CN105452482B - 用于对全基因组进行快速作图的纳米流体装置以及相关的分析***和方法 - Google Patents

用于对全基因组进行快速作图的纳米流体装置以及相关的分析***和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生成从全细胞、细胞核、全染色体或长DNA分子的其它来源中所提取的基因组DNA的有序限制性图谱的装置和方法。这些装置具有合并入反应纳米通道中的流体微通道，该反应纳米通道在其之间纳米通道直径的大小减小50％至99％之间的界面处合并入检测纳米通道中。将完整的DNA分子输送至反应纳米通道，然后在反应纳米通道中利用限制性核酸内切酶将完整的DNA分子加以片段化。反应纳米通道的尺寸和构造被设计成使得片段保持原来的顺序直到将它们注入检测纳米通道中。对在沿检测纳米通道的一个或多个位置处的信号进行检测，从而按它们沿长DNA分子所出现的顺序对片段进行作图。

Description

用于对全基因组进行快速作图的纳米流体装置以及相关的分 析***和方法
相关申请
本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请序列号61/778,746的优先权，该临时专利申请的内容以参考的方式并入本文中，如同在本文的全文中叙述一样。
关于联邦政府资助的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院所给予的资助号为HG002647的政府支持下完成。美国政府在本发明中具有某些权利。
技术领域
本发明涉及多核酸的基因组特征分析。
背景技术
近来，业界对于将纳米尺度部件并入芯片实验室流体装置中已产生相当大的兴趣。该兴趣的起因在于在从微米尺度转变到纳米尺度中的若干优点(和可有利地所实现的差异)。这些差异包括例如：双层重叠(DLO)及其对电渗和电荷选择透过性的影响、电场的局部增强、较高的表面积-体积比、对大的合成和生物聚合物的限制效应、和熵效应的新出现的重要性。参见例如Yuan等人，Electrophoresis(电泳)2007，28，595-610；Schoch等人，Rev.Mod.Phys.2008，80，839-883；和Kovarik等人，Anal.Chem.2009，81，7133-7140。纳米尺度装置的以往例子包括将多孔介质和凝胶使用于色谱分离和具有纳米尺度孔的滤膜。参见例如Lerman等人，Biopolymers，1982，21，995-997；和Tong等人，M。Nano Lett.2004，4，283-287。然而，近来的研究工作集中于用于流体和分析物输送工程几何界限明确的管道以及将它们无缝隙地并入装置中。参见例如Volkmuth等人，Nature1992，358，600-602；和Striemer等人，Nature2007，445，749-753。这种规则结构的优点是在其内部的压力和场梯度、流体流动、和分子运动的相对简单性，相比之下这些特性具有更曲折的网络。例如，限定、表征及容易地建模这些***的能力可以允许更好地理解分离机制和单分子物理学。参见例如Volkmuth等人，Nature1992，358，600-602；Reisner等人，Phys.Rev.Lett.2005，94，196101；和Salieb-Beugelaar等人，Lab chip，2009，9，2508-2523。
最近，FIB铣削技术已被描述成用于形成纳米流体装置。参见Menard等人，《在绝缘基材中利用聚焦离子束铣削制作亚5nm纳米通道》，Nano Lett.2011，11，512-517(于2010年12月20日发表)；和于2010年9月21日提交的名称为“用于形成纳米通道的方法、***和装置”的美国临时专利申请序列号61/384,738(和相关的PCT申请PCT/US2011/052127)，这些文献的内容以参考的方式并入本文中如同在本文的全文中的叙述。除了FIB铣削外，也可以采用适合于制作纳米通道的多种其它方法，包括例如电子束光刻、纳米压印平板印刷、光刻、模板法或模压成型方案、以及本领域技术人员所了解的其它方法。
已有人提出了一些纳米流体装置，包括具有用于单分子感测和/或核酸测序的整体式微型电极(纳米或微米尺度)的装置。可替代地，由整个流体部件所构成的整体式装置可以提供对单分子输送和检测的更大控制。参见Menard等人，《一种用于在单个双链DNA分子中执行侧向电导率测量的装置》，ACSNano2012，12，9087-9094(于2012年9月5日发表)；2011年9月12日提交(和相应的正在审批的PCT/US13/054128)的名称为“具有与流体感测纳米通道相交的流体输送纳米通道的装置及相关方法”的美国临时专利序列号61/533,523；和2013年2月28日提交的名称为“用于大分子的受控制的捕获、捕集和输送的具有整体式部件的纳米流体装置及相关的分析方法”的美国临时专利序列号61/770,586，这些文献的内容以参考的方式并入本文中如同在本文全文中的叙述。将部件并入到单个整体装置上可以使满足目前在例如DNA测序和医疗诊断领域中的分析需求的新方法和***成为可能。
发明内容
本发明的实施例提供使染色体DNA的高通量限制性酶切作图简单化的装置。
本发明的实施例包括纳米流体分析***。这些***包括：(a)长度在500μm和10cm之间并且在检测纳米通道的尺寸相对于反应纳米通道减小的界面位置处合并入检测纳米通道中的反应纳米通道；(b)与反应纳米通道的进入部连接的微流体通道；(c)与微流体通道连接的第一电极；(d)在与反应纳米通道进入部间隔但与其接近的位置从反应纳米通道延伸并且与其流体连通的第一横向流体通道；(e)与第一横向流体通道连接的第二电极；(f)从位于第一横向流体通道下游位置的反应纳米通道延伸并且与其流体连通的第二横向流体通道；(g)与第二横向流体通道连接的第三电极；(h)与检测纳米通道连接的第四电极；(i)用于控制第一、第二、第三和第四电极的操作从而可控制地在防止片段无序化(例如，使DNA在反应纳米通道中反应从而产生有序片段)的反应纳米通道内部引导、加载和消化DNA的电路；和(j)与构造成空间上且时间上确定片段大小由此能够实时或近实时地生成染色体DNA的有序限制性图谱的检测纳米通道连接的电或光检测器。
微流体通道可以包括构造成部分地堵塞微流体流道的相互间隔的柱的阵列。
所述***可以包括将微流体通道与流体输送纳米通道进入部连接的纳米漏斗。
纳米流体反应通道可以具有含有由“U”形段所连接的多个紧密相隔的大体平行段的蜿蜒形状。
可以将微流体通道、反应纳米通道、检测纳米通道及第一和第二流体横向通道整体地并入到流体芯片上。
第一和/或第二横向流体通道可以是具有在大约1nm和大约100nm之间的深度、及在大约20nm和大约2000nm之间的宽度的流体纳米通道。
与检测纳米通道相比，反应纳米通道的长度可以大10和1000倍之间并且深度和/或宽度大2和10倍之间。
微流体通道可以与一个或多个贮存池流体连通，至少一个贮存池包含用于DNA分析的全细胞。
用于分析的全细胞可以被用于基因组DNA提取的凝胶基质所限定。
用于分析的全细胞可以被至少一个高和/或低密度柱阵列限定在微流体通道中，以便于基因组DNA的提取。
微流体进入通道包含具有DNA的全细胞。第二横向流体通道在远离反应纳米通道的一个端部合并入第二流体贮存池中。第二流体贮存池容纳限制性内切酶和辅助因子的溶液。
反应纳米通道可以是直的，并且可以具有在大约500μm至大约2cm之间的长度。与检测纳米通道相比，反应纳米通道的长度大出大约10和大约1000倍之间并且深度和/或宽度大出大约2和大约10倍之间。
所述***可包括第二反应纳米通道，该通道与在第二反应纳米通道上的入口端上的流体微通道流体连通并且在第二反应纳米通道的相反的外出端处合并入各自的第二检测纳米通道中。
其它实施例涉及纳米流体分析芯片。这些芯片包括：(a)适合于利用具有柱阵列的微流体通道从全细胞、细胞核、全染色体或者长DNA分子的其它来源中提取基因组DNA的微流体入口；(b)长度在500μm和10cm之间的反应纳米通道，该反应纳米通道具有连接到微流体入口的进入部；(c)在由纳米通道尺寸减小所限定的交汇处与反应纳米通道的外出端合并的检测纳米通道；(d)从与反应纳米通道的进入部间隔但与其接近的反应纳米通道流体连通的第一横向纳米通道；和(e)从位于第一横向流体纳米通道下游位置的反应纳米通道延伸并且与其流体连通的第二横向流体纳米通道。
芯片也可包括存在于反应纳米通道和微流体入口之间并且将这两者加以连接的纳米漏斗。
芯片可以包括多个贮存池，这些贮存池包括与微流体入口流体连通的至少一个贮存池、与第一横向纳米通道流体连通的至少一个贮存池、与第二横向纳米通道流体连通的至少一个贮存池、和与检测纳米通道的一端流体连通的至少一个贮存池。
微流体通道中的柱阵列可以包括轴向地相互间隔的阵列的多个段。
柱阵列可以构造成大体上延伸跨过微流体通道的整个宽度。
其它实施例涉及从全细胞、细胞核、全染色体或者长DNA分子的其它来源中生成基因组DNA的有序限制性图谱的方法。这些方法包括：(a)提供一种具有合并入反应纳米通道中的流体微通道的装置，该反应纳米微通道在其中纳米通道直径尺寸减小的界面处合并入检测纳米通道；(b)在微通道中使全细胞溶解并且使具有最小分段的DNA去染色质；然后(c)将完整的DNA分子导入反应纳米通道中；然后(d)在反应纳米通道中利用限制性内切酶将完整的DNA片段化。反应纳米通道的尺寸和构造被设计成使得片段保持原来的顺序直到将它们注入检测纳米通道中。所述方法还包括：(e)在沿检测纳米通道的一个或多个位置检测信号，以便按片段沿长DNA分子的顺序对片段进行作图。
