CN105424671B - 一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法 - Google Patents

一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，属于藻液测定的技术领域，首先采用供试藻液制备藻液样品，然后用荧光法测定藻液样品中的叶绿素即可，先将供试藻液进行离心处理，然后将离心处理得到藻体与悬浮稳定剂配置成藻液样品，其中所述的悬浮稳定剂由琼脂、黄原胶和卡拉胶组成。本发明通过在荧光检测过程中，将检测的藻液加入了悬浮稳定剂，通过荧光测定各参数，荧光值的衰减率小、波动小，表明藻液的悬浮稳定性高、藻液体系稳定，对藻液的测定更准确。

Description

一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法
技术领域
本发明属于水样叶绿素含量测定的技术领域，涉及一种荧光法测定水样叶绿素含量的方法，更具体的为一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，本方法增加了藻液的悬浮性、稳定性，得到分散均匀的藻液样品。
背景技术
水体中叶绿素a含量是水体水质环境监测中的常规监测项目、是水体富营养化指标之一，在一定程度上反应水体中藻类数量和水质状况。叶绿素a含量精确测定尤为重要。荧光分光光度法由于灵敏度高，操作简单，可连续实时、监测，且实现了水体中叶绿素的实时原位分析，是实验室测定叶绿素a实现对浮游植物的定量测定的最为常用的方法。
在实际样品叶绿素测定过程中存在着藻细胞分散不均匀、易沉降、悬浮稳定性性差等诸多问题，造成荧光检测叶绿素a含量测定准确度不高，无法用荧光值准确反应藻液浓度，这一直是水样叶绿素测定的一个问题。实验过程中发现现有技术荧光检测法直接测定藻液样品及实际水样时，藻细胞沉降明显、测量值随时间变化较大得到的数据不准确，无法正确判断出水质环境，因此正确测量水质环境至关重要。因此，降低已分散的藻细胞的沉降速度，增加藻液的悬浮性、稳定性得到分散均匀的藻液样品成为研究的重点。
发明内容
本发明为解决现有技术用荧光法测定水体样叶绿素含量时，由于藻细胞在水体中不均匀、易沉降、悬浮体系不稳定，测量结果不准确、误差大的问题，提供了一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，有效解决了上述问题。
本发明为实现其目的采用的技术方案是：
一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，首先采用供试藻液制备藻液样品，然后用荧光法对叶绿素进行测定即可，先将供试藻液进行离心处理，然后将离心处理得到藻体与悬浮稳定剂配置成藻液样品，其中所述的悬浮稳定剂由琼脂、黄原胶和卡拉胶组成。
取供试藻液置于离心机中，以3500-4500r/min的转速离心15-20min，然后倒掉上清液，得到藻体。
所述的悬浮稳定剂中琼脂：黄原胶：卡拉胶的含量比为(2-10)：(10-30)：(30-50)，且样品藻液中琼脂的浓度为0.06％。
所述的悬浮稳定剂中琼脂：黄原胶：卡拉胶的含量比为3：7.5：17.5，且样品藻液中琼脂的浓度为0.06％。
所述的供试藻液为蛋白核小球藻藻液，作为实验室培养藻液样品，在离心处理之前，先将蛋白核小球藻藻液中蛋白核小球藻接种在盛有灭菌BG-11培养液的锥形瓶中进行培养。
所述的供试藻液取自人工湖水样，作为实际水样，当取自人工湖水样为供试藻液时，采样后要立即用于制备藻液样品，或者如需放置则每升水样中加入1mL1％碳酸镁悬浮液以防止叶绿素酸化，并于4℃冰箱中避光保存。
本发明的有益效果是：本发明通过在荧光检测过程中，创造性的将检测的藻液加入了悬浮稳定剂，通过荧光测定各参数，荧光值的衰减率小、波动小，表明藻液的悬浮稳定性高、藻液体系稳定，对藻液的测定更准确。
