CN105435244A - Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种携带Lin28a基因的重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用。将Lin28a基因***到腺相关病毒载体上，获得一携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。本发明公开的重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑制瘢痕形成。

Description

Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用。

背景技术

目前，各种创伤、烧伤、手术切口的愈合仍然是临床存在的一大难题，尤其是局部放疗伤口的愈合、糖尿病人伤口的愈合、大面积烧伤或褥疮等难愈合伤口的愈合，给患者造成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担。创伤修复是个复杂而渐进的过程，而以往的研究基本停留在等待伤口自愈阶段，而缺乏促进创伤修复的积极措施。

Lin28是存在于高等真核生物中的一种保守RNA结合蛋白，它是可以将人类体细胞重新编程为多潜能干细胞的四种多能性因子之一，在调节细胞生长分化、新陈代谢以及细胞多能性等方面起重要作用。在哺乳动物基因组中，存在两个同源基因Lin28a与Lin28b，两者序列相似度高达76%。Lin28a与Lin28b虽然在核酸序列上具有极高的相似性，但其在细胞中的定位及具体功能却有差异。在人类基因组中Lin28a定位于染色体1p36.11，蛋白质编码区含有209个氨基酸残基，其同源蛋白基因Lin28b定位于染色体6p21，编码一个含有250个氨基酸残基的小分子蛋白质。由于Lin28a与Lin28b在功能上存在一定的差异，导致表达细胞的类型也具有一定的特异性：Lin28b与多种癌症的触发、转移相关，并在多种癌细胞系中呈现出高表达状态，提示其可能成为癌症发生预测的标志性分子；Lin28a的主要功能是调控细胞的分化过程，因此广泛表达于胚胎干细胞与早期胚胎形成时的细胞中，Lin28a基因可通过调控糖酵解和氧化磷酸化反应加强葡萄糖氧化代谢，能激活胶原蛋白，新生的胶原蛋白能重新建立起胶原支架，提示Lin28a基因具有促进创伤修复能力。

腺相关病毒（AAV）是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。近年来用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。这是由于AAV具有以下特点：（1）安全性好：迄今从未发现野生型AAV对人体致病；重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；（2）宿主范围广：不仅可转导***细胞，而且可转导静止期细胞；（3）野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置，利用这一特点，有可能研制出具有特异性整合功能的AAV载体；（4）AAV-2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作；（5）物理性质稳定：在60°C不能被灭活，能抗氯仿；（6）重组AAV（rAAV）可长期稳定地表达外源基因。腺相关病毒对许多哺乳动物细胞都比较易感，能够转染的细胞种类也比较多，无论是细胞系，还是原代培养的贴壁细胞，亦或是常规转染试剂难以转染的细胞类型，腺相关病毒都有很好的转染效率，与质粒转染相比，具有瞬时转染基因转移效率更高的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供携带Lin28a基因的重组腺相关病毒（AAV-Lin28a），将Lin28a基因构建入腺相关病毒载体，用于Lin28a基因的过表达，该AAV-Lin28a能促进创伤修复。

本发明提供的Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用，通过以下技术方案来实现：

1.人工合成Lin28a全基因组；

2.将Lin28a基因***到腺相关病毒载体上，利用pHelper质粒包装***共转染细胞，获得重组腺相关病毒AAV-Lin28a，进一步得到病毒浓缩液；

3.建立皮肤表面创伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进皮肤创伤愈合；

4.建立度烧伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进深度烧伤的真皮再生，并能抑制皮肤瘢痕形成；

5.建立骨损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进骨损伤修复；

6.建立软组织损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进软组织损伤修复。

本发明的有益效果在于：本发明将Lin28a基因***到腺相关病毒载体上，获得一携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。该重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑制瘢痕形成。

附图说明

附图1为三组动物皮肤创伤愈合率的变化趋势图。

附图2为皮肤HE染色效果图（A：AAV-Lin28a；B：AAV-MCS；C：PBS）。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明作更详细的说明，有必要指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