所述装置可以包括与合并入反应纳米通道中的流体微通道流体连通的至少一个贮存池。可以通过利用贮存池导入用于分析的细胞、细胞核、全染色体、或者长DNA分子的其它来源，而实施导入步骤。所述方法也可以包括提供用于将全细胞固定的凝胶基质和/或高密度柱阵列，然后使细胞溶解，提取出DNA，以及可选地将DNA染色，然后将完整的DNA分子导入反应纳米通道中。
所述装置可以包括与反应纳米通道的入口端流体连通的具有柱阵列的微流体通道、和与位于微流体通道下游位置的反应通道流体连通的第一横向通道。
所述方法可以包括：通过将电压施加到微流体和横向通道以便在反应纳米通道的进入区域处产生偏压而引导和加载样品。
可以利用在接近反应通道入口处的受控制的电压或浓度极化梯度而实施引导步骤，使得最初DNA分子不经受超过DNA拉伸强度的应变并且不发生机械断裂。
在引导步骤之后，可以通过改变施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便以在大约1μm/s和大约1mm/s之间的速率将全部DNA分子拉入反应纳米通道中而实施加载，使得DNA分子的尾端具有充分的时间扩散地从任何柱的缠结分离并且避免机械断裂。
可以通过改变施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便将限制性内切酶和辅助因子导入反应纳米通道中所含有的DNA而实施限制性消化的反应，然后允许反应进行直到所有限制性位点已经被消化。
施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压可以抑制或防止将限制性内切酶和辅助因子导入微流体通道中并因此防止在反应纳米通道外部的DNA分子的消化。
可以通过改变施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便驱动片段迁移到在反应纳米通道与检测纳米通道之间的界面，而实施有序限制性片段的检测。
在一些实施例中，可以利用连续施加的恒定电压来实现对限制性片段的引导、加载、限制性消化、和有序检测。
与反应纳米通道相比，检测纳米通道直径的尺寸可以减小50％至99％之间，由此导致当各片段到达交汇处时输送速率的增加和各相邻片段的分离。然后可以实施检测步骤，以便对经过检测纳米通道的分离片段的输送进行检测。
可以通过用光学或电学的方法在沿检测纳米通道的一个或多个位置对片段进行检测，而实施检测步骤。
所述方法可以包括：通过对检测信号的持续时间或积分幅度进行检测而确定片段大小。
所述装置可以是流体分析芯片。
该芯片可以结合与芯片连接的输送***而使用，其中输送***构造成施加电动力学、压力或向心力中的至少一种从而将基因组DNA及其片段经过反应纳米通道输送进入检测纳米通道。
本发明的其它实施例涉及用于与流体分析芯片相互作用的方法。这些方法包括：(a)控制进样、细胞溶解、及DNA提取和染色；(b)引导DNA并且将所提取的DNA加载入反应纳米通道中，在反应纳米通道中利用限制性内切酶和辅助因子进行限制性消化，和经过检测纳米通道的限制性片段的有序输送；(c)在经过检测纳米通道的输送期间，用电子方法检测限制性片段；(d)实时或近实时地用电子方法分析来自DNA分子的限制性片段大小；和(e)用电子方法从多个DNA分子中生成共有性限制性图谱，并且评定图谱质量以评估是否需要补充的取样。
本发明的其它方面涉及用于与流体分析芯片相互作用的***。这些***包括：(a)用于控制进样、细胞溶解、及DNA提取和染色的装置；(b)用于控制DNA引导和加载入反应纳米通道、在反应纳米通道中使用限制性内切酶和辅助因子的限制性消化、和经过检测纳米通道的限制性片段的有序输送的装置；(c)用于在经过检测纳米通道输送期间检测限制性片段的装置；(c)利用实时或近实时分析对来自DNA分子的限制性片段大小进行分析的装置；和(e)用于从多个DNA分子中生成共有性限制性图谱，并且评定图谱质量以评估是否需要进行补充取样的装置。
本发明的其它实施例涉及流体分析装置。这些装置包括：具有合并入反应纳米通道中的流道的微流体通道；与位于反应纳米通道上游位置的微流体通道流体连通的DNA贮存池；与存在于接近反应纳米通道入口处的反应纳米通道流体连通的引导贮存池；连接到具有小于反应纳米通道的直径和/或宽度和深度的反应纳米通道的外出端的检测纳米通道；以及，与存在于接近检测纳米通道处的反应纳米通道流体连通的包含限制性内切酶和辅助因子的贮存池。
所述装置可可选地包括第二反应纳米通道，该通道的长度是在大约500μm和10cm之间，该通道与在第二横向流体纳米通道后面的第一反应纳米通道流体连通并且存在于第一反应纳米通道的下游位置。芯片可与选择性地引导来自第一反应纳米通道的限制性片段使其流体地进入废物出口路径或者流体地进入第二反应纳米通道的回路相连接。
芯片可包括一个废物出口路径和具有相关出口通道的多个收集贮存池，这些出口通道延伸至第二横向流体纳米通道的下游位置。芯片可以与选择性地引导来自第一反应纳米通道的限制性片段进入废物出口路径或者一个收集贮存池的回路相连接。
芯片可以包括第二反应纳米通道，该通道的长度是在500μm和10cm之间，该通道与在第二横向流体纳米通道后面的第一反应纳米通道流体连通并且存在于第一反应纳米通道的下游位置。芯片可以与选择性地引导来自第一反应纳米通道的限制性片段使其流体地进入废物出口路径或者流体地进入第二反应纳米通道的回路相连接。
芯片可以包括一个废物出口路径和具有相关出口通道的多个收集贮存池，这些出口通道延伸至第二横向流体纳米通道的下游位置。芯片可以与选择性地引导来自第一反应纳米通道限制性片段进入废物出口路径或一个收集贮存池的回路相连接。
所述方法可以包括：用电学或光学方法识别何时实时或近实时地对感兴趣区域进行作图、以及当对被作图的感兴趣区域进行检测时选择性地且自动地将限制性片段流体输送至第二纳米反应通道。
所述方法可以包括：用电学或光学方法识别何时实时或近实时地对感兴趣区域进行作图、以及自动地且选择性地将感兴趣的限制性片段流体地输送至各自的出口通道并进入各自的收集贮存池进行以后的分析并且将其它限制性片段流体地输送至废物出口通道。
应注意的是，可将在一个实施例中所描述的本发明的方面并入不同实施例中，尽管在这些不同实施例中未具体地描述。也就是说，可以以任意的方式和/或组合将所有实施例和/或任何实施例的特征加以组合。因此，本发明的申请人保留改变任何最初提交的权利要求和/或提交任何新权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求从而依赖于和/或并入任何其它权利要求的任何特征的权利，尽管最初未以这种方式提出要求。在下面所陈述的说明书中，详细地说明本发明的这些和其它目的和/或方面。当阅读附图和下面对选实施例的详细描述时，本领域技术人员将理解本发明的其它特征、优点和细节内容，该描述仅仅是本发明的例证。
附图说明
图1A是根据本发明实施例的流体分析装置的示意图。
图1B示出了根据本发明实施例的可以粘接到图1A中所示装置的盖板。
图1C示出了根据本发明一些实施例的可附接到图1B中所示装置的贮存池。
图2A-图2D示出根据本发明实施例的DNA提取的芯片上步骤。
图3A-图3C是装置的放大微流体部的示意图，图中示出了根据本发明实施例的全细胞的捕获、去染色质DNA的溶解和染色。
图4A是根据本发明实施例的具有通到纳米流体反应通道的样品入口的示例性图案的流体分析装置的示意图。
图4B是根据本发明一些实施例的具有与将样品DNA分子导入的共用微通道流体连通的多个反应纳米通道和各自的检测纳米通道的流体分析装置的示意图。
图5是根据本发明实施例的在微流体通道与纳米流体反应通道之间的界面的非常放大的“按比例绘制的”图示。
图6A-图6D是根据本发明实施例的附带示例性电压和操作顺序的流体分析装置的示意图。
图6E是根据本发明实施例的具有多点检测回路(而不是图6D的单点回路)的检测纳米通道的放大视图。
图6F是根据本发明替代实施例的、采用压力输送***而不是电压驱动***的、类似于图6A-图6E中所示装置的分析装置的示意图。
图6G是根据本发明实施例的、类似于图6A-图6F中所示装置的分析装置的示意图，该图中示意性地示出了任何合适的驱动(“D”)输送***或者各驱动输送***的组合的使用。
图7A-图7D是根据本发明实施例的、类似于图6A-图6D的附带示例性电压和操作顺序但具有替代的检测回路的流体分析装置的示意图。
图7E是根据本发明实施例的、具有多点检测回路(而不是图7D的单点回路)的检测纳米通道的放大视图。
图8是根据本发明实施例的、利用FIB铣削制造的原型流体装置的图像图解说明流体结构(放大的插图是在反应通道与检测纳米通道之间的交汇处)。
图9A是根据本发明实施例的反应纳米通道与用于导入Mg2+的纳米通道的交汇处的亮场光学图像。
图9B是根据本发明实施例的、图9A中所示装置的区域的差分图像，图中示出了在Mg2+离子的电压门控导入时的镁绿色荧光的增加。
图9C是根据本发明实施例的、图9A中所示装置的区域的差分图像，图中示出当施加开门电压但没有Mg2+存在于侧纳米通道中时镁绿色荧光中的微小变化。
图10A是显示反应纳米通道中的λ-DNA的扩散的一系列的荧光图像。
图10B是一系列的荧光图像，图像中示出了在Mg2+存在下利用限制性内切酶进行大约1.5分钟消化后可观察到三个片段。虽然片段具有高扩散性，但保持片段的顺序。
