CN105440132B - 抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。本发明还公开了诊断猪流行性腹泻病毒感染的试剂盒，其包含上述单克隆抗体。本发明还公开了该单克隆抗体的制备方法和应用。本发明抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，与猪流行性腹泻病毒具有良好的反应性，适用于快速准确地诊断PEDV，同时为监测、预防PEDV提供重要的技术支撑，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度接触性猪肠道传染病，此病以猪的呕吐、腹泻、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。1978年，该病在比利时与英国被首次报道。随后，在匈牙利、意大利、中国、日本、泰国、美国和韩国等国家也陆续发现该病。自2010年底以来，PEDV变异体给中国养猪行业造成巨大的经济损失。2013年，美国也爆发PEDV变异病毒。近年来，PEDV是引起中国和美国仔猪死亡的一个重要病原体。PEDV基因组全长约为28kb，包含7个开放阅读框能够编码4个主要的结构蛋白：纤突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope,E)、膜糖蛋白(membrane,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)和3种非结构蛋白：复制酶1a和1b，ORF3。其中N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占的比例较大，具有较强的抗原性，不仅能够诱导宿主T细胞和B细胞免疫反应，而且在病毒感染早期，机体内能够产生较高水平的抗N蛋白抗体(孙东波,冯力,时洪艳,等，2006)。N蛋白为螺旋病毒粒子提供一个结构基础，是一个与基因组相关联的碱性磷蛋白。
猪感染PEDV后，如果仅依据临床症状、病理变化和流行病学很难做出正确的诊断，特别是与传染性胃肠炎(TGE)不易区别，必须依靠实验室技术才能作出正确诊断。目前诊断PEDV感染的方法有间接血凝试验(IHA)、免疫电镜(IEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光(IF)、RT-PCR等，其中免疫荧光和酶联免疫吸附试验较为常见(邓祖丽颖，2013；郑逢梅,赵军,霍金耀,等，2013)。但这些现有的诊断技术较为耗时、耗力，无法在临床上广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于快速准确地诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。
优选的，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
更优选的，所述抗体是由杂交瘤细胞株CCTCC NO.C2014136分泌的单克隆抗体。
在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，其包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
所述重组载体的空载体包括原核表达载体或真核表达载体。
在本发明中，原核表达载体优选pCold I DNA原核表达载体。
在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，其包含上述重组载体。
在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
构建含猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的重组表达载体；
将所述重组表达载体转化入宿主细胞进行诱导表达，得可溶性的猪流行性腹泻病毒重组N蛋白；
将所述重组N蛋白纯化后免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞融合，筛选获得分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞；
将所述杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，即得抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。
在本发明的另一方面，还提供了一种诊断猪流行性腹泻病毒感染的试剂盒，包含上述单克隆抗体。
在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备诊断猪流行性腹泻病毒感染的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备预防猪流行性腹泻病毒感染的产品中的应用。
本发明抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，与猪流行性腹泻病毒具有良好的反应性，适用于快速准确地诊断PEDV，同时为监测、预防PEDV提供重要的技术支撑，具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的PEDV N基因PCR扩增(1A)及构建原核表达载体后PCR(1B)及酶切鉴定(1C)结果图；
图2是本发明实施例1纯化的N蛋白表达产物SDS-PAGE(2A)和重组N蛋白的westernblot(2B)结果图；
图3是本发明实施例3抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗ELISA效价鉴定结果图；
图4是本发明实施例4猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性鉴定图；
图5是本发明实施例5抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗Western blot分析结果图；
图6是本发明实施例5抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗IFA分析结果图。
本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞系，已于2014年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCCNO.C2014136，其分类命名为杂交瘤细胞株2B8。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
为了快速准确地诊断PEDV，本发明研制出了能够与猪流行性腹泻病毒N蛋白具有良好反应性的单克隆抗体。具体通过如下过程获得特异性的单克隆抗体：
1、根据猪流行性腹泻病毒JS-2013株核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长的引物。提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物N-F、N-R扩增全长N基因，将其克隆到Pcold-Ⅰ表达载体上，经酶切、测序鉴定正确后，将该质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达。用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化，获得可溶性重组N蛋白，作为制备后续单克隆抗体的免疫原。