经过长期的创造性研究，发明人发现不同的悬浮稳定剂之间，即使溶液的粘度相同或相近，液体悬浮稳定性也不相同，甚至差异跟大，但悬浮性与稳定性之间相关显著，藻液的悬浮稳定性对藻液的测定有极大的影响，通过长期的创造性研究本发明选用琼脂、黄原胶、卡拉胶为悬浮稳定剂，也是流变助剂，主要用于改善和增加液体的粘稠度，从而改变溶液的物理性状，保持流体的稳定性，具有乳化、均质、稳定及呈现悬浮状态的作用。而现有技术中对藻液的测定并未考虑悬浮稳定性，其基本都在考虑杂质和吸光度的问题、以及通过测量器械的精密度来进行，没有任何藻液悬浮性的问题。
具体实施方式
本发明为解决现有技术用荧光法测定水体叶绿素时，由于藻细胞在水体中不均匀、易沉降、悬浮体系不稳定，测量结果不准确、误差大的问题，提供了一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，有效解决了上述问题，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
一、实验仪器与试剂
仪器：光照培养箱(E-30B0美国Percival)；可见分光光度计(722型上海光谱仪器有限公司)；离心机(Z323型Hermle)；紫外分光光度计(UV-2600上海天美科学仪器有限公司)；荧光分光光度计(RF-5301日本岛津公司)。
试剂：盐酸1mol.L-1；培养基为灭菌BG-11培养液；10g.L-1的碳酸镁悬 浮液。
悬浮剂：琼脂，食品级；黄原胶，食品级；卡拉胶，食品级。
荧光分光光度计荧光测定参数设定：激发波长为436.0nm；发射波长为672.0nm；激发和发射狭缝宽度均为5.0nm；灵敏度：high；响应时间：Auto。
实施例1.以蛋白核小球藻为供试藻
选取的蛋白核小球藻(购买自中国科学院野生生物质库——淡水藻种库)为藻种，将藻种接种在盛有灭菌BG-11培养液的锥形瓶中，然后将锥形瓶置于E-30B0光照培养箱中培养，培养条件为：培养温度25℃，光照条件2000lx，时间设置为12h昼/12h夜，湿度条件75％RH，藻种静置培养，每日摇动锥形瓶2次同时更改锥形瓶位置，十日后同时取出作为供试藻液；
取25mL供试藻液置于离心机中，以4000r/min的转速离心15min，然后倒掉上清液，得到藻体，然后将得到的藻体与悬浮稳定剂、水配置成藻液样品，已配置100mL藻液样品为例，其中琼脂的浓度为0.06％，黄原胶的浓度为0.2％，卡拉胶的浓度为0.4％；然后用荧光法对藻液进行测定。
二、蛋白核小球藻藻液标准曲线的建立
依据物质的分子吸收光谱以及荧光光谱跃迁原理，在激发波长为436nm，叶绿素a发出672nm的荧光，激发光稳定时荧光强度只与藻液的浓度有相关关系，可在该激发和发射波长下测定藻液的浓度。但由于藻液浓度过低荧光值较小测量时存在误差不容忽略、藻液浓度过高时荧光值因发生了浓度淬灭而呈缓慢上升趋势甚至下降造成数值不准确。因此要根据 蛋白核小球藻的标准曲线确定其对应的最优D(663nm)范围及对应的荧光强度值范围。
取对数生长期的蛋白核小球藻藻液，用灭菌的BG-11培养基进行稀释，稀释倍数为1-20，用722型可见分光光度计于663nm的叶绿素a特征吸收波长处测定藻样品系列的吸光度值；用RF5301荧光分光光度计在已设定的荧光测定参数下测定藻样品系列的荧光强度值，绘制蛋白核小球藻的荧光强度值随其浓度(用叶绿素a特征波长处的吸光度值反应)的变化情况。
利用722型分光光度计与岛津RF5301荧光分光光度计测定不同浓度活体藻样品在最优吸收波长处的吸光度值和荧光强度的关系，得出了蛋白核小球藻样品的D(663nm)在0.3～0.8范围内时与荧光强度值呈良好的正相关，对应的荧光强度范围为40～77。
三、确定悬浮稳定剂的特征吸收
使用UV—2600型紫外可见分光光度计于室温下扫描0.1％琼脂溶液、0.3％黄原胶溶液和0.5％卡拉胶溶液，在220～900nm波长范围内的吸光度值，确定无特征吸收。因此琼脂、黄原胶和卡拉胶的添加对藻体光密度测定结果无影响。