图11是一系列的画面的图像，这些画面示出了在400nm×400nm反应纳米通道中片段化且被注入200nm×200nm检测通道中的荧光染色的T4噬菌体DNA分子，其中在输送期间片段被空间上充分解析(下面的两个放大的画面c和d)。下面的插图示出了在反应通道与检测纳米通道段之间交错处的SEM图像。箭头表示时间。
图12是根据本发明实施例的用于染色体DNA的限制性酶切作图的***的示意图。
图13A是正在引导进入反应纳米通道中的DNA的光学检测的示意图。
图13B是正在引导进入反应纳米通道的DNA的电检测示意图。
图13C是用于DNA分子的引导、加载、反应和检测的代表性电压程序，其中触发是由引导检测回路和片段检测回路所启动。
图13D示出了其中输送驱动输入(例如，如电压和/或压力的力)是恒定的连续操作模式。
图14是根据本发明实施例的、可以实施而对DNA片段进行作图的示例性操作的流程图。
图15、图16、图18和图19是根据本发明实施例的具有多个串联布置的反应纳米通道的装置的示意图。
图17是根据本发明实施例的、例如可以利用图15、图16、图18和图19中所示装置在片段上实施的其它处理的流程图(通常是选择性的)。
图20是根据本发明实施例的用于补充的后继处理的限制性片段的选择性收集的流程图。
图21是根据本发明实施例的可以用于实施图20中所示方法的装置的一个实例。
具体实施方式
现在将在下文中参照其中揭示本发明实施例的附图来更充分地描述本发明。然而，本发明可具体化为许多不同形态，并且不应被理解成局限于本文中所陈述的实施例。在全部的附图中，相似的附图标记是指相似的元件。在附图中，为了清楚起见可将某些层、部件或特征放大，除非另有说明虚线表示可选的特征或操作。另外，除非另有具体说明，操作(或步骤)的顺序并不局限于附图和/或权利要求中所给出的顺序。在附图中，为了清楚起见可将线、层、特征、部件和/或区域的厚度放大，并且除非另有说明，虚线表示可选的特征或操作。
本文中使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，而并非意图限制本发明。本文中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”意图也包括复数形式，除非上下文中清楚地指出。还应当理解的是，本说明书中使用的术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(includes)”和/或“包含(including)”说明所陈述特征、区域、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但不排除一个或多个其它特征、区域、步骤、操作、元件、部件、和/或其群组的存在或添加。本文中使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任一个及全部组合。本文中使用的短语例如“在X和Y之间”以及“在大约X和Y之间”应当被解释为包括X和Y。本文中使用的短语例如“在大约X和Y之间”表示“在大约X和大约Y之间”。本文中使用的短语例如“从大约X到Y”表示“从大约X到大约Y”。
应当理解的是，当特征(例如层、区域或基材)被称为“在另一个特征或元件上”时，它可以直接地在其它特征或元件上或者也可存在介于中间的特征和/或元件。相反，当一个元件被称为“直接地在另一个特征或元件上”时，不存在介于中间的元件。也应理解的是，当一个特征或元件被称为“连接”、“附接”或“联接”到另一个特征或条件时，它可以直接地连接、附接或联接到其它元件或者可存在介于中间的元件。相反，当一个特征或元件被称为“直接地连接”、“直接地附接”或“直接地联接”到另一个元件时，不存在介于中间的元件。尽管在一个实施例中进行可描述或图示，但如此描述或图示的特征也可以适用于其它实施例。
除非另有规定，本文中使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的为相同的含义。还应当理解的是术语，例如常用的词典中所定义的术语，应当被解释为具有与它们在本申请上下文中和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度正式的方式进行解释，除非本文中明确地如此定义。为了简洁和/或清楚起见，对于众所周知的功能或构造不作详细描述。
本文中使用的空间相关术语，例如“在下方”、“在下面”、“下”、“在上面”、“上”等是为了便于描述附图中所示的一个元件或特征与另一个元件或特征的关系。应理解的是，这些空间相关术语意图包括除附图中所示方位以外的在使用或操作中的装置的不同方位。例如，如果将附图中的装置反转，元件被描述成“在其它元件或特征的下方或在下面”将会位于“在其它元件或特征的上面”。因此，示例性的术语“在下方”可以同时包括在上方和在下方的两种方位。所述装置可另外地取向(旋转90度或者在其它方位)并且本文中使用的空间相关述词也相应地解释。类似地，除非另有特别说明，本文中的术语“向上”、“向下”、“垂直的”、“水平的”等只是用于说明的目的。
应当理解的是，尽管本文中用术语第一、第二等来描述各种元件、部件、区域、层和/或部分，但这些元件、部件、区域、层和/或部分不应受这些术语的限制。这些术语只是用于将一个元件、部件、区域、层或部分与另一个区域、层或部分加以区别。因此，在不背离本发明教示的前提下，将下述的第一元件、部件、区域、层或部分可以称为第二元件、部件、区域、层或部分。
术语“纳米通道”是指具有处于纳米尺度的重要尺寸的通道或沟槽。纳米通道具有侧壁和底板。可以将该纳米通道形成入固体基材中，从而具有开放的上表面和封闭的下表面并且侧壁在上表面与下表面之间延伸。可利用盖板来密封或闭合纳米通道的上表面。术语“主要尺寸”是指宽度和/或深度尺寸。流体输送纳米通道的主要尺寸可以是在大约1nm至大约500nm之间。不同的纳米通道可以具有不同的主要尺寸。反应纳米通道的主要(也称为“重要”)尺寸可以是在大约300-400nm之间并且反应纳米通道可以是在大约10nm至大约300nm之间。
术语“大约”是指可以在+/-20％或不到之间变化例如+/-10％的参数。
术语“横向纳米通道”是指穿过各自的流体输送纳米通道的流体纳米通道。
术语“流体输送纳米通道”是指分析物从其中流动经过以便进行分析的纳米通道。在某些实施例中，流体输送纳米通道可以具有两个主要的区段：反应纳米通道和检测纳米通道。分析物可以是任何感兴趣的分析物，包括例如合成和生物大分子、纳米粒子、小分子、DNA、核酸/多核酸类、肽类、蛋白质类等的单个分析物分子。可以利用电动力学、浓度极化和/或液压(强制压力或者压力梯度)来实施经过纳米通道的输送。
术语“上游”表示更靠近流体输送纳米通道或反应通道入口的相对位置。术语“下游”表示更靠近流体输送纳米通道或反应通道出口的相对位置。
术语“浅的”是指具有小于输送纳米通道的深度并且小于分析物大分子的水力学尺寸的纳米通道深度。关于反应纳米通道的深度，浅纳米通道具有通常小至少2倍例如在2-100倍之间的深度。因此，例如浅的纳米通道段的深度可以是10nm以下通常在大约0.1nm和9nm之间，同时输送纳米通道可以具有为20nm或更多例如在20-100nm之间的深度(至少与浅段相邻)。
关于反应纳米通道20的术语“长”表示反应纳米通道的长度是在检测纳米通道40的10和1000倍之间。与检测纳米通道40相比，反应纳米通道20可以更长，并且深度和/或宽度在2和10倍之间。在一些实施例中，反应纳米通道20可以具有在大约500μm和10cm之间的长度。
术语“宽”表示纳米通道具有是合作而执行分析(例如，提供驱动电压)的输送纳米通道的宽度的至少2X(两倍，“X”表示“乘数”或“倍”)的宽度，通常是相邻的合作的反应纳米通道的宽度的3X-100X之间，例如3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、大约10X、大约20X、大约40X、大约50X、大约60X、大约70X、大约80X、大约90X、或者大约100X。
术语“电路”是指整个硬件实施例或者将软件与硬件组合的实施例。
关于柱的术语“高密度”表示阵列延伸跨过微通道的整个宽度并且将柱布置成具有以小于大约10μm的边缘-边缘间距。术语“低密度”表示将柱布置成具有通常大于大约50μm的边缘-边缘间距。
术语“低速”表示大分子以在大约1μm/s和大约1mm/s之间的速率移动经过纳米通道。
术语“显著不同的电场强度”表示流体输送纳米通道的一侧可以具有比相同通道的第二段大或小10倍-1000倍通常100倍-200倍的电压/cm的电场强度。
术语“引导”及其派生词表示最初将分析物分子导入反应纳米通道20中从而提供从在微通道或贮存池所实现的无规卷绕构型的大分子的线性化的步骤。术语“加载”表示将进入反应纳米通道20入口的存在于微通道或贮存池中的分析物分子以其整体和线性引导后构造成功地导入反应纳米通道中。
术语“反应”及其派生词表示利用限制性内切酶和可选的辅助因子将DNA片段化。因此，例如，在反应纳米通道内部的DNA的限制性消化防止片段无序化(例如，使DNA在产生有序片段的反应纳米通道反应)。例如，Mg2+是尤其适合于本发明实施例的II型类型的限制性内切酶的辅助因子。辅助因子带电荷的事实可以帮助第二横向通道32的电压门控。大部分的可获得的限制性内切酶为II型。其它类型(I型、III型、IV型)也是合适的，并且具有可以类似方式进行控制的不同的辅助因子(ATP、S-腺苷-L-甲硫氨酸)。因此，虽然是优选的，但本发明的实施例并不局限于含有Mg2+辅助因子的II型。
术语“尺寸”表示将片段拉入检测纳米通道中从而形成与相邻片段的分离以便通过检测电或光信号的持续时间或幅度来确定片段的大小。
