CN105412932A - 含ASIC1a与RIP1结合抑制剂的制剂及其抑制神经元死亡的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含ASIC1a与RIP1结合抑制剂的制剂及其抑制神经元死亡的用途。具体地，本发明从RIP1激活的上游寻找了RIP1的磷酸化的抑制剂，找到死亡分子通路更上游的药物干预靶点：特异的ASIC1a与RIP1的结合位点。通过抑制ASIC1a的C端片段与RIP1的结合，可以抑制了RIP1的磷酸化，进而抑制或减缓神经元死亡。

Description

含ASIC1a与RIP1结合抑制剂的制剂及其抑制神经元死亡的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地涉及含ASIC1a与RIP1结合抑制剂的制剂及其在抑制神经元死亡中的用途。

背景技术

酸化是一种普遍发生于多种神经***疾病(如缺血性中风和多发性硬化)的重要病理现象，是导致神经损伤的一个重要因素。缺血性中风可引起脑内明显的酸化(pH降至6.0左右)，当用NaHCO₃处理时可以显著缩小脑的梗死面积。有趣的是，通过药理学阻断或者对ASIC1a基因水平的敲除能有类似的神经保护效果，表明了ASIC1a在酸化引起的缺血性脑损伤中的关键作用。ASIC1a是属于退化蛋白/上皮钠通道家族质子门控亚群的一类非选择性的阳离子通道，广泛分布在中枢及周围神经***中。迄今为止，越来越多的细胞和动物模型的证据表明，不仅在缺血性中风中，在多发性硬化、亨廷顿舞蹈病(HD)和帕金森病(PD)等其它酸化介导神经损伤疾病中，ASIC1a也是有效分子靶点。

然而，除了ASIC1a在酸毒导致的神经元死亡过程中起重要作用之外，大家对其中的机理知之甚少。长期以来，领域内普遍认为同聚体ASIC1a通道开放后，流入胞内的钙离子是造成酸毒死亡的主要原因。尽管认为导致细胞死亡的主要原因是钙离子通道打开引起的胞内钙离子的升高，包括NMDA受体，但ASIC1a一些内在特性与这一假设不一致。首先，同聚体ASIC1a通道存在非常明显的稳态失活性质，表现为不会持续激活。其次，相较于如NMDA受体在内的其它钙通道，ASIC1a通透钙离子的能力极为有限。因此，病理条件下持续数小时的酸刺激，而ASIC1a通道通透钙离子只发生在整个酸化过程中的前几秒，只能够引起胞内钙离子水平极小幅度的上升。这样看来，由ASIC1a通道介导的微量钙离子内流而导致缺血性中风条件下严重的神经元酸毒死亡是不符合逻辑的。近十年来，这一不合理的主流理论极大的误导了以ASIC1a作为药物靶点的开发研究。因此必须寻找能够更合理解释ASIC1a介导神经元死亡的其它机制。

根据死亡形态学表现的不同，细胞死亡可以分为凋亡和坏死，传统观点认为，细胞坏死是一种偶然的不受控制的细胞死亡形式。然而，越来越多的证据表明坏死性细胞死亡与一系列的信号传递与执行机制相关(被称为程序性坏死)。近来，丝/苏氨酸激酶受体相互作用蛋白1(RIP1)被鉴定为细胞程序性坏死这一过程中重要的死亡相关激酶，RIP1特异的磷酸化是细胞程序性坏死的一个关键步骤。用特异性磷酸化抑制剂Nec-1处理可以明显抑制神经元酸化引起的死亡。

程序性坏死在很多病理生理过程中(如缺血性损伤及病毒感染)，扮演着关键的角色。大量研究中表明，死亡受体(如TNFα受体)激活后，引起的细胞死亡并不通过下游半胱天冬酶的活化。内源性的程序性坏死的抑制剂仍然是未知的。

因此，本领域迫切需要开发新的神经元程序性坏死抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抑制神经元死亡的抑制剂。

在本发明的第一方面，提供了一种ASIC1a抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抑制RIP1的磷酸化。

在另一优选例中，所述的ASIC1a抑制剂选自下组：

(i)PcTX1、amiloride(AMI)、或其组合；

(ii)特异性抑制ASIC1a的C端多肽表达和/或活性的拮抗剂；

(iii)上述(i)和(ii)的任意组合。

在另一优选例中，所述的拮抗剂包括MicroRNA、siRNA、shRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的拮抗剂包括抗体。

在另一优选例中，所述的拮抗剂抑制ASIC1a与RIP1的结合。

在另一优选例中，所述的拮抗剂抑制ASIC1a的C端与RIP1的结合。

在另一优选例中，所述的拮抗剂抑制ASIC1a的C端对应于SEQIDNO.:2中第468-第483位的区域与RIP1的结合。

在另一优选例中，所述的拮抗剂抑制SEQIDNO.:5所示多肽(CP-1)与RIP1的结合。

在另一优选例中，所述的ASIC1a来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的ASIC1a的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。

