CN105420293A - 中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法 - Google Patents

中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物有效成分提取领域的一种中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，本方法利用微生物发酵技术对虎杖提取前进行发酵，再经过醇提水沉，利用80%甲醇回流提取，后加水沉淀杂质；制得上清液进行萃取，然后制备上样液，于中压氧化铝层析柱上进行三次洗脱分离；第一次采用蒸馏水洗脱至无色，第二次用浓度为40～55%乙醇洗脱，第三次采用浓度为70～95%的乙醇洗脱；收集第三次的洗脱液；再使用超临界CO2萃取仪，对洗脱后得到的白藜芦醇进行超临界CO2沉析分离，控制压力为17～20MPa、温度为70～80℃，萃取时间在30～40min，最后干燥，最终制得纯度达95～98%高纯度的白藜芦醇产品。

Description

中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取领域，具体涉及一种从中药虎杖中提取白藜芦醇的方法。
背景技术
广而周知喝葡萄酒有益健康，现代研究表明，这是因为葡萄酒中含有高效抗氧化剂，而白藜芦醇就是其中之一。葡萄在生长过程中，为防止灰色霉菌感染而产生了一种植物抗霉素，该抗霉素就是白藜芦醇，主要存在于葡萄的皮中，是一种生物性很强的天然多酚类物质，多用作肿瘤、心脑血管疾病等的化学预防剂。除此之外，白藜芦醇还存在与蓼科植物虎杖的根和根茎、豆科花生的红衣和仁等植物中，其中，虎杖中白藜芦醇含量最高。
白藜芦醇在虎杖药材中主要以苷的形式存在，少量以游离的白藜芦醇并存。研究发现，白藜芦醇的糖苷衍生物虎杖苷和白藜芦醇具有相似的药理作用，且在虎杖中的含量大大超过白藜芦醇，但它的生物活性和价值却远不如白藜芦醇。所以，根据目前藜芦醇在市场上需求量的增大，本领域内大多学者研究从植物中提取白藜芦醇的方法。
检索发现，关于“从虎杖中提取白藜芦醇”方面的文献和专利已有报道。中国专利“虎杖苷和白藜芦醇的新制备方法”（ZL200310112538.3）公开的是采用聚酰胺层析法分离纯化白藜芦醇；中国专利“一种从中药虎杖中制备白藜芦醇的工艺”（CN201210344092.6）将虎杖先用复合酶发酵再提取，再用大孔树脂分离纯化白藜芦醇。虽然这些现有技术尝试了各种不同的分离、纯化的方法，有些方法需要特殊或复杂的设备，生产率低，不容易规模化生产；有的工艺比较复杂，且目前能获得白藜芦醇的纯度最高仅有86%。然而采用中压氧化铝层析柱进行洗脱、分离，并结合超临界CO2沉析技术进行精致纯化白藜芦醇的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术工艺复杂，生产率低，产品纯度不高等问题，提供一种从中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，该方法制得的白藜芦醇纯度可达95～98%。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，步骤包括发酵、提取、萃取、分离、纯化和干燥，具体步骤如下：
发酵：将中药虎杖粉末放入发酵池中，使用培养基进行发酵5～7天，使虎杖苷转化为白藜芦醇；
提取：将步骤1中的虎杖粉末连同发酵所得的发酵液转移至提取炉中，并加入浓度为80%的甲醇回流提取3次；每次加入甲醇的体积为发酵液体积的3倍，每次提取后过滤，合并3次过滤所得滤液，并回收甲醇；
向回收甲醇后的提取液中加入蒸馏水，搅拌，冷藏、静置24h后，过滤，获取滤液；所加蒸馏水的体积为提取液体积的6倍；