术语“染色体DNA”表示DNA或者该DNA的一个片段的整个染色体的互补。
本发明的实施例涉及在纳米流体装置中的DNA的基因组作图。
图1A-图1C示出了示例性纳米流体分析装置10。在此实施例中，装置10可以是具有微通道15及纳米通道20、30、32和40的图案的芯片。图1B示出了可以附接到(通常粘接到)具有通道的图案基材12的盖11。图1C示出了可以将贮存池50或“R”附接到装置10。如图中所示，装置10包括连接到(长)反应纳米通道20的入口端的微流体通道15。不要求检测纳米通道40与反应通道20内联并且可以从反应纳米通道倾斜或延伸出。反应通道20的另一端在由尺寸(例如纳米通道的宽度/深度和/或直径)的减小所限定的界面I处合并入检测纳米通道40中。第一横向通道30从接近反应纳米通道(通常在纳米漏斗17(如果使用)和/或反应纳米通道15e的进入部下游的大约10-500μm内)的入口端的反应纳米通道20延伸。
第二横向通道32从位于第一横向通道30的下游位置且在界面I前的反应纳米通道20延伸。
在一些实施例中，一些纳米流体部件的整体一体化导致使用纳米流体装置10的从全细胞中所提取DNA的基因组水平图谱的快速生成。
一般来说，可以将全细胞的悬浮液导入在装置10上的微流体输入(一个或多个贮存池50)。使细胞溶解并且使DNA去染色质，并且在一些实施例中进行荧光染色。在一些实施例中，可以利用位于DNA提取元件和/或反应纳米通道的下游位置的微流体或纳米流体元件，在限制性消化之前将荧光染色导入完整的DNA中，或者在限制性消化之后导入有序片段。然后将染色体DNA导入长的反应纳米通道20，该纳米通道将分子延伸并且防止在后继步骤中所产生片段的扩散混合。然后将限制性内切酶和辅助因子的溶液导入反应纳米通道20，从而导致在序列特异性限制性位点的DNA的消化。然后，通过将反应纳米通道20中所含有的有序片段输送至其中将反应纳米通道20连接到检测纳米通道40的交汇处I，而对这些片段的长度进行分析。检测纳米通道40中的驱动输送的力(例如，静电、压力、或向心力)大于反应纳米通道20中的力，从而导致当各片段到达交汇处并且各片段与其相邻片段分离时输送速率的增加。利用成像或者单点或多点检测(电学或光学)在检测纳米通道40的下游位置对空间上且时间上分解的片段进行检测，并且对所获得的信号进行分析以确定片段大小。以这种方式，可以实时或近实时的生成染色体DNA的有序限制性图谱。由于操作***的带宽或者其它与分析有关的计算或时滞，术语“近实时”表示在实时的大约1分钟内的时间。
在本文中所描述的一些实施例中，主要地是利用在各种流体入口处所施加的电压以静电方式控制装置操作，但也可以使用本领域技术人员将会认可的其它力(例如，压力或向心力)。
装置制作
流体装置可以制作在多种基材上，包括硅、玻璃(二氧化硅)、石英、塑料、热塑性塑料、和弹性体或者其组合。图1A-图1C示出了示范性的装置制作工作流程。利用确立的方法(例如光刻以及湿法或干法蚀刻、模压成型、压印、或机械加工)，使由较大/较宽/较深的线所表示的便于DNA提取并且为装置的纳米流体元件提供界面微流体部件25图案化。可以利用多种方法(包括光刻、电子束光刻、或者纳米压印光刻接着进行蚀刻；聚焦离子束铣削；电子束铣削；模压成型；或压印)制作纳米流体元件20、30、32、40。一旦将流体元件制作在基材12的上表面上，可以将盖板11附接通常粘接到基材从而利用例如熔接、阳极连接、或使用胶膜的粘接在底部基材与盖板之间形成封闭的流体网络。可以经过穿过底部基材和/或顶部盖板的通孔而进入这些微通道。可以将贮存池50附着到在50v通孔上面的装置以便于液体处理。可以将电极50e***所有的或所选择的贮存池50中。贮存池50具有通孔50v。电极50e施加电压经过各种流体元件。空气或真空管线可以联接到贮存池或通孔以便向流体元件施加正压力或真空并且驱动压力驱动的流体流动。
DNA提取
在将细胞导入流体装置之前或期间将细胞包埋在凝胶介质中，或者将它们捕获在纳米或微米尺度的网络制作结构中，使得在很少或没有片段化的情况下从细胞中提取染色体DNA成为可能。作为一个例子，图2A-图2D中示出了用于细胞的操作的低熔点琼脂糖凝胶的使用。将在低熔点琼脂糖中的细胞导入微流体贮存池(图2A)然后将在琼脂糖仍然熔化时细胞推动到入口微流体通道中，使用注射泵将细胞从通道出口(图2B)中抽出。在后继的处理期间，让琼脂糖凝胶化，从而包埋并保护DNA。将溶液导入以便消化细胞壁(微生物的细胞和植物细胞)，然后用包含试剂(例如蛋白酶K)的洗涤剂溶液化学溶解细胞从而抑制天然核酸酶活性(图2C)。用缓冲液接着用嵌入染料的溶液彻底地清洗凝胶。将这些任务并入到芯片上使流率的精确控制成为可能并且消除可能会导致DNA切变的任何湍流。通过加热装置而使凝胶熔化(可通过添加酶琼胶酶而进一步破坏凝胶)并且用电泳法从基质中提取去染色质的DNA(图2D)。利用电渗流从装置的纳米流体区域中将不带电荷的琼脂糖排除。可以在DNA经过一个独立的入口微通道(未图示)遇到纳米流体通道之前，将限制性内切酶加入到DNA中。
这里所指出的琼脂糖包埋的替代方法包括：用微型化制造的高密度柱阵列16来捕集使用压力驱动流被导入装置中的细胞，溶解细胞，然后利用在柱阵列内部的缠结来捕获DNA(图3A-图3C)。图3A示出了全细胞的捕获。图3B示出了利用试剂的低流率和/或扩散混合的细胞的溶解和去染色质DNA的染色。图3C示出了利用所施加的电压从柱16的阵列中提取DNA。柱16可以是圆形的或者具有其它几何形状，通常没有锐利边缘。柱16可以具有与流体微通道15的深度相同的高度。这些柱可以具有在它们之间的小空间，从而允许解螺旋的长度的DNA在它们之间行进。在一些实施例中，柱16可以具有在大约1-10μm之间通常大约5μm的宽度，并且柱之间的间距大于或小于柱的宽度，通常在大约2-50μm之间，例如大约10μm。
微流体通道15c的多个流体输入15a的图案和贮存池50也可以用于进样和DNA提取，以便需要更多材料的分析(图4A)。
图4B示出了装置10可以包括来自单个微通道15的多个反应纳米通道流入的DNA以提高处理速度。尽管图示为并入各自的检测纳米通道401、402并且与各自的横向通道301、302、321、322连接的两个反应纳米通道201、202，但在单个芯片上可使用例如多于两个(例如在2-100之间)的输送纳米通道和相关的部件。
将长基因组DNA分子导入反应纳米通道
为了克服对DNA的限制基于熵的能障，可以将相当大的力施加于大的DNA分子上从而将它们导入纳米通道。在没有切变的情况下促进将DNA引导入反应纳米通道20中的方案包括：梯度结构的加入、和/或启动用于在引导后快速地降低电场强度的装置从而减小作用于分子的应力。作为一个例子，利用聚焦离子束(FIB)铣削，可以将具有逐渐减小的宽度和深度(纳米漏斗)的结构制作成起用于将DNA导入无缝接合纳米通道的管道的作用。对纳米漏斗的进一步描述可以参见美国临时专利申请序列号61/597,364和PCT/US2013/025078，这些专利的内容以参考的方式并入本文中如同在本文全文中的描述。在另一个例子中，可以将交叉的纳米流体元件用于获得对DNA输送的更大控制，如美国临时专利申请序列号61/770,586中所描述，这里专利文献的内容以参考的方式并入本文中如同在本文全文中的叙述。图5示出了将这两种技术并入单个装置中，连同促进DNA线性化的低密度的柱16的阵列。这些柱16可以以柱161-164的段或组的多个轴向相互间隔的阵列的方式而提供，尽管可以将相同或不同柱阵列尺寸和/或构造的较多或较少的段用于部分地堵塞行进路径并且推动DNA在相邻的柱之间行进。各柱段之间的轴向距离或间距可以是在20-200μm之间，通常为大约100μm。图5中所示的纳米通道20的高电场部分FH的长度决定了作用于分子的力并且是相对较短以便防止过度的应力作用于DNA。类似地，最后一排柱与纳米通道入口之间的距离为充分大使得可以在不将DNA拉紧的情况下执行DNA的最初引导。全部DNA分子的加载是以低速率进行，使得分子的尾端具有充分的时间扩散地从任何柱的缠结分离。然而，电场强度应足够高以便防止有助于去引导的扩散和熵反冲。图5中所示的微流体/纳米流体界面仅仅是可以设计成用于将DNA受控制地导入反应纳米通道的许多结构的一个例子。
限制性片段化和片段尺寸修改
图6A-图6E示出了导致有序限制性图谱的生成的在装置10的纳米流体通道20、30、32、40中所执行的示例性分析步骤，这些步骤开始于上述基因组DNA的引导和加载(图6A-图6B)。接着，将延伸的DNA分子限制性消化成片段(图6C)。将消化DNA分子的限制性核酸内切酶容纳在连接到图6C中的第二横向通道32(例如仅标记为“Mg2+”)的底部微通道中并且也可以与DNA一起经过入口被导入在图6C的左手侧所示出的反应纳米通道。需要辅助因子(例如，Mg2+离子)的限制性内切酶可以用于确保只在被完全限制在反应纳米通道中的平衡化DNA分子中发生DNA片段化。这是通过在适当的时间辅助因子的受控制导入从而实现限制性消化而实现，最容易地通过在图6A-和6E及图7A-图7E中所述的四个通道入口V0、V1、V2、V3中施加适当的电压。在各操作模式期间每个通道中电场的极性和强度是用图6A-图6E中的箭头表示。因为在此实例中辅助因子为荷正电离子，所以可以利用电泳法将辅助因子从反应纳米通道20中排除或者导入反应纳米通道20。图6D示出了利用柱的阵列16和纳米漏斗17将DNA片段注入检测纳米通道40中。在此实例中，检测纳米通道40的有效直径小于反应纳米通道20的有效直径。与检测纳米通道40相比，反应纳米通道20的长度可以是10和1000倍并且深度和/或宽度是2和100倍之间。例如，反应纳米通道20可以具有大约300nm的宽度和深度，同时检测纳米通道可以具有较小的宽度和深度，例如大约100nm的宽度和深度。在一些实施例中，检测纳米通道40具有尺寸比反应纳米通道20减小50％至99％之间的直径，由此导致当各片段到达交汇处时输送速率的增加以及各相邻片段的分离。
