CN105442054B

CN105442054B - 对血浆游离dna进行多目标位点扩增建库的方法

Info

Publication number: CN105442054B
Application number: CN201511021881.6A
Authority: CN
Inventors: 金谷雷; 牛耀芳
Original assignee: Hangzhou Gukun Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Gukun Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN105442054A

Abstract

本发明公开了一种对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，依次包括以下步骤：1)、末端修复和加A；2)、接头连接：在步骤1)所得的末端加A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头DNA，从而获得两侧结合上环状发夹接头后的双链DNA；当步骤1)中提取纯化的血浆游离DNA的量≤10ng时，进行步骤3)；反之，当步骤1)中提取纯化的血浆游离DNA的量＞10ng时，直接进行步骤4)；3)、在步骤2)所得的加好接头的DNA中加入特异性引物I、Phi29酶和缓冲液，进行线性扩增；4)、PCR扩增：所述扩增产物构成游离DNA突变位点富集测序文库。

Description

对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法

技术领域

本发明属于分子生物学，医学领域，尤其涉及一种针对血浆游离DNA或短片段(<300bp)DNA的多位点扩增文库的方法。

背景技术

近年来发现人体的外周血血浆中存在游离的DNA片段，长度在100-300bp，主要集中在150bp附近。在肿瘤病人中这些游离的DNA可能包括来自脱落和死亡的肿瘤细胞，在孕妇体内可能包括胎儿的DNA片段。因而通过检测游离DNA片段中的特定位点的突变情况一定程度上可以反映肿瘤或胎儿的特定位点的变异状况。但是血浆中的游离DNA片段较短，绝大部分在150-200bp左右，一般不会超过300bp，而且含量很低。现有的游离血浆DNA提取方法的提取率一般在10ng/ml血液，而1ng游离人体DNA约含150-300份基因组拷贝，再加上血浆游离DNA来源多样，还有大量正常细胞或母体来源的DNA，导致需要检测的突变DNA所占比例很低。近来迅速发展的高通量测序技术通过对大量序列的高覆盖测序一定程度上可以计算出这些突变所占的比例。但是现有的二代高通量测序技术都首先需要对DNA进行文库构建，在两侧加上测序使用的接头，而且如果对所有的DNA片段进行测序则成本过高而且会导致目标区段的覆盖层数大大降低。这就需要我们有一种方法能对低含量的短片段DNA进行建库，并特异性的富集或扩增突变位点所在的区段，而且可以同时检测多个位点的文库构建方法。目前已有的建库方法包括：1)首先对所有DNA片段进行建库，然后使用特异性捕获探针捕获突变区段所在的文库片段(目前安捷伦的SureSelect Target Enrichment技术和罗氏的NimbleGen方法都是这类技术的代表)；2)使用多重PCR方法进行扩增建库(如Life公司的Ion Ampliseq和Illumina的TruSeq Amplicon就属于这类技术的代表)。其中特异性捕获探针的方式对DNA起始量有一定的要求，而且过程需要进行杂交，周期较长(一般需要24小时以上)，成本较高，且存在较为一定的脱靶问题(捕获区段不是目标区段)。而现有的多重PCR方法均使用双端特异性引物的方式，也存在许多问题，因为多重PCR需要设计特异性引物，而一个位点至少需要设计一对特异性引物，同时要考虑多重PCR多个位点的引物之间的干扰所以设计引物通常较长(通常30bp左右)，且通常距离突变位点有一定距离。但是由于片段较短，且突变位点可能位于片段末端，导致采用双端特异性引物实际能结合的部位过短，导致大量(超过50％)的片段都无法有效的扩增，从而大大提高了对DNA起始量要求，甚至无法有效建库。因而本领域仍需一种可适用于血浆游离DNA这种低当量(<10ng)短片段(<300bp)DNA的可对多位点快速扩增富集的建库方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对血浆游离DNA等短片段DNA进行多目标位点扩增建库的方法，本发明鉴于现有多重PCR对于引物设计和DNA片段的缺陷，所提供的建库方法不仅可以大幅降低引物设计和DNA起始量要求而且可以提高文库扩增效率。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，依次包括以下步骤：

1)、末端修复和加A：

从而获得末端加A的DNA片段；

2)、接头连接：

包括在步骤1)所得的末端加A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头DNA，从而获得两侧结合上环状发夹接头后的双链DNA(简称加好接头的DNA)；

