再按配方量将配制好的浓度为1～20mg/mL的多巴胺溶液按照胶原干重的1～20％加入到所述的胶原溶液中，反应1～4h后，按配方量加入所述的交联剂，所述交联剂的用量为胶原干重的1～10％，调控凝胶化过程，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后利用10～30kGy的伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
2.如权利要求1所述的利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，其特征在于，所述交联剂选自氧化海藻酸钠、植物单宁、京尼平中的一种。
3.如权利要求1所述的利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，其特征在于：按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺2～12份；
交联剂5～9份。
4.如权利要求1所述的利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，其特征在于：按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺10份；
交联剂8份。
5.如权利要求1所述的一种利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶，其特征在于：所述交联剂的加入时机为凝胶化过程之前或凝胶化过程中或凝胶化过程之后的任一阶段，优选加入时机为凝胶化过程中。
6.一种利用淡水鱼胶原制备胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的方法，其特征在于：包括下列步骤：
按重量计的原料配比如下：
未变性淡水鱼胶原100份；
多巴胺1～20份；
交联剂1～10份；
(1)未变性淡水鱼胶原的制备：
将新鲜淡水鱼皮或鱼鳞在20±1℃下清洗干净后捣碎，在料液比为1：25的0.01M的NaOH溶液中处理24h，以除去非胶原成分；用10％的异丙醇搅拌4h脱除脂肪成分；在0.5M的乙酸溶液中进行胃蛋白酶水解，胃蛋白酶用量为底物干基质量的0.5％，在10000r/min离心10min，取上清液，先用NaOH调pH至中性，再用(NH4)2SO4盐析，再在0.1M/L的Na2HPO4溶液中透析，冻干，整个提取过程保持在4℃下进行，即得未变性的淡水鱼鱼皮胶原；其分子量为30万道尔顿，经SDS-PAGE检测可观察到典型的α1、α2和β、γ条带；
(2)胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的制备：
按配方量将未变性的淡水鱼胶原溶于0.1～0.5M/L的稀乙酸中，得到浓度为5～20mg/mL的胶原溶液，随后在不高于10℃的条件下，调节胶原溶液的pH至6～8，再按配方量将配制好的浓度为1～20mg/mL的多巴胺溶液按照胶原干重的1～20％加入到所述的胶原溶液中，反应1～4h后，按配方量加入所述的交联剂，所述交联剂的用量为胶原干重的1～10％，调控凝胶化过程，随后充分水洗，在3800截留分子量的透析袋中透析24h后置于0.9％的生理盐水包装袋中，最后利用10～30kGy的伽马射线辐照灭菌即得到胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶。
7.如权利要求6所述的一种利用淡水鱼胶原制备胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的方法，其特征在于：所述交联剂选自氧化海藻酸钠、植物单宁、京尼平中的一种。
8.如权利要求6所述的一种利用淡水鱼胶原制备胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的方法，其特征在于：所述交联剂的加入时机为凝胶化过程之前或凝胶化过程中或凝胶化过程之后的任一阶段。
9.如权利要求6或8所述的一种利用淡水鱼胶原制备胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的方法，其特征在于：所述交联剂的加入时机为凝胶化过程中。
10.权利要求1～5任一项所述的一种利用淡水鱼胶原制备的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶的用途，其特征在于：所述的胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶作为生物医学仿生材料的应用。
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