离心：将步骤3所得滤液进行离心处理，取上清液；
初步萃取：上清液中加入与上清液等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并3次萃取后的乙酸乙酯萃取层；干燥回收乙酸乙酯后所剩残留液，制得白藜芦醇粗品；
洗脱分离：加水溶解白藜芦醇粗品制得上样液；上样液上样于中压氧化铝层析柱，进行三次洗脱分离：第一次采用蒸馏水洗脱，第二次用浓度为40～55%乙醇洗脱，第三次采用浓度为70～95%的乙醇洗脱；收集第三次的洗脱液，回收乙醇后进行浓缩，形成浓缩液；
精致纯化：使用超临界CO2萃取仪，对步骤6中获得的浓缩液进行沉析分离；超临界CO2萃取仪的压力为17～20MPa、温度为70～80℃，萃取时间在30～40min；
收集沉析产物，干燥，制得白藜芦醇。
本发明的有益效果为：本方法通过分离前的离心处理、初步萃取、洗脱分离步骤，去除了提取液中的颗粒状杂质以及极性较大的其它化学成分；利用中压氧化铝层析柱进行三次洗脱分离，达到梯度洗脱的效果，去除制得的上清液中依然可能存在的极性较大和中等极性的化学成分，分离出极性相对较小的白藜芦醇成分。
另外，本方法还引入了超临界CO2对白藜芦醇进行精致纯化，与现有技术中仅使用有机溶剂萃取相比，使用超临界CO2流体作为溶剂，在分子间引力作用下集聚于溶质分子的周围形成包囊层。当溶解了溶质的超临界CO2流体达到分离釜时，溶质与CO2迅速分离，溶质沉降在分离釜中形成萃取物，超临界CO2流体便能将第三次洗脱收集的洗脱液中残留的溶剂去除，减少溶剂的残留，达到进一步净化的目的，获得了纯度达95～98%的白藜芦醇产品。另外，因为二氧化碳临界点的物理参数值小，***操作较为温和，故本发明提供的方法还具有纯净安全、能保持白藜芦醇生物活性的优点。
优化方案，步骤6中第二次用浓度为55%乙醇洗脱，第三次采用浓度为95%的乙醇洗脱；步骤7中超临界CO2萃取仪的压力为18.5MPa、温度为75℃，萃取时间在35min。此工艺参数条件下获得的白藜芦醇的纯度最高，为98%。
优化方案，步骤1所述发酵为微生物发酵。微生物发酵相对与常用的自然发酵而言，能加速虎杖的发酵速度，缩短发酵时间，提高发酵效率；同时，利用微生物的促进发酵的作用，能使虎杖药材中的虎杖苷尽可能多的转化成白藜芦醇，从而提高白藜芦醇获得率，带来更好的经济效益。
优化方案，所述培养基的原料包括虎杖内生菌。虎杖内生菌是生活在虎杖的健康组织内不引起宿主植物出现明显病害症状的一种微生物，应用在虎杖药材的发酵技术中，相对一般发酵菌而言，更能高效促进虎杖药材中虎杖苷转化为白藜芦醇，使虎杖苷相白藜芦醇的转化实现最大化，从而最大限度地提高白藜芦醇获得率。
优化方案，所述培养基的原料包括碳源葡萄糖和氮源硝铵酸。从满足虎杖内生菌的菌体生长代谢所需的营养要求出发，分析虎杖植物体中含有大量的碳水化合物如纤维素等，对培养基组成碳源及氮源进行优化，最终选用碳源葡萄糖和氮源硝铵酸，能被虎杖内生菌较好的吸收利用，满足菌丝的生长，高效促进产物形成。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明：
实施例1：中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，步骤如下：
1）发酵：将中药虎杖粉末放入发酵池中，使用培养基进行发酵5～7天，本实施例优选为6天，使虎杖苷转化为白藜芦醇；
2）提取：将步骤1中的虎杖粉末连同发酵所得的发酵液转移至提取炉中，并加入浓度为80%的甲醇回流提取3次；每次加入甲醇的体积为发酵液体积的3倍，每次提取后过滤，合并3次过滤所得滤液，并回收甲醇；
3）向回收甲醇后的提取液中加入蒸馏水，搅拌，冷藏、静置24h后，过滤，获取滤液；所加蒸馏水的体积为提取液体积的6倍；