作为此通道限制的结果，检测纳米通道40中的电场大于反应纳米通道20中的电场，并且当DNA限制性片段到达交汇处时将这些片段快速地推进入检测纳米通道中。在下一个片段移动到交汇处并且被拉入检测纳米通道40之前，存在片段间的时间段。当片段移位经过检测纳米通道40时，在下游对这些片段进行检测并且对信号持续时间或整体强度进行分析以确定片段大小。在图6A-图6D中，这是通过利用检测穿过用于使用雪崩光电二极管102(图6D)的聚焦的激光点、或者使用例如经过单个物镜(激光1和激光2)或者使用另外的物镜(激光3)的两个激光103的多点检测(图6E)的染色DNA片段的荧光的电路100而实现。也可以利用用于荧光成像的电路100′来完成检测。
在图7A-图7E中示出了电单点(图7D)和多点(图7E)检测(例如，利用与检测纳米通道成为整体的相对电极对和电流表101来检测片段导致的电导率变化)。
图6F示出了根据本发明替代实施例的装置10可以构造成利用压力/真空50p的压力驱动的输送***而操作，经由贮存池50来引导、加载和/或输送DNA分子和片段。所述装置可以包括管道或管连接到压力源并且允许电动力学或电压***沿所述管线的自动化操作。图7A中和图解说明其它实施例的附图中所示装置的操作也可以在压力下或者与其它输送***操作。因此，如图6G中所示装置10可以与不同的输送驱动***“D”或者不同输送驱动***的组合一起操作，例如可以施加电动力学、压力或向心力中的至少一种从而将基因组DNA及其片段经过反应纳米通道输送进入检测纳米通道。
图6A-图6E和图7A-图7E中所示反应纳米通道与检测纳米通道之间的界面也应被看作是一类结构的一个例子，其中驱动片段输送的力中的突然变化导致片段空间和/或时间分辨。
图6A-图6D和图7A-图7D中所示的反应纳米通道20被图示为具有用“U”形段连接的多个平行腿的蜿蜒形状。然而，可以采用其它的纳米通道形状，包括较短通道的平直长度通常是在大约500μm至2cm之间。该蜿蜒形状尤其可适合于在整体芯片上的较长通道。
图6C-图6D中所示的通过注入检测纳米通道的限制性消化、片段分辨的要素以及片段尺寸修改已在原型装置中进行了揭示(图8)。这些原型装置是利用聚焦离子束铣削而制作，并且具有适合于病毒或细菌染色体DNA分析的相对较短的反应纳米通道。
在具有单个输入和单个输出的纳米通道上方的整体式纳米流体网络的一个优点是能够在多种位置利用电压来控制流体流动。在使用限制性内切酶的DNA消化中，重要的是控制辅助因子(例如，Mg2+离子)的浓度和位置以确保受限制DNA的消化同时防止也被导入反应纳米通道中的DNA的消化。为了显示此能力，将电泳缓冲液中的Mg2+敏感染料(镁绿)导入原型装置的纳米流体反应和检测通道中。将含有氯化镁(10nM)的缓冲液加入到底部通道中，如图9中所示。通过分别向Mg2+贮存池施加小的负或正电压而将“镁门”在关闭和开启状态之间进行切换，同时将反应纳米通道保持在地面。利用2秒暴露采集荧光图像，并且当将门打开时在图像后将镁门关闭。当Mg2+离子在反应纳米通道中向下移动时镁绿的强度增加。图9B示出了在实验期间的荧光的增加。此面板是通过将所记录系列的门打开时的最后画面(当把镁门关闭时所采集的)中减去最初画面而形成。为了确保荧光的增加不是由于染料的浓度极化(在纳米流体实验中所观察到的现象)所致，进行了对照实验，其中在底部通道中的缓冲液不含Mg2+离子。图9C示出了当把电压切换到“开启”状态时仅观察到荧光强度中的略微变化。在作图实验中，也可以将Mg2+流经过第一横向通道30引导进入在反应通道另一端的顶部“引导贮存池”，从而防止将Mg2+流导入起源DNA贮存池作用的微通道。
也已揭示了在原型装置的反应纳米通道中利用限制性内切酶对DNA分子进行消化。在适合于使用限制性内切酶HindIII进行消化的缓冲液中，用嵌入染料YOYO-1(碱基对∶染料分子＝5∶1)将λ噬菌体DNA(λ-DNA)染色。该缓冲液也含有用于隔绝可能会对含DNA微通道造成不良影响的任何Mg2+的EDTA(2nM)、和作为自由基清除剂的巯基乙醇(4体积％)。然后，将HindIII加入到DNA溶液中，再将此溶液加载入连接到反应纳米通道入口的DNA贮存池中。将含有无EDTA但有10nM氯化镁、4％巯基乙醇、和HindIII的反应缓冲液的第二溶液加入到Mg2+贮存池中。用含有4％巯基乙醇的(即，没有Mg2+、EDTA、或HindIII)的缓冲液充满剩余的贮存池(在图8中标记为“引导”和“出口”)。将铂电极浸泡在贮存池中，使得在图8中所示的四个入口处独立地控制电压成为可能。当把Mg2+电压门关闭时，利用高电场强度将DNA分子导入反应纳米通道。当λ-DNA分子进入显微镜的视野时，将电压切换到较低值使得DNA迁移减慢并且将Mg2+电压门打开，从而驱动Mg2+离子经过DNA分子。在数秒后，调整电压使得反应纳米通道中的电场强度大致为零。每200ms获取图像。在10-15秒的初始成像期之后，将荧光激发源光闸关闭以确保不发生光诱导的片段化。在大约1分钟的反应后，将光闸关闭以确定消化的程度。图10示出了表示在暴露于Mg2+1.5分钟后λ-DNA的消化的代表性的画面系列。在这种情况下，观察到三个片段，表明DNA分子的被HindIII部分消化。
在原型装置中也显示通过将DNA片段有序地注入检测纳米通道而在空间和时间上与它们的相邻片段分离。将荧光染色的T4-噬菌体DNA分子注入具有从400nm×400nm减小到200nm×200nm的尺寸(宽度×深度)的纳米通道中。假设这两个段的长度相同，这对应于较小纳米通道中电场的四倍增加。图11示出了在较大反应纳米通道中单个噬菌体分子的多个片段的扩散。(对于该相对较小的DNA分子而言，可以在附图中所示的观察期中使这些片段分离。然而，在较大视野中多个大限制性片段的分离将会需要延长的观察时间并且受更大的不确定性的制约)。在此观察期之后，将片段注入检测通道中。此动态过程有效地导致各片段与其相邻片段完全分离。
基因组水平限制性图谱的生成
图12示出了***200，图中提供了如何可以使用具有计算机控制90的桌上型仪器150来执行各种装置操作的一个实例，该上型仪器150可以顺序地或同时地对低成本的一次性使用装置10进行测试。通常，在将全细胞的样品导入装置10之后，将其***仪器150。然而，也可在将装置10置于仪器150中之后，用细胞加载装置10。可以启动定时程序，其中使试剂流动经过细胞以便实现在装置10中的DNA提取和染色。启动预定的电压程序90p以便引导第一部分的染色体DNA。被引导DNA的存在(以光学或电学方法进行检测)引起电压程序中的变化，从而将DNA分子完全地加载入反应纳米通道20中。当已完成该操作时(如利用光学或电检测所测定的)，再次改变电压程序90p以启动核酸内切酶消化反应。在此步骤期间，可在仪器150中将装置10加热以提高反应动力学。在规定的反应时间之后，将电压自动地变化到用于驱动片段有序注入检测纳米通道40中的值。当利用电路100、100′(图6D、图6E、图7D、图7E)采集测量信号时可以对测量信号进行分析，由此实时或近实时地生成限制性位点的图谱。当片段的检测结束时，电路100、100′可以向计算机90反映整个DNA分子已被取样并且“阅读”完成。利用电压程序90p将电压改变为它们的“引导”值以便阅读下一部分的染色体DNA。
图13A-图13B示出了可以用于检测DNA分子的引导的示例性的元件和电路105、105′；图13C示出了定时/电压控制程序，该程序具有由来自一个或多个控制电路的输入(例如100、100′、105和/或105′)所命令的电压程序90p触发的。垂直箭头表示电压程序中的触发变化。水平箭头表示延迟(例如，提供足够的时间来完成限制性消化反应)。该步骤可以重复多次以便读出来源于最初被导入装置中的多个细胞的染色体DNA的多个拷贝。可替代地，可利用恒定的电压、压力或其它驱动力或者其组合来操作所述装置，如图13D中所示。图13D中的上图示出了检测信号，而下图示出了在与上图的检测时间相对应的时间中的四个恒定的输入值。关于各自的驱动力输入所使用的术语“恒定”表示在规定时间段内的值平均地恒定到+/-10％(例如，在分析期内，电压和/或压力是一个值的+/-10％)。换句话说，驱动力输入是充分地恒定以便具有连续流相对于停止流，但流率(虽然是连续的)可随时间推移而变化。一系列的限制性片段利用它们的聚类而被鉴定为来源于单个DNA分子，并且利用没有或减小的可检测信号证明分子分离。在簇之间的延迟是由于染色体DNA分子之间的取样延迟所造成，并且表明可利用各自分子的唯一读出来描述各簇的特征。图13D示出了连续流动检测，其中鉴定分子1的第一簇，然后鉴定具有被没有(或非常低)的例如检测信号时间段所分离的两个相邻簇的分子2的第二簇。在各阅读的结束时，可以通过计算来确定该阅读是唯一的(即，这是在实验进行期间第一次对染色体进行作图)或者与现有的图谱数据或“阅读”160一致从而提高阅读覆盖率(即，实验进行中染色体的其它拷贝之前已被阅读)。由该技术所导致的长阅读长度允许此过程在作图实验期间完成。因此，可以产生持续更新的质量评分，并且可以在达到用户规定的图谱覆盖率和质量的基准之后终止分析。可替代地，可以启动使用另外的限制性内切酶的限制性酶切作图，以生成各种限制性位点的高信息容量图谱。