所述环状发夹结构的接头DNA由环状接头序列、两侧互补序列构建而成(还包括6个碱基的随机序列)；

当步骤1)中提取纯化的血浆游离DNA的量≤10ng时，进行下述步骤3)；

反之，当步骤1)中提取纯化的血浆游离DNA的量＞10ng时，直接进行下述步骤4)；

3)、在步骤2)所得的加好接头的DNA中加入特异性引物I、Phi29酶和缓冲液，在36.8～37.2℃(较佳37℃)进行线性扩增0.5～3小时；

4)、PCR扩增：

在步骤2)所得的连接接头后的DNA中或步骤3)所得的经过扩增的DNA中加入特异性引物II和通用引物以及带有index的测序接头引物P5和P7，进行14～30轮PCR循环扩增，获得扩增产物，所述扩增产物构成所述游离DNA突变位点富集测序文库。

备注：所有反应均在同一反应管中，无需进行转移和纯化。

作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的改进：

该方法还包括步骤5)的文库检测。

作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进：

所述步骤1)为：使用NEB(New England Biolabs，纽英伦)的末端修复和加A模块( Ultra^TM II End Repair/dA-Tailing Module(E7546))对提取纯化的血浆游离DNA进行末端修复和加A，从而获得末端加A的DNA片段。

作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进：所述步骤2)为：

在步骤1)所得的末端加A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头DNA，以及NEB快速连接模块[ Ultra^TM II Ligation Module(E7595)]，最终获得两侧结合上环状发夹接头后的双链DNA(简称加好接头的DNA)，其中包含的连接酶可对游离DNA或***固定后的DNA片段的损伤进行修复。

作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进：所述步骤4)为：步骤3)或步骤2)的所得物通过使用单侧特异性扩增引物结合另一侧的通用接头引物进行特异性PCR并通过高通量测序比对后判断是否存在突变的方法。

作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进：环状发卡接头序列为：PHO-CTACTTGCCTCGACATCCAGCGTGCGGACACATAACGCACTACATCATTCCGTACTCNNNNNNCGAGGCAAGTAGT。

作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进：特异性引物I为特异性扩增引物1_EGFR_p.G598V、特异性扩增引物1_EGFR_p.D761Y、特异性扩增引物1_KRAS_p.Q61K；

对应的特异性引物II为特异性引物2_EGFR_p.G598V、特异性引物2_EGFR_p.D761Y、特异性引物2_KRAS_p.Q61K。

本发明的发明点主要体现为(不仅仅为如下)：

1、步骤2)的环状接头序列以及两侧互补序列的构建方法；

2、步骤3)的利用单链环状结构使用Phi29扩增酶以及特异性引物1序列，对原始DNA样品进行线性环状预扩增。

本发明具有如下技术优势：

1)、只需单向特异性引物，从而解决血浆游离DNA片段短双侧引物设计的局限性，同时可以检测位于DNA片段首尾处的靶位点。

2)、引物设计简单，一个靶位点只需要用一条特异性引物II，避免双侧引物发生的引物互补以及错配。

3)、在环状发卡接头中加入了唯一的barcade，可以评估后续PCR效率，及时纠正PCR循环数和后续数据分析。

4)、相较于原有的捕获和简单多重PCR方法无论是特异性引物设计还是样品起始量要求和实验操作以及成本都大幅降低。此外单链环化之后也可以进行特异性扩增，从而使得对DNA的起始要求大大下降。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为建库方法示意图；

图2为图示及引物序列；

图3为DNA检测结果；

左侧为游离DNA提取检测结果，右侧为marker，最下方的为250bp，可见DNA均位于250bp以下；

图4为本方法建库后PCR产物的电泳结果；

左侧为PCR完成后的文库产物，右侧为marker，最上方的条带为500bp，下方的2条亮带为300和250bp；

图5为本方法和其他方法对比实验结果。

从左至右分别为marker，PCR完成后的尿液样品文库产物，marker，以及建库完成后的肿瘤***固定样品文库，marker中间亮条带为500bp，下方的亮带为300bp。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库方法的前置准备步骤：

1、选取5ml血浆样品，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen55114)，根据试剂盒方法提取游离血浆DNA，最终获得100ul洗脱体积约100ng总量游离DNA片段。为检测本发明对低当量DNA的建库效果，取上述DNA溶液10ul，加水40ul至50ul体积，DNA总量为10ng作为后续步骤样品。

2、将合成的干粉状接头序列，加水溶解，升温至98℃1min，自然降温到室温，退火环状发卡接头序列，并使最终浓度为15uM。

3、本实施例对EGFR基因的p.G598V和p.D761Y以及KRAS基因的p.Q61K三个突变位点进行检测，合成引物见附表1。

实施例1、对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库方法，依次进行以下步骤：

1)、末端修复和加A

按照下表1的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吸吹混匀，使用Ultra^TM II End Repair/dA-Tailing Module(E7546)包括NEBNext Ultra II End PrepEnzyme Mix和NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer两部分，起始游离DNA量的范围在500pg-1ug(例如为10ng)。