实施例

实施例1重组腺相关病毒的制备。

构建重组腺相关病毒载体。

由上海生物工程有限公司全基因合成Lin28a基因，构建到pUC57载体中，得到pUC57-Lin28a质粒（测序结果见SEQIDNO.1）。

采用限制性内切酶EcoRI和BamHI（购自Takara公司）双酶切pUC57-Lin28a和pAAV-MCS腺相关病毒载体(购自Stratagene公司)，酶切体系为：pAAV-MCS/pUC57-Lin28a质粒：10ul，EcoRI：3ul，BamHI：3ul，buffer：4ul，H₂O：20ul。37℃水浴30min，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收Lin28a基因片段和pAAV-MCS载体骨架（操作步骤参照Takara琼脂糖核酸纯化回收试剂盒说明书）。

将Lin28a基因***酶切回收pAAV-MCS载体中（具体步骤参照Takara公司DNALigationKitVer.2.1试剂盒说明书），连接体系为：Lin28a回收产物：2.5ul，pAAV-MCS回收产物：2.5ul，SolutionI：5ul。16℃孵育30min，取连接产物10ul加入100ulDH5α感受态细胞（购自Takara公司）中吹打均匀，冰上静置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰中，静置3min，加入500ulLB液体培养基，180rpm、37℃振荡培养1h，取菌液100ul均匀涂布于LB固体培养基（含1/1000氨苄青霉素），37℃培养过夜。挑取单克隆菌落于5mlLB培养基（含1/1000氨苄青霉素）中，180rpm37℃培养12h后提取质粒（操作步骤参照Takara质粒提取试剂盒说明书）。

取样送至上海生物工程有限公司测序验证确认正确。将构建的质粒命名为pAAV-Lin28a。

细胞株293FT的复苏与培养。

取液氮冻存的293FT细胞株（购自Clontech公司），迅速放于37℃水浴中解冻，期间不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀；解冻后迅速加入7mL体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中（DMEM培养液需要提前预热至37℃），枪头轻轻吹打至无细胞团存在，然后在1300rpm条件下离心6min，弃去上清；再向离心管中加2mL提前预热至37℃体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞使其悬浮，按照5×10⁴个细胞将细胞接种于培养皿，并于37℃、含5%的CO₂培养箱中培养24h，然后换液，以后每隔2天换液至细胞密度达90%时传代。

病毒包装。

转染前一天，按照每瓶4×10⁵个293FT细胞接种到培养瓶中，培养24h后细胞约有70%融合，转染前4h，用无双抗PBS清洗2次细胞，将含血清的培养液换为无双抗、无血清的优化培养液Opti-MEM（2mL/瓶）；Lipofectamine^TM2000（购自Invitrogen公司）作为转染试剂将Lin28a转染至293FT细胞，具体步骤依照说明书进行，转染体系为：pHelper：10ug，pAAV-RC：10ug，pAAV-Lin28a：10ug，Lipofectamine2000：60ug，Opti-MEM：2ml。

病毒收毒。

病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率：

1)准备一个干冰乙醇浴（将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴）和37°C水浴；

2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；

3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清液另外存放，细胞用1mlPBS重悬；

4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。

病毒浓缩

1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清液转移到一个新离心管中；

2)将两次收集的上清混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质；

3)加入1/2体积的1MNaCl，10%PEG8000溶液，混合均匀，4℃过夜；

4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌；

5）加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA（终浓度为50U/ml）。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；

6）用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒。

病毒包装滴度测定（采用Q-PCR法）

1）取20ul浓缩病毒液，加入1ulRNase-freeDNase，混匀，37℃水浴反应30min；

2）4℃，12000rpm/min，离心10min，取10ul上清到另一个无菌的1.5mlEP管中；

3）加入90ulDilutionBuffer（1mMTris-HCl,pH8.0，0.1mMEDTA，150mMNaCl），混匀，37℃金属浴反应30min；

4）自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h；

5）100℃金属浴反应10min，自然冷却至室温；

6）进行Q-PCR检测滴度。

包装出的重组腺相关病毒命名为AAV-Lin28a，滴度为2.8×10¹¹，采用同样的方法包装空载体质粒pAAV-MCS，命名为AAV-MCS，滴度为1.9×10¹¹。病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。