四、静置时间对荧光值测定的影响
本实验的目的是：看在一定时间内藻细胞是否沉淀，悬浮效果是否好：取25mL蛋白核小球藻藻液，用灭菌的BG-11培养基定容至100mL，灭菌的BG-11培养基作为空白参比，使用岛津RF5301荧光分光光度计在已设定的荧光测定参数下，测得初始荧光强度值F0＝89.383，每隔1min测定一次藻原液的荧光强度。建立测量间隔时间(T)与荧光值(F)间的关系曲 线，建立测量间隔时间与荧光值间的关系表，见表1
表1 测量间隔时间与荧光值间的关系
由表1可知，荧光值随测量间隔时间变化较大，T＝1min时，荧光值的衰减率达△F/F0＝8.75％，测量值存在较大误差。这是因为藻细胞在静置1min内沉降较快，5min后藻原液体系基本趋于稳定，因此要求测定样品前必须摇匀、测量时要求快速，以减小因藻细胞因沉降造成的误差。
五、悬浮稳定剂的藻液样品稳定性研究
选取3种悬浮稳定剂，首先以单一的悬浮稳定剂进行实验，琼脂粉(0.02-0.10g/100mL)、黄原胶(0.10-0.30g/100mL)和卡拉胶(0.30-0.50g/100mL)。根据藻液样品中的藻细胞含量及相关悬浮稳定剂的使用剂量标准，选取不同浓度梯度进行平行实验。初步确定适合蛋白核小球藻的稳定剂后，再进行细化实验，确定各稳定剂添加量及悬浮效果，如表2-表4所示。
5.1琼脂对藻液样品稳定性的研究
取5份生长状况相同的蛋白核小球藻液，每份25mL，在4000r/min转速下离心15min，然后取出藻体分别用不同浓度的琼脂溶液A1 #、A2 #、A3 #、A4 #、A5 #定容至100mL，作为藻液样品。使用岛津RF5301荧光分光光度计在确定 的荧光测定参数下每隔1min测定一次样品的荧光强度值，并求其衰减率，并记录衰减率达到5％的时间。
表2 琼脂对藻液样品悬浮稳定性的影响
由表2可知，以琼脂粉作悬浮稳定剂，使其添加量在0.08-0.10g/100mL范围内，可使蛋白核小球藻悬浮均匀，藻悬浮体系的稳定性好。
5.2黄原胶对藻液样品稳定性的研究
取5份生长状况相同的蛋白核小球藻液，每份25mL，在4000r.min-1转速下离心15min，然后取出藻体分别用不同浓度的黄原胶溶液C1 #、C2 #、C3 #、C4 #、C5 #定容至100mL，使用岛津RF5301荧光分光光度计在确定的荧光测定参数下每隔1min测定一次样品的荧光强度值，并求其衰减率，并记录衰减率达到5％的时间。
表3 黄原胶对藻液样品悬浮稳定性的影响
由表3可知，以黄原胶作悬浮稳定剂，使其添加量为0.25-0.30g/100mL，可使蛋白核小球藻悬浮均匀，藻悬浮体系稳定性好。
5.3卡拉胶对藻液样品稳定性的研究
取5份生长状况相同的蛋白核小球藻液，每份25mL，在4000r.min-1转速下离心15min，然后取出藻体分别用不同浓度的卡拉胶溶液D1 #、D2 #、D3 #、D4 #、D5 #定容至100mL，使用岛津RF5301荧光分光光度计在确定的荧光测定参数下每隔1min测定一次样品的荧光强度值，并求其衰减率，并记录衰减率达到5％的时间。
表4 卡拉胶对藻液样品悬浮稳定性的影响
由表4可知，以卡拉胶作悬浮稳定剂，使其添加量为0.45-0.50g/100mL，可使蛋白核小球藻悬浮均匀，藻悬浮体系稳定性好，透明度好。
5.4复合悬浮稳定剂的藻液样品稳定性研究
在单因素实验的基础上，对琼脂、黄原胶、卡拉胶三种悬浮稳定剂进行综合研究。以琼脂与黄原胶组合其流动性和悬浮稳定能力强，但久置会出现上清液。配置复合悬浮剂，即琼脂、黄原胶、卡拉胶进行综合研究， 优化藻液样品稳定体系。
表5 复合悬浮剂正交试验因素与水平
表6 复合悬浮剂正交试验结果
根据表5、表6正交试验的结果，由极差分析R1＞R2＞R3可知，在试验范围内复合悬浮剂中对藻液悬浮稳定效果影响由大到小的因素依次为： 琼脂＞黄原胶＞卡拉胶，配方A3B2C2为最优组合，即琼脂0.06％、黄原胶0.15％、卡拉胶0.35％，此时荧光值的变化率为-1.16％.