2、将纯化后重组N蛋白作为免疫原，免疫6周龄雌性BABL/c小鼠。首次免疫使用完全弗氏佐剂，二免选用不完全弗氏佐剂，重组N蛋白与弗氏佐剂1:1比例混合，首次免疫蛋白量加倍。第三、四次直接免疫重组N蛋白。融合前3～4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞按5:1的比例融合，筛选阳性杂交瘤细胞，采用有限稀释法经4次亚克隆选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，按106个细胞/只免疫8周龄BABL/c小鼠，7天后采取小鼠腹水，获得单克隆抗体。
实施例1 重组表达猪流行性腹泻病毒N蛋白
根据猪流行性腹泻病毒JS-2013株核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长(1326bp，N基因全长序列如SEQ ID NO.2所示)的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物序列为：N-F：5’-GCTCGGTACCCTCGAGATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATC-3’(SEQID NO.3)；下游引物序列为N-R：5’-ATTCGGATCCCTCGAGTTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCG-3’(SEQ ID NO.4)，酶切位点为Xho I。提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物N-F、N-R扩增全长N基因，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定回收，通过PCR扩增出大小约1300bp的N基因，与预期结果相符(图1A)。载体pCold I DNA用XhoI酶切后与PCR产物各100ng，用5X In-Fusion HD Enzyme Premix50℃连接15min后转化DE3感受态细胞，均匀涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37℃培养14h～16h挑取菌落摇菌，PCR和酶切鉴定重组表达质粒是否正确，PCR鉴定结果如图1B所示，扩增出了大小约1300bp的N基因，酶切鉴定结果如图1C所示，获得了1300bp左右的N基因酶切片段。将PCR鉴定正确的质粒送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。测序结果表明载体构建成功。经测序鉴定正确的阳性表达载体质粒命名为pCold I-N。
原核表达、纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白程序如下：
将鉴定为阳性的pCold I-N/DE3细菌接种2×YT培养基，接种比例1：100，经37℃振荡摇菌至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，15℃继续诱导12h。离心收集菌液并用PBS清洗2遍后，破菌缓冲液重悬后，超声至菌液澄清，离心去除超声沉淀，纯化上清，按照His-Binding-Resin蛋白纯化试剂盒说明书纯化表达的N蛋白，并使用Bradford蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，与PEDV阳性猪血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和ECL显色。SDA-PAGE与Weatern blot结果显示，原核表达纯化的重组蛋白大小约为52kDa，与预期蛋白大小相符(图2)，猪流行性腹泻病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。图2中，图2A为pCold I DNA原核表达载体表达猪流行性腹泻病毒重组N蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，其中M为蛋白质分子量标准；1为0.5mM IPTG诱导表达菌液超声沉淀；2为0.5mM IPTG诱导表达菌液超声上清；3为纯化重组N蛋白；图2B为鼠抗His标签单克隆抗体Western blot鉴定重组蛋白结果图，其中M为蛋白质分子量标准；1为pCold I DNA空载体诱导产物；2为纯化的重组N蛋白。
实施例2 抗猪流行性腹泻病毒N蛋白鼠源单克隆抗体的制备
如实施例1中纯化制备的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为免疫原，免疫小鼠，用于制备单克隆抗体。选择6周龄BABL/c雌性小鼠，免疫表达纯化的N蛋白。首次免疫以纯化的N蛋白作为免疫原，与弗氏完全佐剂1:1比例混合后，按50ug/只(200ul/只)的抗原量经腹腔注射。两周后，再经腹腔注射，用弗氏不完全佐剂处理同一剂量抗原，每隔两周重复免疫一次。每次免疫前，眼眶采血，ELISA鉴定抗体效价。第三次免疫开始，不加佐剂。融合前3～4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，进行单克隆抗体制备。融合两周后，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，具体方法如下：
1、包被：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pCold I DNA表达载体His标签蛋白分别包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100μL，4℃包被过夜。
2、洗涤：用含有5‰tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
3、封闭：5％脱脂乳37℃孵育2小时，200μL/孔。
4、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
5、加细胞培养上清液：细胞培养上清分别加入包被重组N蛋白与His标签蛋白的酶标板，每孔培养上清液50μL，脱脂乳50μL，混匀，37℃培养箱作用1小时。
6、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
7、加入二抗：用5％脱脂乳按1：10000倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育1小时。
8、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
9、显色：每孔加入50μL TMB显色液，避光室温孵育10分钟。
10、终止：每孔加入50μL 2M H2SO4。
11、OD值检测：酶标仪测定OD450值。
经过重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pCold I DNA载体标签蛋白双重ELISA筛选后，选取载体标签蛋白反应阴性、重组N蛋白反应阳性的克隆，扩大培养后进行4次亚克隆，每次亚克隆后均进行双重ELISA筛选鉴定阳性克隆。4次亚克隆后，获得3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。最后优选其中一株杂交瘤细胞株2B8于2014年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO.C2014136，其分类命名为杂交瘤细胞株2B8。筛选的阳性杂交瘤细胞经扩大培养，用于单抗腹水制备。
单抗腹水制备，具体步骤如下：选取8周龄BABL/c雌性小鼠，腹腔注射降植烷，200μL/只。免疫降植烷一周后，阳性杂交瘤细胞计数，基础DMEM培养基重悬，106/只接种小鼠腹腔。一周后观察小鼠腹部变化，若出现腹部胀大，即进行腹水采集，采集腹水4,000rpm/min离心10min，上清分装-80℃保存。