在另一优选例中，所述的ASIC1a的C端对应于SEQIDNO.:2中第468-526位。

在另一优选例中，所述的ASIC1a的编码基因选自下组：

(A)编码如SEQIDNO.:2所示多肽的多核苷酸；

(B)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；

(C)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(D)在SEQIDNO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物包含(a)ASIC1a抑制剂；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。

在另一优选例中，所述的RIP1的磷酸化由选自下组的因素所诱导：缺血性中风、酸化。

在本发明的第二方面，提供了一种抑制ASIC1a与RIP1结合的抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(i)抑制或减缓神经元死亡；或(ii)治疗缺血性中风。

在另一优选例中，所述的抑制ASIC1a与RIP1结合的抑制剂包括特异性抑制ASIC1a的C端多肽表达和/或活性的拮抗剂。

在本发明的第三方面，提供了一种用于(i)抑制或减缓神经元死亡或(ii)治疗缺血性中风的药物组合物，所述组合物包含ASIC1a与RIP1结合抑制剂，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的ASIC1a与RIP1结合抑制剂包括特异性抑制ASIC1a的C端多肽表达和/或活性的拮抗剂。

在另一优选例中，所述的神经元死亡是由酸化介导的神经元死亡。

在另一优选例中，所述的神经元包括人或非人哺乳动物(优选啮齿动物，如小鼠、或大鼠)的神经元。

在另一优选例中，所述的神经元包括皮层神经元。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：活性成分(a)ASIC1a抑制剂PcTX1、amiloride(AMI)；活性成分(b)RIP1抑制剂Nec1和Nec1s；药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1:100至100:1，较佳地为1:20至20:1。

在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的总含量为组合物的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于(i)抑制或减缓神经元死亡；和/或(ii)治疗缺血性中风。

在本发明的第五方面，提供了一种筛选抑制或减缓神经元死亡的候选药物的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对ASIC1a与RIP1结合的抑制情况，从而选出对ASIC1a与RIP1结合有抑制作用的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及

(b)测试所述经初筛的化合物对神经元死亡的效果，从而选出具有抑制或缓解神经元死亡的化合物，作为候选药物。

在另一优选例中，在步骤(a)中，在实验组中，在加入所述待测化合物并在适合ASIC1a与RIP1结合形成“ASIC1a-RIP1复合物”的条件下，测定所述ASIC1a-RIP1复合物的数量，记为Mt；并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，测定所述ASIC1a-RIP1复合物的数量，记为Mc；并对Mt和Mc进行比较；

其中，如果Mt显著低于Mc，则表明所述的待测化合物为抑制ASIC1a与RIP1结合的待测化合物，即作为经初筛的化合物；

如果Mt显著高于Mc，则表明所述的待测化合物为促进ASIC1a与RIP1结合的待测化合物。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指Mt/Mc≤1/1.5，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指Mt/Mc≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的检测包括：在实验组中，在所述待测化合物存在下，培养细胞，并测定所述细胞中经过一段时间后游离RIP1总量，记为Vt，并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，检测相同细胞中游离RIP1总量，记为Vc，并进行比较；

其中，如果Vt显著高于Vc，则表明所述的待测化合物为抑制ASIC1a与RIP1结合的待测化合物，即作为经初筛的化合物；

如果Vt显著低于Vc，则表明所述的待测化合物为促进ASIC1a与RIP1结合的待测化合物。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指Vt/Vc≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指Vt/Vc≤1/1.5，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

在另一优选例中，所述的细胞包括哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述的细胞包括神经细胞，尤其是神经元细胞。在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括设置阳性对照组、和/或阴性对照组。

在本发明的第六方面，提供了一种非治疗性地抑制或减缓神经元死亡的方法，包括步骤：

(a)在抑制剂存在下，培养神经元细胞，从而抑制抑制或减缓神经元死亡，其中所述的抑制剂是特异性抑制ASIC1a与RIP1结合的抑制剂；或者所述的抑制剂为含有ASIC1a抑制剂和RIP1抑制剂的抑制剂组合。

在另一优选例中，在步骤(a)中的所述抑制剂选自下组：PcTX1、amiloride(AMI)、Nec1、Nec1s、或其组合。

在另一优选例中，在步骤(a)中PcTX1的施用浓度为10nM。

在另一优选例中，在步骤(a)中Nec-1的施用浓度为20μM。

在本发明的第七方面，提供了一种多肽，所述多肽(CP-1)的序列如SEQIDNO.:5所示。

在本发明的第八方面，提供了一种(i)抑制或减缓神经元死亡或(ii)治疗缺血性中风的方法，所述的方法包括步骤：

(i)给需要的哺乳动物施用如本发明的第三方面和第四方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人。