实施例2.实际水样为供试藻
采集河北科技大学人工湖水4L作为实际水样，平均分为4份，得到水样1、水样2、水样3、水样4，置于离心机中进行离心，倒掉上清液得到藻体，将藻体与悬浮稳定剂、水进行配置，定容到100mL，充分搅拌，使藻细胞均匀分布在悬浮液体中，得到藻液样品。用RF5301荧光分光光度计测定藻液样品的荧光强度值，通过其荧光值强度反应水体中藻含量，并根据荧光强度值的变化率、及测量值的相对标准偏差，反映藻液样品溶液的悬浮稳定性。
实际水样的测定
将添加悬浮稳定剂的水样1-4与不添加悬浮稳定剂的实际水样0按荧光分光光度法进行测定，并研究悬浮体系的稳定性，如下表7所示。
表7 实际水样测量间隔时间与荧光值间的关系
从表7中可得，用荧光值的波动情况反应悬浮体系的稳定性，1h时间稳定性实验中得到，不添加悬浮稳定剂的实际水样其荧光值波动较大，而添加悬浮稳定剂的实际水样其荧光值的变化率在±3.5％内、精密度较高在 1.5％之内，悬浮稳定剂的添加可使藻细胞悬浮均匀。

Claims (5)

1.一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，首先采用供试藻液制备藻液样品，然后用荧光法对叶绿素进行测定即可，其特征在于：先将供试藻液进行离心处理，然后将离心处理得到藻体与悬浮稳定剂配置成藻液样品，其中所述的悬浮稳定剂由琼脂、黄原胶和卡拉胶组成，所述的悬浮稳定剂中琼脂：黄原胶：卡拉胶的含量比为(2-10)：(10-30)：(30-50)，且样品藻液中琼脂的浓度为0.06％。
2.根据权利要求1所述的一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，其特征在于：取供试藻液置于离心机中，以3500-4500r/min的转速离心15-20min，然后倒掉上清液，得到藻体。
3.根据权利要求1所述的一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，其特征在于：所述的悬浮稳定剂中琼脂：黄原胶：卡拉胶的含量比为3：7.5：17.5，且样品藻液中琼脂的浓度为0.06％。
4.根据权利要求1所述的一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，其特征在于：所述的供试藻液为蛋白核小球藻藻液，作为实验室培养藻液样品，在离心处理之前，先将蛋白核小球藻藻液中蛋白核小球藻接种在盛有灭菌BG-11培养液的锥形瓶中进行培养。
5.根据权利要求1所述的一种用于荧光测量的藻体悬浮稳定样品的制备方法，其特征在于：所述的供试藻液取自人工湖水样，作为实际水样，当取自人工湖水样为供试藻液时，采样后要立即用于制备藻液样品，或者如需放置则每升水样中加入1mL1％碳酸镁悬浮液，并于4℃冰箱中避光保存。
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