实施例3 抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体ELISA效价鉴定
如实施例2中制备的腹水，作为一抗，间接ELISA方法检测腹水的ELISA效价，具体方法如下：
1、包被：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pCold I DNA表达载体His标签蛋白分别包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100μL，4℃包被过夜。
2、洗涤：用含有5‰tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
3、封闭：5％脱脂乳37℃孵育2小时，200μL/孔。
4、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
5、加入一抗：采用5％脱脂乳将采集的腹水按照1:10000稀释后，分别加入包被重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与His标签蛋白的酶标板，每孔100μL，37℃作用1小时。
6、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
7、加入二抗：用5％脱脂乳按1：10000倍稀释后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育1小时。
8、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。
9、显色：每孔加入50μL TMB显色液，避光室温孵育10分钟。
10、终止：每孔加入50μL 2M H2SO4。
11、OD值检测：酶标仪测定OD450值。
结果如图3所示，腹水效价OD450结果显示为1.491。图3中，MAb为抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体；阳性血清为纯化重组N蛋白免疫4次后BABL/c小鼠血清；阴性血清为未免疫BABL/c小鼠血清；His标签蛋白为pCold I DNA空载体诱导纯化后获得的标签蛋白。
实施例4 抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性鉴定
如实施例2中制备的腹水，作为一抗，检测抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的特异反应性。具体操作如下：
收取细胞样品：从中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室，获得猪瘟病毒(CSFV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，猪伪狂犬病毒(PRV)，乙型脑炎病毒(JEV)感染的细胞样品，与猪流行性腹泻病毒JS-2013感染的Vero细胞样品。按照4:1体积比混合5×样品缓冲液，煮沸10min后，-20℃保存备用。
Western blotting：10μL等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，采用伯乐半干转膜仪，电压15V，转印50min，将蛋白转印至硝酸纤维膜(NC膜)上。转印完毕后进行后续实验具体操作如下：
1、封闭：用5％脱脂乳室温封闭NC膜1小时。
2、洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。
3、加入一抗：实施例2中制备的腹水，用含有5％BSA的TBST缓冲溶液按照1:500-1000的比例稀释一抗，室温作用1小时或4℃孵育过夜。
4、洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。
5、加入二抗：中杉金桥公司HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，用TBST按1：6000倍稀释后加入，室温作用1h。
6、洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。
7、显影：采用Thermo公司ECL发光试剂盒进行曝光显影。
结果如图4所示，实施例2制备的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的特异性好。图4中，PEDV为猪流行性腹泻病毒；PRRS为猪繁殖与呼吸综合征病毒；JEV为乙型脑炎病毒；CSFV为猪瘟病毒；PRV为猪伪狂犬病毒。
实施例5 用间接免疫荧光法和Western blotting分别检测抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的特异性
如实施例2中制备的腹水，作为一抗，分别用间接免疫荧光法(IFA)和Westernblotting检测腹水的特异性反应性，IFA的具体步骤如下：
1、细胞感染PEDV：6孔细胞培养板中铺满vero细胞，用PEDV感染vero细胞，12h后，用冰甲醛于-20℃固定10min；
2、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；
3、封闭：含有5％BSA的PBS缓冲溶液37℃孵育1小时；
4、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；
5、加入一抗：实施例2中制备的腹水，用PBS缓冲溶液按照1:1000-4000的比例稀释一抗，SP2/0细胞培养上清液做阴性对照，37℃孵育1小时；
6、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；
7、加入二抗：FITC羊抗鼠IgG购自Sigma公司，用PBS按1：1000倍稀释后加入六孔板，避光37℃孵育1小时；
8、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；
9、荧光显微镜观察。
Western blotting实验步骤同实施例4。
Western blot结果如图5所示，图5中，1为SP2/0细胞培养上清液对感染PEDV的vero细胞进行Western blot结果；2为抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体MAb 2B8对感染PEDV的vero细胞进行Western blot结果。
IFA结果如图6所示，图6中，5A为MAb 2B8对感染PEDV的vero细胞进行间接免疫荧光染色结果，细胞胞浆及胞膜呈闪亮绿色荧光反应；5B为SP2/0细胞培养上清液对感染PEDV的vero细胞进行间接免疫荧光染色结果，细胞未见有亮绿色荧光染色。
由以上实验结果可知，本发明的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性很好，适用于早期快速诊断PEDV。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述抗体是由杂交瘤细胞株CCTCC NO.C2014136分泌的单克隆抗体。
2.一种诊断猪流行性腹泻病毒感染的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体。
3.权利要求1所述单克隆抗体在制备诊断猪流行性腹泻病毒感染的产品中的应用。
4.权利要求1所述单克隆抗体在制备预防猪流行性腹泻病毒感染的产品中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20190329 Termination date: 20200807 |