在另一优选例中，所述药物组合物的施用剂量为1-1000mg/次，较佳地5-100mg/次，更佳地10-50mg/次，最佳地50mg/次。

在另一优选例中，所述阿米洛利的施用频率为1-4次/天，较佳地2-3次/天。

在另一优选例中，所述阿米洛利的施用时间为2-14天，较佳地3-7天。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同制剂对酸化诱导的神经元死亡的作用。其中，PcTX1和Nec-1可以明显削弱酸化诱导的神经元死亡，而BHA,BEL,DPI,RTO,CHX和z-VAD-fmk没有上述作用。

图2显示了酸化能够介导RIP1磷酸化及ASIC1a和RIP1的结合。其中，图2A显示了32P放射性标记法示酸化导致RIP1磷酸化水平上调，这种上调可以被Nec-1所抑制。图2B显示了针对RIP1特异性磷酸化位点的免疫印迹检测(抗磷酸化Ser/Thr)法示Nec-1和PcTX1均可以抑制酸化介导的RIP1磷酸化。图2C显示了在敲除ASIC1a基因后，酸化处理无法引发RIP1磷酸化水平上调。图2D1和图2D2显示了细胞外酸化可以引起细胞内酸化。图2E显示了体外磷酸化实验示pH6.0的酸化溶液处理无法导致RIP1磷酸化。图2F1和图2F2显示了酸化处理影响RIP1的磷酸化水平具有时间依赖性。图2G1和图2G2显示了酸化处理后ASIC1a和RIP1会相互结合。图2H显示了PcTX1能够抑制ASIC1a和RIP1的相互作用。图2I显示了TNFα的中和抗体不能保护酸处理后的神经元。

图3显示了ASIC1a的C末端序列在神经元酸化死亡中发挥了关键作用。其中，图3A显示了在CHO细胞中外转野生型的ASIC1a及其HIF和RC突变体质粒后对6.0诱发的电流的影响。图3B显示了表达野生型ASIC1a,HIF-ASIC1a,RC-ASIC1a的ASIC1a敲除小鼠神经元pH6.0酸化处理一小时后的PI染色分析，转染RC-ASIC1a的神经元中并不会出现了酸化介导的死亡。

图4显示了依据ASIC1a的C末端设计的短肽可以诱导RIP1的磷酸化及神经元程序性坏死。其中，图4A显示了根据小鼠ASIC1a的C末端序列设计合成的四条多肽。图4B显示了在pH7.4的情况下，CP-1可以介导神经元死亡。图4C和图4D显示了CP-1导致了RIP1磷酸化，且这种作用能被Nec-1抑制，而其他三条多肽并无类似效果。图4E显示了Nec-1能部分抑制CP-1介导的神经元死亡。

图5显示了缺血的小鼠脑中ASIC1a和RIP1会相互结合。图5A显示了多普勒检测小鼠MCAO前及MCAO过程中小鼠缺血半脑的血流值变化情况。图5B显示了发生缺血侧小鼠半脑中ASIC1a与RIP1相结合。图5C显示了缺血0.5h，1h，1.5h后复灌24h脑片TTC染色情况。其中，2h的脑缺血是致死的。图5D显示了野生型小鼠脑中，缺血侧半脑RIP1的表达量明显低于正常半脑而ASIC1a和RIP1的结合高于正常半脑对照组。图5E显示了缺血侧半脑的RIP1磷酸化和ASIC1a密切相关。图5F显示了酸化介导神经元程序性坏死的可能机制模式图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，一种新抑制神经元死亡的抑制剂。实验表明，组织酸化可以激活ASIC1a，进而导致其构象变化，ASIC1a的C末端与RIP1结合，会引起RIP1的磷酸化，启动神经元程序性坏死过程，导致脑组织损伤。抑制ASIC1a与RIP1的结合可以抑制神经元死亡。在此基础上完成本发明。

术语

酸化

酸化是一种普遍发生于多种神经***疾病的重要病理现象，是导致神经损伤的一个重要因素。在缺血性中风发病过程中，脑内有明显的酸化现象，pH降至6.0左右，当用NaHCO3处理时可以显著缩小脑的梗死面积。

缺血性中风

如本文所用，“缺血性中风”、“缺血性脑损伤”和“缺血性脑卒中”中可互换使用，是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死，是一种高发性，高致残致死的老年疾病。