4）离心：将步骤3所得滤液进行离心处理，取上清液；
5）初步萃取：上清液中加入与上清液等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并3次萃取后的乙酸乙酯萃取层；干燥回收乙酸乙酯后所剩残留液，制得白藜芦醇粗品；
6）洗脱分离：加水溶解白藜芦醇粗品制得上样液；上样液上样于中压氧化铝层析柱，进行三次洗脱分离：第一次采用蒸馏水洗脱至无色，第二次用浓度为50%乙醇洗脱，第三次采用浓度为85%的乙醇洗脱；收集第三次的洗脱液，回收乙醇后进行浓缩，干燥，制得白藜芦醇。
实施例2：中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，步骤如下：
1）发酵：将中药虎杖粉末放入发酵池中，使用培养基进行发酵5～7天，本实施例优选为6天，使虎杖苷转化为白藜芦醇；
2）提取：将步骤1中的虎杖粉末连同发酵所得的发酵液转移至提取炉中，并加入浓度为80%的甲醇回流提取3次；每次加入甲醇的体积为发酵液体积的3倍，每次提取后过滤，合并3次过滤所得滤液，并回收甲醇；
3）向回收甲醇后的提取液中加入蒸馏水，搅拌，冷藏、静置24h后，过滤，获取滤液；所加蒸馏水的体积为提取液体积的6倍；
4）离心：将步骤3所得滤液进行离心处理，取上清液；
5）初步萃取：上清液中加入与上清液等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并3次萃取后的乙酸乙酯萃取层；干燥回收乙酸乙酯后所剩残留液，制得白藜芦醇粗品；
6）洗脱分离：加水溶解白藜芦醇粗品制得上样液；上样液上样于中压氧化铝层析柱，进行三次洗脱分离：第一次采用蒸馏水洗脱至无色，第二次用浓度为40%乙醇洗脱，第三次采用浓度为70%的乙醇洗脱；收集第三次的洗脱液，回收乙醇后进行浓缩，形成浓缩液；
7）精致纯化：使用超临界CO2萃取仪，对步骤6中获得的浓缩液进行沉析分离；超临界CO2萃取仪的压力为17MPa、温度为70℃，萃取时间在30min；
8）收集沉析产物，干燥，制得白藜芦醇。
实施例3：
与实施例2的区别在于：步骤6中第二次洗脱所用乙醇浓度为50%；第三次洗脱所用乙醇浓度为85%。
步骤7中超临界CO2萃取仪的压力为18.5MPa、温度为75℃，萃取时间在35min。
实施例4：
与实施例2的区别在于：步骤6中第二次洗脱所用乙醇浓度为55%；第三次洗脱所用乙醇浓度为95%。
步骤7中超临界CO2萃取仪的压力为20MPa、温度为80℃，萃取时间在40min。
实施例5：
与实施例2的区别在于：步骤6中第二次洗脱所用乙醇浓度为50%；第三次洗脱所用乙醇浓度为85%。
步骤7中超临界CO2萃取仪的压力为15MPa、温度为65℃，萃取时间在25min。
实施例6：
与实施例2的区别在于：步骤6中第二次洗脱所用乙醇浓度为50%；第三次洗脱所用乙醇浓度为85%。
步骤7中超临界CO2萃取仪的压力为23MPa、温度为85℃，萃取时间在45min。
下面对上述六组实施例的方法制得的白藜芦醇的纯度进行对比分析，结果见表1：
分析表1数据可知：白藜芦醇的纯化操作中，实施例1仅是通过使用不同浓度的乙醇进行洗脱分离，得到的白藜芦醇的纯度仅有72.7%，明显低于实施例2～6所得白藜芦醇的纯度，实施例2～6中在使用不同浓度乙醇进行洗脱分离后，还加入了精致纯化步骤，即利用超临界CO2萃取仪，对初步萃取、洗脱分离后得到的白藜芦醇，再进行精致纯化，将仍然存在于白藜芦醇中的杂质和洗脱液也进行了净化、脱除，使得白藜芦醇的纯度得到进一步提高，达到了80%以上。