收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃保存。

实施例2Lin28a基因过表达腺相关病毒对皮肤创伤愈合的影响。

实验动物创伤模型制作。

将Wistar种健康大鼠(购自南方医院实验动物中心)随机分为3组，每组10只，称重标记。将WISTAR大鼠适用性喂养1周，实验前一天脱毛、称重。2%戊巴比妥钠溶液（40mg/kg体重）腹腔麻醉后，在两侧背部作3个直径1cm的圆形皮肤全层伤口，各伤口中心之间距离为1.5cm。无菌纱布包扎创面。隔日去除包扎暴露创面，术后肌注青霉素一周预防抗炎并密切观察局部情况。术后分别在创口基底部及灶内注射0.2×10⁸pfu的AAV-Lin28a或0.2×10⁸pfu的AAV-MCS病毒液，以PBS缓冲液作为对照。致伤后大鼠单笼喂养，饮食自取。

伤口表面状态观察及伤口残余面积测定。

在伤后1、3、5、7、9、11、13、15天用透明薄膜覆盖创面，描摹创面面积，沿边缘剪膜，置于万分之一分析天平上称重，换算创面面积，计算创面愈合率，评价大鼠创面愈合速度。

伤后第15天，用游标卡尺测量每个创口愈合后皮肤全层厚及其临近无创伤处皮肤全层厚，计算肥大指数（HypertrophicIndex，HI）(HI=愈合皮肤全层厚/临近皮肤全层厚)。

术后1-3天，AAV-MCS组和PBS组大鼠伤口出现少量渗出和出血，伤口周围皮肤稍红肿，3天后创面逐渐干燥，有伽形成，伤口范围逐渐变小，术后12天开始第一次脱伽；AAV-Lin28a组大鼠在注射病毒液当天伤口表面即干燥，无明显渗出和分泌物，注射后第2天创面已出现明显收缩、变小，术后7天开始第一次脱伽，露出的肉芽组织新鲜，无明显出血，术后大鼠平均创面愈合率变化趋势如附图1所示。同时计算每个瘢的肥大指数，作为愈合质量的一个指标，肥大指数与瘢痕的大小呈正比，结果显示AAV-Lin28a组肥大指数较AAV-MCS组、PBS组小，即形成的瘢痕小。实验结果表明，AAV-Lin28a能明显促进小鼠皮肤创伤愈合并能抑制皮肤瘢痕的形成。

实施例3Lin28a基因过表达腺相关病毒对烧伤修复的影响。

实验动物度烧伤模型制作。

将C57BL/6小鼠（中科院上海实验动物中心）随机分为3组，每组10只，称重标记，体重均在20g以上。将小鼠适用性喂养1周，实验前一天剃毛、称重。2%戊巴比妥钠溶液（40mg/kg体重）腹腔麻醉后，将四肢和尾根部用通气胶带固定于超净台上。将水浸湿的自制控制烧伤面积的硬纸片（取约1mm厚硬纸片，裁成7cm×9cm大小，在纸片中心用刀片刻出2cm×1.5cm=3cm²面积的长方形窗口）放在小鼠背部，露出剃毛区，在纸片窗口内用滴管滴加95%酒精，浸满皮肤，用大镊子压住纸片，打火机点火，着火燃烧20s后用湿纱布熄火。

烧伤表面状态观察及皮肤病理学检查。

术后即刻将6×10⁸pfu的AAV-Lin28a、6×10⁸pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS一次性一次涂抹于伤口表面。涂抹重组腺相关病毒后，每天观察各组伤口愈合情况，并用透明薄膜覆盖创面，描摹创面面积，沿边缘剪膜，置于万分之一分析天平上称重，换算烧伤面积，计算烧伤愈合率，评价小鼠烧伤愈合速度。

至15天时处死全部小鼠，将烧伤创面连同周边皮肤约0.5cm取下，平铺于滤纸上，然后固定于10%***内，纵向切取宽约3-4mm皮肤，按常规制备石蜡切片，切片厚度为5μm，进行苏木素-伊红（HE）染色，100×显微镜下观察皮肤HE染色切片。