图12示出了具有受控制的环境壳体150的自动分析***200，该壳体可以包括电源150p、流体连接件、和用于贮存池50的各种化学物质(例如，溶解试剂、清洗缓冲液、去染色质试剂、DNA染色溶液(当需要时))。所述***可以通过经过流体连接件注入或抽出流体并且通过向与通道20、30、32和40(例如，图6A-图6D和图7A-图7D中的V0、V1、V2、V3)连接的电极施加电偏压(例如电压)而控制操作。可以将微流体通道15、流体经过通道30、32和检测纳米通道40并入用于容纳可流动物质(例如流体(电解液))的贮存池50中。贮存池流体可以包括电解质溶液，例如高离子强度的电解质溶液。合适溶液的例子包括但不限于浓度为大约35mM至大约1M的氯化钾溶液。
参照图12，***200可以包括对可控制地施加V0、V1、V2、V3的电极50e(图1C)的电压输入251-254。***200可以包括电源150p(例如，电压源和/或电流源)，该电源150p可以由连接或者包括检测回路100、100′(图6D、图6E、图7D、图7E)和引导检测回路105、105′(图13A、图13B)的电路90c利用期望的电压定时程序或算法90p在至少一个处理器90p下方的方向施加电偏压。***200可以在适当的时间施加并控制电压V0、V1、V2、V3以便引导、加载、反应和输送并且检测分析在下方的分子或者在将电压保持恒定的模式中进行操作，如上面参照图13D所描述的。可替代地，可以利用通过按照定时程序或算法90p经过流体连接件将溶液注入或抽出装置10的压力驱动流动而实现一些功能。
图7A-图7D示出了使用电路100′的电压变化的电触发并且利用电流表101来测量横向电导率的检测***；图6A-图6D示出了使用雪崩光电二极管102和激光103的检测***100以及电压变化的电触发。
图12中示出***200可以包括具有电路和/或至少一个处理器90p的计算机90，该计算机90可以从检测纳米通道40中的DNA片段中获得分析数据。所使用的术语“计算机”广义地包括任何电子装置，通常包括至少一个数字信号处理器，从而允许控制电路100、100′和/或仪器150并且与其连接以便控制操作。计算机90可以在仪器150的附近或者在远离仪器150。
所述***可以包括具有检测器102和激发源103的成像***(图6D)，该成像***可以获取在检测通道40中的分析物分子的一系列图像。该成像***可以是任何合适的成像***。如图中所示，***100可以包括激发光源103(通常用于产生激发荧光标记分子的光)(其可以可选地包括反射镜、光分束器、偏振器、透镜、和/或其它光学元件)以及图像生成装置或检测器102，例如一个或多个的摄像头、光电增倍管或光电二极管。物镜(如果使用)可以存在于装置10主表面的下方或上方。电输入/输出和流动操作可以存在于装置10的相反端。装置10也可以翻转从而在其侧部(其中平直的主表面是直立的或倾斜的)上操作，而不是大体上为水平的。
图14示出了根据本发明实施例的、可以用于提供从全细胞中所提取基因组DNA的DNA有序限制性图谱的示例性操作。提供一种具有并入反应纳米通道中的流体微通道的装置，该反应纳米通道在其中纳米通道直径的尺寸减小的界面处合并入检测纳米通道中(方框300)。可选地，相对于反应纳米通道的尺寸，尺寸减小可以在50％至99％之间(方框302)。可以使全细胞溶解并且去染色质从而在微通道中产生具有最小片段化的DNA(方框310)。然后，可以将完整的DNA分子导入反应纳米通道中(方框315)。然后，可以在反应纳米通道中利用限制性内切酶使完整的DNA片段化。反应纳米通道的尺寸和构造被设计成使得片段保持原来的顺序直到将它们注入检测纳米通道中(方框320)。可以对在沿检测纳米通道的一个或多个位置处的信号进行检测，从而按它们在长DNA分子中出现的顺序对片段进行作图(方框325)。
所述装置可以使用于与所述装置连接的输送***，使得该输送***构造成施加电动力学、压力或向心力中的至少一种从而将基因组DNA及其片段经过反应纳米通道输送进入检测纳米通道中(方框321)。
该技术允许将来自全部染色体的DNA受控制地导入纳米通道，使用限制性酶对其进行消化、和限制性片段的有序作图。片段的基于注射的分离从而使相邻的片段分解可以使由于扩散所导致分解的损失最小化，并且减小或排除对具有接近或超过纳米制造方法的当前限制的重要尺寸(宽度和深度)的纳米通道的依赖。
有利地，最小的所需纳米通道宽度通常为大约100nm。因此可以利用多种常规方法将装置制作在各种基材中。参见，例如Mijatovic，D.；Eijkel，J.C.T.；van den Berg，A.《用于纳米流体***的技术：自上而下相对于自下而上的概述》。Lab Chip2005，5，492-500；Perry，J.L.；Kandlikar.S.G.《用于单相液体流动的纳米通道的制造的概述》，Microfluid.Nanofluid.2006，2，185-193；Chantiwas，R等人，《聚合物纳米通道和纳米缝隙的柔性制造和应用》，Chem.Soc.Rev.2011，40，3677-3702；和Utko，P.；和Persson，F.；Kristensen，A.；Larson，N.B.注射成型的纳米流体芯片：利用单分子DNA实验的制造方法和功能测试。Lab Chip，2011，11，303-308。这些文献的内容以参考的方式并入本文中如同本文全文中的叙述。使用晶片尺度处理的能力可以提供高抗冲、低成本的技术。
可以从芯片上的细胞中提取出染色体DNA并且将染色体DNA在没有分子间缠结的情况下导入纳米通道以便进行限制性消化和片段尺寸修改。这确保最小DNA切变，减小对从许多小的重叠的重叠群(DNA的相邻共有性区域)的光学图谱的组装的需要。如果由于芯片上处理而发生切变，需要测定的染色体DNA分子的长度可以大于0.5百万碱基对，通常器长度大于5千万个碱基对。预计这会增加通量、降低计算费用，并且能够在低输入材料要求的情况下获得高覆盖率图谱。
可以通过成像或者利用信号的持续时间或积分幅度的单点检测来测量片段大小。DNA流速可以是独立于这些测量的长度，该流速可以通过理论进行预测并且已在该尺寸的通道中通过实验进行了验证。数据分析可以实时或近实时地进行，从而确保可以在单次实验中采集数据直到实现期望的覆盖率和图谱质量。对大视野图像存储和分析的排除可以降低计算费用。
其它功能的整合是可行的。例如，在检测后可以对所选择的片段进行分类以便进一步分析。DNA可以经历限制性消化和第二次检测，例如与标记甲基-CpG结合域蛋白或肽的反应。参见例如Lim，S.F.；Karpusenko，A.；Sakon，J.J.；I look，J.A.；Lamar，T.A.；Riehn，R。纳米通道中的DNA甲基化分析，Biomicrofluidics2011，5，034106；这些危险的内容以参考的方式并入本文中如同本文全文中的叙述。因此，双色检测可以为单分子表观遗传分析提供序列上下文。
例如，本发明的实施例可以构造成鉴定感兴趣的片段并且将它们分类进入下游通道以便进一步分析。这些构造可以对于基因组的特定区域之间的表观遗传修饰的靶向分析或者对于所选择的DNA片段进行测序是重要的，从而提高发现和诊断的可能性。图15-图21示出了具有机载的或远处的贮存池R的分析构造以及相关方法的例子。虽然这些附图示出了分子输送受到电动力学驱动各种部件经过所述装置的影响，但也可以如前所述在分离和合并中使用其它输送力，包括例如包括压力、介电电泳力、向心力等中的一个或其组合的驱动***D，如图6F和图6G中的实例中所示。
图15是装置10的一个实例构造成能够使用两个不同的反应纳米通道201、202相继地执行两次限制性消化，一个通道位于另一个通道的下游位置。来自第一次限制性消化的有序片段(通常是全部的有序片段)可以可选地导入第二反应纳米通道202中以便利用第二限制性酶进行消化。来自第一和第二检测通道(分别为401和402)的数据的组合提供增加的或补充的关于基因组结构的信息。
可替代地，如图16中所示，第二反应纳米通道202可以用于将标记探针结合到从第一检测纳米通道401中离开的有序片段。例子包括可以结合到DNA甲基化区域或受损区域的标记蛋白质(尽管其它实施例也是可行的)，由此提供补充的关于DNA样品的信息。
在一些实施例中，本申请的装置、***和/或方法可以在已对片段进行作图之后选择性地对片段进行取样。因为可以实时(或近实时)地执行该分析，所以所观察的或检测的规定触发事件(例如片段的规定图案的检测)可以自动地触发与主要操作模式的操作参数中的变化，例如，输送***的电压、压力等可以具有至少两种规定的操作模式：一种是使用较少分析时间的“正常”模式。另一种是更具体地用于使用第二反应纳米通道的补充分析的片段。因此，例如，默认时，可以将来自初始限制性消化的片段输送入被认为是“废物”W的排出贮存池(即，将不会对DNA进行其它的分析)。然而，所述***和方法可以构造成使得当被触发时，可以将代表基因组中感兴趣区域的一系列片段重新引导至二次反应纳米通道202并且贮存池R(也标记为V4)可以提供用于二次反应的材料。
图17示出了示例性的触发步骤。图18和图19中示出了两个示例性的选择性触发***/构造。
如图17中所示，可以实时(或近实时)地对有序片段进行分析(方框350)。模式识别可以用于确定何时对感兴趣的区域进行作图(方框355)。该步骤可以具有决策节点(方框360)。如果希望作进一步分析，则可以基于规定的触发事件或检测，将片段流体地传输/输送至后继的反应纳米通道202(方框370)。如果不希望作进一步分析，则可以将片段输送至废物贮存池W(方框365)。