在加入了超临界CO2萃取技术进行精致纯化后，将超临界CO2萃取仪的压力设定为17～20MPa、温度设定为70～80℃，萃取时间控制在30～40min范围内可使白藜芦醇的纯度达到95～98%，而区间外的参数条件下，即实施例5～6所列参数下，获得白藜芦醇纯度明显低于区间范围内得到的白藜芦醇纯度。此结果说明，超临界CO2萃取仪的压力、温度以及萃取时间也是影响白藜芦醇纯化程度的影响因素。
综上所述，在采用中压氧化铝层析柱进行洗脱、分离，结合超临界CO2萃取技术进行精致纯化的方法，并通过对超临界CO2萃取仪的压力、温度及萃取时间进行控制，能够获得纯度95～98%的白藜芦醇。其中，在实施例3对应的参数条件下，获得的白藜芦醇纯度最高，为98%。
本方案中采用的发酵方法均为微生物发酵法，发酵用的培养基中包括的原料有虎杖内生菌、碳源葡萄糖和氮源硝铵酸。加入虎杖内生菌发酵虎杖药材，能高效促进虎杖药材中虎杖苷转化为白藜芦醇，使虎杖苷相白藜芦醇的转化实现最大化，从而最大限度地提高白藜芦醇获得率。同时，在培养基中加入碳源葡萄糖和氮源硝铵酸，相对其它碳源和氮源而言，能更容易被虎杖内生菌吸收利用，尽可能满足菌丝生长代谢的营养需求，增强虎杖内生菌的活力，高效促进虎杖苷转化为白藜芦醇，提高白藜芦醇获得率。

Claims (5)

1.中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，步骤包括发酵、提取、萃取、分离、纯化和干燥，其特征在于：具体步骤如下：
发酵：将中药虎杖粉末放入发酵池中，使用培养基进行发酵5～7天，使虎杖苷转化为白藜芦醇；
提取：将步骤1中的虎杖粉末连同发酵所得的发酵液转移至提取炉中，并加入浓度为80%的甲醇回流提取3次；每次加入甲醇的体积为发酵液体积的3倍，每次提取后过滤，合并3次过滤所得滤液，并回收甲醇；
向回收甲醇后的提取液中加入蒸馏水，搅拌，冷藏、静置24h后，过滤，获取滤液；所加蒸馏水的体积为提取液体积的6倍；
离心：将步骤3所得滤液进行离心处理，取上清液；
初步萃取：上清液中加入与上清液等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并3次萃取后的乙酸乙酯萃取层；干燥回收乙酸乙酯后所剩残留液，制得白藜芦醇粗品；
洗脱分离：加水溶解白藜芦醇粗品制得上样液；上样液上样于中压氧化铝层析柱，进行三次洗脱分离：第一次采用蒸馏水洗脱至无色，第二次用浓度为40～55%乙醇洗脱，第三次采用浓度为70～95%的乙醇洗脱；收集第三次的洗脱液，回收乙醇后进行浓缩，形成浓缩液；
精致纯化：使用超临界CO2萃取仪，对步骤6中获得的浓缩液进行沉析分离；超临界CO2萃取仪的压力为17～20MPa、温度为70～80℃，萃取时间在30～40min；
收集沉析产物，干燥，制得白藜芦醇。
2.如权利要求1所述的中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法，其特征在于：步骤6中第二次用浓度为55%乙醇洗脱，第三次采用浓度为95%的乙醇洗脱；步骤7中超临界CO2萃取仪的压力为18.5MPa、温度为75℃，萃取时间在35min。
3.如权利要求1或2所述的中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法其特征在于：步骤1所述发酵微生物发酵。
4.如权利要求3所述的中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法其特征在于：所述培养基的原料包括虎杖内生菌。
5.如权利要求3所述的中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法其特征在于：所述培养基的原料包括碳源葡萄糖和氮源硝铵酸。
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