实验结果表明：涂抹重组腺病毒后第6天，大体外观即可观察到AAV-Lin28a组小鼠创口愈合速度较AAV-MCS及PBS组快，至第8天时，AAV-Lin28a、AAV-MCS和PBS三组小鼠创口未愈合率分别为69.36％，34.66％和32.58％。至第18天时，涂抹AAV-Lin28a组创口已全部愈合(10/10)，而AAV-MCS及PBS组各有5/10和6/10个烧伤创口明显地未完全愈合。而且AAV-Lin28a组创口愈合较为平坦，有的甚至与周围邻近正常皮肤完全相同，而AAV-MCS及PBS组均明显增厚。

到第15天时，涂抹AAV-Lin28a组小鼠表皮已全部脱伽，只有2/20个尚未完全再表皮化，显微镜下观察到表皮及整齐排列的细胞、血管、皮脂腺、毛囊等结构完整，真皮中纤维薄且排列整齐，细胞核、包浆等色泽良好，表皮角化轻（附图2A），说明AAV-Lin28a能促进深度烧伤的真皮再生；而AAV-MCS组（附图2B）及PBS组（附图2C）各有5/10个和6/10未完全再表皮化，表皮结痂及部分的真皮变性坏死，残存的毛囊、皮脂腺、汗腺、胶原纤维变得疏松且排列紊乱。

实施例4Lin28a基因过表达腺相关病毒对骨损伤修复的影响。

将Wistar种健康大鼠(购自南方医院实验动物中心)随机分为3组，每组10只，称重标记。2%戊巴比妥钠溶液（40mg/kg体重）腹腔麻醉后，暴露大鼠股骨，用钢锯将股骨锯开，以达到骨髓渗出为度，将创口缝合。术后第二天开始在创口处局部注射10⁹pfu的AAV-Lin28a、10⁹pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS，每天1次。连续给药42天后，将动物处死。

取血清测定碱性磷酸酶（AKP）活性、血清钙、血清磷水平(按试剂盒说明进行，试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），同时分离被锯开的股骨进行X光拍片，用ImagePrPlus5.1测量骨痂面积、密度和骨痂综合强度。实验结果如下表所示。

血清中碱性磷酸酶增加就表示成骨细胞的成骨活性增强，骨折愈合的标志是骨折处出现骨痂。由上表可看出，AAV-Lin28a组大鼠血清碱性磷酸酶活性均有所提高，骨痂面积、密度和骨痂综合强度均有增加，与AAV-MCS组和PBS比较差异均有统计学意义(P<0.05)，显示其能促进骨痂生成，提高骨痂质量，有促进骨折愈合的作用。

实施例5Lin28a基因过表达腺相关病毒对软组织损伤修复的影响。

Wistar种健康大鼠(购自南方医院实验动物中心)30只随机分为3组，每组10只，用自制的冲击装置在30era高处，用200g砝码，从上向下自由落下，经砧木锤间接撞击大鼠右下肢软组织3次，造成面积约1cm²大小的非开放性软组织损伤模型。术后第二天开始在创伤处局部注射10⁹pfu的AAV-Lin28a、10⁹pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS，连续给药10天，末次给药后24小时处死大鼠，按以下分级标准观察记录软组织损伤程度，进行评分。显微镜下观察：“一”无明显病理组织学改变；“+”皮下及肌纤维轻度水肿、瘀血，仅见散在嗜中性白细胞等炎性细胞浸润；“++”皮下及肌纤维间中度水肿、少许肌纤维变性坏死，有明显的嗜中性白细胞浸润；“+++”皮下及肌纤维严重水肿、大量肌纤维变性坏死及炎性细胞浸润，或炎性肉芽组织增生。

实验结果如下表所示，结果显示AAV-Lin28a能有效减少急性软组织损伤的水肿，加速瘀血的吸收，促进损伤的修复。

SEQUENCELISTING

<110>重庆高圣生物医药有限责任公司

<120>Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用

<130>2015

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>630

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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Claims (6)

1.重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用，其中所述重组腺相关病毒携带Lin28a基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进皮肤创伤愈合。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进深度烧伤的真皮再生。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于抑制皮肤瘢痕形成。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进骨损伤修复。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进软组织损伤修复。