表1

NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix	3ul
		NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer	7ul
上述准备步骤所得游离DNA	50ul
		Total	60ul

放置于PCR仪中，设置程序反应：

设置顶盖温度≥75℃

20℃30min

65℃30min

4℃保存；

得末端加A的DNA片段。

2)、接头连接：

按照下表2的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吸吹混匀。

为了促进环化(提高接头连接效率)，根据起始DNA(上述步骤1中的起始游离DNA)的量的不同，需要调配不同浓度的接头，例如表2(稀释使用10mMTris-HCl或10mMTris-HCl加10mMNaCl)：

表2

起始DNA	稀释比例	接头浓度
			1μg–101ng	不稀释	15μM
100ng–5ng	10倍(1:10)	1.5μM
			低于5ng	25倍(1:25)	0.6μM

使用 Ultra^TM II Ligation Module(E7595)包含NEBNext Ultra IILigation Master Mix和NEBNext Ligation Enhancer；反应体系如表3所述。

表3

环状发卡接头的序列如表7所述。

于20℃恒温孵化15分钟，之后37℃恒温孵化15分钟；得加好接头的DNA。

3)、Phi29特异性扩增(可选，当起始DNA少于10ng时)

按照下表4的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吸吹混匀。

表4

phi29 DNA Polymerase(10U/μL)Thermo Scientific^TM EP0091	1ul
		Phi29酶和缓冲液	99ul
步骤2连接接头后的DNA	100ul
		特异性扩增引物1混合池(各引物等比混合，混合引物浓度为0.5uM)	1ul

特异性扩增引物1如表7所述。

在37℃下进行线性扩增0.5小时(当DNA含量<1ng时，扩增时间可以增加到2小时)。此时所得物满足开展第4步PCR扩增的条件。

即，当步骤1)中提取纯化的血浆游离DNA的量＞10ng时，步骤2)所得的加好接头的DNA已经满足第4步PCR扩增的条件。

4)、PCR扩增

按照下表5的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吸吹混匀。

表5

2X KAPA HiFiHotstart Ready Mix(KAPA KK2602)	25ul
		特异性引物2和通用接头引物混合物(各0.1uM)	1ul
P5/P7引物混合物(各10uM)	1ul
		步骤3连接接头后的DNA(或步骤2DNA)	23ul
Total	50ul

上述特异性引物2、通用接头引物、P5/P7引物如表7所述。

放入PCR仪，按下表6设置程序反应

表6

5)、文库检测

将步骤4)中的PCR产物稀释到2ng/ul，取出1ul进行凝胶电泳检测，构建的文库总长度在200-350bp左右；另外，再取出1ul用于qPCR检测量，并根据文库片段长度计算文库浓度(即，当文库浓度达到2nmol/ul以上即为合格)。

上文中所涉及的引物名称和具体序列如表7所述。

表7

其中PHO表示5’磷酸化修饰，-3‘AminolinkerC7代表3’氨基化修饰，N代表随机碱基，-s-代表硫代修饰。

从以上的描述中，可以看出，本发明实现了如下技术效果：

1)本发明在游离DNA片段中加入设计好的环状发卡接头序列，进行连接结合后形成单链环状结构，而环状接头部分引入了可用于扩增的通用引物序列，以及加入了用于后续单分子拷贝数计数用的barcode序列，可以后续计算突变频率时避免PCR扩增偏好的影响。

2)由于DNA形成单链环状DNA，通过加入3‘经过修饰后的特异性引物和Phi29酶，可以通过RDA快速环状复制从而解决了低起始量DNA的建库问题。

3)由于引入的通用引物接头，使得设计多重PCR时仅需要考虑单侧的特异性引物，从而大大降低了引物设计的难度和偏差，本发明可根据检测区段的不同设计特异性引物，特异性引物设计仅需保证其退火温度在60-65℃之间，引物之间和自身不存在发卡结构或形成互补，并引物能特异性结合目标位点即可。而且所有反应均在一个反应管中进行，避免了反复纯化和转移样品导致的污染和损失。

4)整个实验和反应共需3.5小时。如果特异性引物设计为仅能结合突变序列进行扩增的突变特异性扩增引物，即可以实现仅对突变进行扩增从而仅需观察PCR是否存在扩增产物即可定性判断是否存在突变。

5)相较于原有的捕获和对区段使用一对引物的多重PCR方法无论是特异性引物设计还是样品起始量要求和实验操作以及成本都大幅降低。此外单链环化之后也可以对目标区段进行特异性扩增，从而使得对DNA的起始要求大大下降。此外本方法不会对长片段进行扩增，可以有效的避免如游离DNA中掺杂如的血细胞破裂释放的长片段DNA的干扰。