图18中示出了装置10的一个实例，其中将大部分的限制性片段输送至废物贮存池W(也标记为“V6”)同时通过适当地触发电压(或其它驱动力)而将所选择片段导入在第二反应纳米通道202中的第二限制性消化。废物贮存池W可以直接地存在于第二纳米通道202的上游位置(如图所示)或者存在于其它位置。
图19是装置10的一个实例，其中通常将大部分的限制性片段输送至废物贮存池W(也标记为“V6”)同时通过适当地调整电压(或其它驱动力)而将所选择的片段导入第二反应纳米通道202，其中将它们结合到可以结合到DNA甲基化区域或受损区域的标记探针(例如来自贮存池R(也图示为V4))。
除了在装置10(例如，芯片)上所执行的二次反应外，也可以将来自基因组的所选择区域的片段选择性地输送至标记的贮存池以便后继的收集和离芯片分析(例如，测序)。可以将多个目标片段进行分类，再分别输送至其自己的出口通道。目标染色体的多个拷贝的作图和分类将能够收集到足够的用于分析的材料。在一些实施例中，在已收集到足够的材料后，可以将具有唯一条形码的衔接子加入到各出口贮存池中并且附接到其中所含有片段的端部。然后可以使这些片段汇聚(和可能地扩增)，进行库制备，并且进行测序。图20示出了示例性的片段分析、识别和触发过程；图21示出了具有多个收集贮存池“C”(标记为V7、V8、V9...Vn)的示例性装置10，其中可以实施和/或执行所述过程。可以实时(或近实时)地对有序片段的大小进行分析(方框375)。规定的触发事件或被检测的片段的判定(例如模式识别)可以确定何时对感兴趣的区域进行作图(方框377)。过程决策节点(方框380)可以自动地评定是否需要对限制性片段进行测序并且执行相关的输送操作从而将片段输送至废物贮存池W(方框382)或者将所选择的片段输送至汇聚贮存池(方框385)，通常是标记的汇聚贮存池以便以后的分析。
图21示出了装置10的一个实例，其中将限制性片段输送至“废物”贮存池(标记为“V3”)(默认时)，但将经鉴定的感兴趣片段引导至出口通道41并且收集在各自的收集贮存池C(V7、V8、V9、...、Vn)中。
本发明的实施例具有高抗冲的可能性，主要在结构变异体基因分型和从头序列拼接的区域。目前，评定增加的疾病易感性的可提供的遗传试验通常鉴定通常是单基因编码错误的、稀有的高效单核苷酸多态性(SNP)。然而，SNP不仅是致病性的变异体，并且遗传评价将会得益于结构变异(新的***、缺失、复制、倒置、和易位)的包括。与SNP相比，对结构变异(SV)对疾病表型的贡献尚未得到充分了解。已知的例子包括在SV与精神***症、自闭症和克罗恩病之间的相关性。因此，可以鉴定SV的高通量低成本方法是对基于SNP的相关性研究的重要补充。目前的用于鉴定SV的方法(例如，基于杂交的阵列方法和用于分析下一批测序数据的计算方法)在大小和所检测的变异类型中显示偏差，从而防止全局发现。除了各方法所特有的偏差外，在SV的检测中存在有在-300和-10,000碱基对之间的大的间隙。染色体DNA的高分辨率限制性图谱提供用于鉴定存在于一个个体的基因组中的所有类型SV的直接方法。
除了它们在检测SV中的应用外，光学图谱也可以用作用于下一批测序重叠群的组装的支架。参见例如Lam等人，《用于结构变异分析和序列拼接的在纳米通道阵列上的基因组作图》，Nat.Biotech.2012，30，771-776；Zhou等人，《类球红细菌株2.4.1的全基因组鸟枪法光学作图及其用于全基因组鸟枪法序列拼接的使用》。Genome Res.2003，13，2142-2151；和Zhou等人，《鼠疫耶尔森氏菌株KIM的全基因组鸟枪法光学图谱》，Appl.Environ.Microbiol，2002，68，6321-6331。这些文献的内容以参考的方式并入本文中如同在本文全文中的描述。
增加通量且降低限制性位点作图的成本的方案对于比较基因组学研究可以具有显著的价值。此外，限制性酶切作图的跨越大的高度重复性区域的能力将有利于帮助困难的组装，例如异色的DNA和植物基因组。
本发明的实施例可以按它们沿大DNA分子中所出现的顺序准确地给片段作图。其中在检测纳米通道处通道直径显著增大的纳米通道结构(图11)简化了该作图。在图11中，这是由在图像左手侧的系列画面所显示。虽然在一些画面中在上面的系列画面中显然存在4个片段，但在其它画面中却是不明显的。因此，可以获得对片段大小的估计，但这不是精确的。将其与在下面三分之二的系列画面中的画面相比，在片段之间存在显著分离和确定片段大小中的更大的准确性。
本发明的实施例也用于将一系列的片段以与它们在DNA分子中所出现顺序相同的顺序导入检测结构中。为此目的，可以将完整的段的DNA导入反应纳米通道20中，然后在反应纳米通道内部利用限制性内切酶将DNA片段化。这些酶仅在具有沿DNA分子的这些部位生成图谱的特定序列(例如，HindIII酶识别碱基序列AAGCTT和在两个A之间切割DNA)的部位使DNA片段化。反应纳米通道具有片段不混杂的足够小的直径，它们保持原来的顺序直到将它们注入检测纳米通道40中。
上述内容可以尤其适合于导入长的DNA分子，例如长度为大约0.5百万个碱基对。可以想到如果可以将长度为2亿5000万个碱基对(即，整个人染色体的DNA)的完整的DNA导入反应纳米通道20中，那么这将会大大地缩短分析时间、所需的样品、和作图错误。然而，本发明的实施例可以有利于其它用途，例如高抗冲诊断和研究工具。
虽然为了完整性而描述了FIB铣削并且一般认为尤其适合于形成纳米通道，但其它实施例涉及如上所述的其它成形技术，包括例如电子束光刻、米压印光刻、光刻、模板法或模压成型方案、和由本领域技术人员所了解的其它方法。
前述的是对本发明的说明而不应被看作是限制本发明。尽管已描述了本发明的一些示例性实施例，但本领域技术人员将容易地理解的是，在不显著地背离本发明的新教示和优点的前提下，可以在示例性实施例中作出许多修改。因此，所有的这种修改意图是包括在由权利要求所限定的发明的范围。本发明是由附权利要求所限定，并且权利要求的等同物也包括在其中。

Claims (41)

1.一种纳米流体分析***，包括：
反应纳米通道，所述反应纳米通道的长度在500μm和10cm之间并且在其间检测纳米通道的尺寸相对于所述反应纳米通道减小的界面位置处并入所述检测纳米通道中；
微流体通道，所述微流体通道与所述反应纳米通道的进入部连通；
第一电极，所述第一电极与所述微流体通道连通；
第一横向流体通道，所述第一横向流体通道在与所述反应纳米通道的所述进入部间隔开的但与之接近的位置处从所述反应纳米通道延伸并且与所述反应纳米通道流体连通；
第二电极，所述第二电极与所述第一横向流体通道连通；
第二横向流体通道，所述第二横向流体通道从位于所述第一横向流体通道下游的所述反应纳米通道延伸并且与之流体连通；
第三电极，所述第三电极与所述第二横向流体通道连通；
第四电极，所述第四电极与所述检测纳米通道连通；
电路，所述电路被配置成控制所述第一、第二、第三和第四电极的操作从而能够控制地在所述反应纳米通道内引导、加载和消化DNA，由此防止片段无序化；和
至少一个电或光检测器，所述至少一个电或光检测器与所述检测纳米通道连通，被配置成空间上且时间上解析片段大小以由此实时地或近实时地允许染色体DNA的有序限制性图谱。
2.如权利要求1所述的***，其中所述微流体通道包括被配置成部分地堵塞所述微流体流道的间隔开的柱的阵列。
3.如权利要求1或2所述的***，还包括将所述微流体通道与所述反应纳米通道的所述进入部连接的纳米漏斗。
4.如权利要求1或2所述的***，其中所述反应纳米通道具有带有由“U”形段连接的多个紧密间隔的大体上平行的段的蜿蜒形状。
5.如权利要求1或2所述的***，其中所述微流体通道、所述反应纳米通道、所述检测纳米通道和所述第一和第二流体横向通道整体地集成在流体芯片上。
6.如权利要求1或2所述的***，其中所述第一和第二横向流体通道是具有在1nm和100nm之间的深度以及在20nm和2000nm之间的宽度的流体纳米通道;
其中所述反应纳米通道具有在1nm和500nm之间的宽度和深度尺度，并且其中所述反应纳米通道的深度和/或宽度比所述检测纳米通道大出2和10倍之间；
其中所述第一横向流体通道的位置距所述反应纳米通道的所述进入部在10-500μm之间；
其中所述第二横向流体通道是所述检测纳米通道的上游；
其中所述电路被配置成通过下列手段来控制所述第一、第二、第三和第四电极的操作从而可控地引导、加载和消化DNA：以定义的顺序施加定义的电压来可控地将DNA从所述微流体通道引入所述反应纳米通道，接着将所述DNA限制在所述反应纳米通道内，而后使所述DNA在所述反应纳米通道内反应成为有序片段，然后将有序片段从所述反应纳米通道注入所述检测纳米通道；并且
其中所述反应纳米通道具有只在所述第一横向流体通道和所述第二横向流体通道之间延伸的反应段，使得所述反应段在一端上于所述反应纳米通道的所述进入部之前以及在相反端上于所述检测纳米通道之前终止。
7.如权利要求6所述的***，其中所述反应纳米通道的长度是所述检测纳米通道的长度的10倍和1000倍之间并且所述反应纳米通道的深度和/或宽度是所述检测纳米通道的深度和/或宽度的2倍和10倍之间。
8.如权利要求1或2所述的***，所述第一横向流体通道是微通道或者纳米流体通道或者包括这两者的段，并且其中所述反应纳米通道的长度是所述检测纳米通道的长度的10倍和1000倍之间。
9.如权利要求1或2所述的***，其中所述***包括第二反应纳米通道，所述第二反应纳米通道与在所述第二反应纳米通道的入口端上的所述流体微通道流体连通并且在所述第二反应纳米通道的相反的外出端处合并入相应的第二检测纳米通道中。
10.如权利要求1或2所述的***，其中所述***配置有在基材上的成倍的所述反应纳米通道、所述检测纳米通道以及所述第一和第二横向流体通道，所述基材以盖板密封并且具有经过通孔给相应的流体通道给料的多个通向外部的贮存池。
11.如权利要求1或2所述的***，其中所述微流体通道与一个或多个贮存池流体连通，至少一个贮存池包含全细胞、细胞核、全染色体、或者长DNA分子的其它来源以用于分析。
12.如权利要求11所述的***，其中用于分析的全细胞被用于基因组DNA提取的凝胶基质所限制。
13.如权利要求11所述的***，其中用于分析的全细胞被用于基因组DNA提取的至少一个高和/或低密度柱阵列所限制。
14.如权利要求1或2所述的***，其中所述微流体进入通道包括具有DNA的全细胞，并且其中所述第二横向流体通道在远离所述反应纳米通道的端部处并入第二流体贮存池中，并且其中所述第二流体贮存池包括限制性内切酶和辅助因子的溶液。
15.如权利要求1或2所述的***，其中所述检测纳米通道是直的，并且具有在500μm至2cm之间的长度，并且其中所述反应纳米通道的长度是所述检测纳米通道的长度的10倍和1000倍之间并且所述反应纳米通道的深度和/或宽度是所述检测纳米通道的深度和/或宽度的2倍和10倍之间。
16.如权利要求1所述的***，其中所述***包括长度在500μm和10cm之间的第二反应纳米通道，所述第二反应纳米通道存在于所述反应纳米通道的下游并且在其间第二检测纳米通道的尺寸相对于所述第二反应纳米通道减小的第二界面位置处合并入所述第二检测纳米通道中。
17.如权利要求16所述的***，还包括与所述反应纳米通道流体连通的废物贮存池，并且其中所述***与被配置成选择性地输送限制性片段以进入所述废物贮存池或所述第二反应纳米通道的回路连通。
18.一种分析芯片，包括：
微流体入口，所述微流体入口适合于利用具有柱阵列的微流体通道从全细胞、细胞核、全染色体或者长DNA分子的其它来源中提取基因组DNA；
长度在500μm和10cm之间的第一反应纳米通道，所述反应纳米通道具有连接到所述微流体入口的进入部；
第一检测纳米通道，所述第一检测纳米通道在由纳米通道尺寸减小所限定的交汇处与所述第一反应纳米通道的外出端合并；
第一横向纳米通道，所述第一横向纳米通道从与所述第一反应纳米通道的进入部间隔开的但与之接近的所述第一反应纳米通道延伸并且与之流体连通；和
第二横向流体纳米通道，所述第二横向流体纳米通道从位于所述第一横向流体纳米通道下游的所述第一反应纳米通道延伸并且与之流体连通。
19.如权利要求18所述的芯片，还包括存在于所述反应纳米通道和所述微流体入口之间的并且将所述反应纳米通道与所述微流体入口连接的纳米漏斗。
20.如权利要求18或19所述的芯片，还包括由所述芯片保持的多个贮存池，所述多个贮存池包括与所述微流体入口流体连通的至少一个贮存池、与所述第一横向纳米通道流体连通的至少一个贮存池、与所述第二横向纳米通道流体连通的至少一个贮存池、和与所述检测纳米通道的一端流体连通的至少一个贮存池。
21.如权利要求18或19所述的芯片，其中在所述微流体通道中的所述柱的阵列包括轴向间隔的阵列的多个段。
22.如权利要求18或19所述的芯片，其中所述柱的阵列被配置成大体上延伸跨过所述微流体通道的整个宽度。
23.如权利要求18或19所述的芯片，结合与所述芯片连通的输送***，其中所述输送***被配置成施加电动力学、压力、或向心力中的至少一种从而将基因组DNA分子及其片段经过所述反应纳米通道输送进入所述检测纳米通道。
24.如权利要求18或19所述的芯片，还包括：
长度在500μm和10cm之间的第二反应纳米通道，所述反应纳米通道具有连接到所述微流体入口的进入部；
第二检测纳米通道，所述第二检测纳米通道在由纳米通道尺寸减小所限定的交汇处与所述第二反应纳米通道的外出端合并；
第三横向纳米通道，所述第三横向纳米通道从与所述第二反应纳米通道的进入部间隔开的但与之接近的所述第二反应纳米通道延伸并且与之流体连通；和
第四横向流体纳米通道，所述第四横向流体纳米通道从位于所述第三横向流体纳米通道下游的所述第二反应纳米通道延伸并且与之流体连通。
25.如权利要求18所述的芯片，还包括长度在500μm和10cm之间的第二反应纳米通道，所述第二反应纳米通道与在所述第二横向流体纳米通道后面的所述第一反应纳米通道流体连通并且存在于所述第一反应纳米通道的下游，其中所述芯片与选择性地引导来自所述第一反应纳米通道的限制性片段流体地进入废物出口路径或者流体地进入所述第二反应纳米通道的回路连通。
26.如权利要求18所述的芯片，还包括废物出口路径和具有相关联的出口通道的多个收集贮存池，所述出口通道延伸到所述第二横向流体纳米通道的下游，其中所述芯片与选择性地引导来自所述第一反应纳米通道的限制性片段进入废物出口路径或者进入所述收集贮存池之一的回路连通。
27.一种生成从全细胞中所提取的基因组DNA的有序限制性图谱的方法，包括：
提供具有合并入反应纳米通道中的流体微通道的装置，所述反应纳米通道在其中所述纳米通道直径的尺寸减小50%至99%之间的界面处合并入检测纳米通道中；
在所述微通道中的最小片段化的情况下，溶解全细胞和将DNA去染色质；然后
将完整的DNA分子导入所述反应纳米通道；然后
在所述反应纳米通道中利用限制性核酸内切酶使所述完整的DNA片段化，其中所述反应纳米通道被定制尺寸并且被配置使得所述片段保持在原来顺序直到将它们注入所述检测纳米通道；以及
在沿所述检测纳米通道的一个或多个位置处检测信号以便按它们沿长DNA分子所出现的顺序对片段进行作图。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述装置包括与合并入所述反应纳米通道中的流体微通道流体连通的至少一个贮存池，其中所述导入步骤通过利用所述贮存池导入用于分析的全细胞而实施，所述方法还包括提供用于将所述全细胞固定的凝胶基质和/或高密度柱阵列，然后溶解所述细胞，提取所述DNA，和可选地将所述DNA染色，然后将所述完整的DNA分子导入所述反应纳米通道中。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述装置包括具有柱阵列的微流体通道，所述微流体通道与所述反应纳米通道的入口端流体连通，并且第一横向通道与位于所述微流体通道的下游的所述反应纳米通道流体连通，所述方法还包括通过将电压施加到所述微流体和横向通道从而在所述反应纳米通道的所述进入区形成偏压而引导和加载所述样品。
30.如权利要求29所述的方法，其中利用接近所述反应纳米通道的入口的受控制电压或浓度极化梯度来实施所述引导步骤，使得最初 DNA分子不经受超过DNA拉伸强度的应变并且不发生机械断裂。
31.如权利要求29所述的方法，其中在所述引导步骤之后，通过改变施加到所述反应纳米通道和横向纳米通道的电压实施所述加载从而以在1μm/s和1mm/s之间的速率将所述全部DNA分子拉入所述反应纳米通道中，使得所述DNA分子的尾端具有充分的时间以便扩散地从任何柱的缠结分离并且避免机械断裂。
32.如权利要求27或28所述的方法，其中通过改变施加到所述反应纳米通道和横向纳米通道的电压从而将限制性内切酶和/或辅助因子分子导入到所述反应纳米通道中所含有的DNA来实施所述限制性消化的反应，然后允许反应进行直到所有的限制性位点已被消化。
33.如权利要求27或28所述的方法，其中施加到所述反应纳米通道和横向纳米通道的所述电压防止将限制性内切酶和/或辅助因子导入所述微流体通道中并因此防止在所述反应纳米通道的外部对DNA分子的消化。
34.如权利要求27或28所述的方法，其中通过改变施加到所述反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便驱动所述片段的迁移到在所述反应纳米通道与所述检测纳米通道之间的所述界面来实施对所述有序限制性片段的检测，其中所述检测纳米通道直径的尺寸与所述反应纳米通道相比减小50%至99%之间，由此导致当各片段到达所述交汇处时输送速率的增加以及各相邻的片段的分离，然后实施所述检测步骤以检测所述分离片段经过所述检测纳米通道的输送。
35.如权利要求27或28所述的方法，其中实施所述引导、加载、限制性消化、和有序限制性片段尺寸修改操作以便通过在限定的输入处持续地施加恒定的电压而顺序地对多个分子进行分析。
36.如权利要求34所述的方法，其中通过在沿所述检测纳米通道的一个或多个位置以光学或电学的方法对所述片段进行检测而实施所述检测步骤。
37.如权利要求34所述的方法，所述方法还包括通过对检测信号持续时间或积分幅度进行分析而确定片段大小。
38.如权利要求27或28所述的方法，其中所述装置是流体分析芯片。
39.如权利要求27所述的方法，还包括以电子方法或光学方法识别何时实时或近实时地对感兴趣的区域进行作图，并且选择性地且自动地将限制性片段流体地输送至第二反应纳米通道，其中所述限制性片段经历二次反应以及在第二检测纳米通道中的后继的检测。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述二次反应是限制性消化或者探针结合。
41.如权利要求27所述的方法，还包括：以电子或光学方法识别何时实时或近实时地对感兴趣区域进行作图并且自动地且选择性地将感兴趣的限制性片段流体地输送至各自的出口通道进入各自的收集贮存池进行激光分析，以及将其它限制性片段流体地输送至废物出口通道。
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