按照上述实施例1提供的方案，具体进行了如下的实验：

实验一

1.表1中的游离DNA为血浆游离DNA，浓度为2ng/ul；

2.表2中的接头浓度为1.5uM；

3.不进行特异性引物扩增的步骤3；表5中的特异性扩增引物2选用的是特异性引物2_EGFR_p.G598V、特异性引物2_EGFR_p.D761Y和特异性引物2_KRAS_p.Q61K；

将所得的PCR产物稀释到2ng/ul，取出1ul进行凝胶电泳检测，检测结果如图4所示，构建的文库总长度在250bp左右；原始的血浆游离DNA的电泳检测结果见图3。

实验二

1.表1中的DNA为肿瘤***固定样品DNA，浓度为15ng/ul；

2.表2中的接头浓度为1.5uM；

3.不进行特异性引物扩增的步骤3；表5中的特异性扩增引物2选用的是特异性引物2_EGFR_p.G598V和特异性引物2_KRAS_p.Q61K；

将所得的PCR产物稀释到2ng/ul，取出1ul进行凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，构建的文库总长度在290bp左右。

实验三

1.表1中的DNA为尿液样品DNA，浓度为3ng/ul；

2.表2中的接头浓度为1.5uM；

3.不进行特异性引物扩增的步骤3；表5中的特异性扩增引物2选用的是特异性引物2_EGFR_p.D761Y和特异性引物2_KRAS_p.Q61K；

将所得的PCR产物稀释到2ng/ul，取出1ul进行凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，构建的文库总长度在320bp左右。

对比实验1、将上述实验1中所用的环状发夹结构的接头DNA改成同等序列的双链DNA接头，其余等同于实验1；

所得结果为：可以扩增出产物，但是产物长度上升至280bp为主。通过测序数据发现，仅5％的数据来自特异性引物扩增产物，其余均为所有游离DNA加入接头的测序产物。而上述实验1中获得的数据99％均来自特异性引物扩增获得的产物。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、末端修复和加A：

从而获得末端加A的DNA片段；

2)、接头连接：

包括在步骤1)所得的末端加A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头DNA，从而获得两侧结合上环状发夹接头后的双链DNA；

所述环状发夹结构的接头DNA由环状接头序列、两侧互补序列构建而成；

3)、在步骤2)所得的加好接头的DNA中加入特异性引物I、Phi29酶和缓冲液，在36.8～37.2℃进行线性扩增0.5～3小时；

4)、PCR扩增：

在步骤2)所得的连接接头后的DNA中或步骤3)所得的经过扩增的DNA中加入特异性引物II和通用引物以及带有index的测序接头引物P5和P7，进行14～30轮PCR循环扩增，获得扩增产物，所述扩增产物构成游离DNA突变位点富集测序文库；

环状发卡接头序列为：PHO-CTACTTGCCTCGACATCCAGCGTGCGGACACATAACGCACTACATCATTCCGTACTCNNNNNNCGAGGCAAGTAGT；

特异性引物I为特异性扩增引物1_EGFR_p.G598V、特异性扩增引物1_EGFR_p.D761Y、特异性扩增引物1_KRAS_p.Q61K；

对应的特异性引物II为特异性引物2_EGFR_p.G598V、特异性引物2_EGFR_p.D761Y、特异性引物2_KRAS_p.Q61K；

特异性扩增引物1_EGFR_p.G598V：

TCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGG-3‘AminolinkerC7；

特异性扩增引物1_EGFR_p.D761Y：

GGGCATGAACTACTTGGAGGAC-3‘AminolinkerC7；

特异性扩增引物1_KRAS_p.Q61K：

TCCTCATGTACTGGTCCCTCA-3‘AminolinkerC7；

特异性引物2_EGFR_p.G598V：

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGG；

特异性引物2_EGFR_p.D761Y：

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCATGAACTACTTGGAGGAC；

特异性引物2_KRAS_p.Q61K：

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCATGTACTGGTCCCTCA。

2.根据权利要求1所述的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，其特征是：

该方法还包括步骤5)的文库检测。

3.根据权利要求1或2所述的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，其特征是：

所述步骤1)为：使用NEB的末端修复和加A模块对提取纯化的血浆游离DNA进行末端修复和加A，从而获得末端加A的DNA片段。

4.根据权利要求1或2所述的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，其特征是：

所述步骤2)为：

在步骤1)所得的末端加A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头DNA，以及NEB快速连接模块，最终获得两侧结合上环状发夹接头后的双链DNA，其中包含的连接酶可对游离DNA或***固定后的DNA片段的损伤进行修复。

5.根据权利要求1或2所述的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法，其特征是：

所述步骤4)为：步骤3)或步骤2)的所得物通过使用单侧特异性扩增引物结合另一侧的通用接头引物进行特异性PCR并通过高通量测序比对后判断是否存在突变的方法。