神经元死亡

如本文所用，“神经元死亡”、“神经元程序性坏死”“程序性坏死”、“神经元酸化死亡”、“酸化介导的神经元死亡”和“细胞酸化死亡”可互换使用，脑组织长时间缺血后，会产生明显的组织酸化，由酸化介导神经元死亡，从死亡的分类来讲属于程序性坏死。

ASIC1a通道

如本文所用，术语“ASIC1a”、“ASIC1a通道”可互换使用，是退化蛋白/上皮钠通道家族质子门控亚群的一类非选择性的阳离子通道，属于酸敏感离子通道(acid-sensingionchannels，ASICs)家族。

ASIC1a在中枢和外周神经***都有分布，主要参与突触传递和可塑性。ASIC1a的功能异常跟多种神经疾病如缺血性细胞死亡、癫痫、神经退行性疾病等。本发明所指的ASIC1a通道，是指主要由ASIC1a亚基组成的同聚体或异聚体。

RIP1

RIP1(英文全称serine/threoninekinasereceptorinteractionprotein-1)，即丝/苏氨酸激酶受体相互作用蛋白1，被鉴定为细胞程序性坏死这一过程中重要的死亡相关激酶，RIP1特异的磷酸化是细胞程序性坏死的一个关键步骤。

ASIC1a和RIP1结合抑制剂

如本文所用，“ASIC1a和RIP1结合抑制剂”、“抑制ASIC1a和RIP1结合的抑制剂”可互换使用，是指能够特异性抑制ASIC1a和RIP1结合的制剂或组合物。

在另一优选例中，所述的抑制ASIC1a与RIP1结合的抑制剂包括特异性抑制ASIC1a的C端多肽表达和/或活性的拮抗剂。

在另一优选例中，所述的抑制ASIC1a与RIP1结合的抑制剂包括ASIC1a抑制剂和RIP1抑制剂。

RNA干扰(RNAi)

在本发明中，一类有效的ASIC1a和RIP1结合抑制剂是干扰RNA。

如本文所用，术语“RNA干扰(RNAinterference，RNAi)”是指：一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者RNA干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。

如本文所用，术语“小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNAinterferencepathway)。

在本发明中，干扰RNA包括siRNA、shRNA以及相应的构建物。在本发明中，所述的干扰RNA可以特异性地针对ASIC1a的干扰RNA、和/或特异性针对RIP1的干扰RNA。

以RIP1为例，一种典型的构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I

式中，

Seq_正向为RIP1的GCATTGTCCTTTGGGCAAT核苷酸序列(SEQIDNO.:3)；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在本发明的一个优选例中，Seq_正向、Seq_反向的长度为19-30bp，较佳地为20-25bp。

在本发明中，一种典型的shRNA如式II所示，

式中，

Seq’_正向为Seq_正向序列对应的RNA序列或序列片段；

Seq’_反向为与Seq’_正向基本上互补的序列；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键。

抑制或减缓神经元死亡的制剂或药物组合物

本发明提供了含有：

活性成分(a)ASIC1a抑制剂PcTX1、amiloride(AMI)；

活性成分(b)RIP1抑制剂Nec1和Nec1s；和

药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明还提供了含有：特异性抑制ASIC1a的C端多肽表达和/或活性的拮抗剂和药学上可接受的载体的药物组合物。

药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。一种优选的剂型是口服制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。

抑制或减缓神经元死亡的方法

本发明提供了一种用于抑制或减缓神经元死亡的方法，所述的方法包括步骤：给对象施用(i)抑制ASIC1a与RIP1的结合的抑制剂，或(ii)联合给予抑制ASIC1a的抑制剂(如PcTX1)和抑制RIP1抑制剂(如Nec1)；

或者所述方法包括：在选自下组的抑制剂存在下：(i)抑制ASIC1a与RIP1的结合的抑制剂，或(ii)联合给予抑制ASIC1a的抑制剂(如PcTX1)和抑制RIP1抑制剂(如Nec1)，培养神经元，从而抑制或减缓神经元死亡。

在另一优选例中，当联合使用抑制ASIC1a的抑制剂(如PcTX1)和抑制RIP1抑制剂(如Nec1)时，抑制ASIC1a的抑制剂(如PcTX1)和抑制RIP1抑制剂(如Nec1)的摩尔比为1～1000:20000；较佳地为2～100:20000；更佳地5～50:20000。

此外，在本发明方法中，还可以联合使用其他治疗神经元死亡的药物(ROS的清除剂BHA、ROS生成抑制剂RTO和DPI、钙离子下游通路抑制剂BEL、蛋白质合成抑制剂CHX、蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk)。

当本发明药物组合物被用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。

本发明的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药，涂抹给药。

此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗神经元死亡的药物(ROS的清除剂BHA、ROS生成抑制剂RTO和DPI、钙离子下游通路抑制剂BEL、蛋白质合成抑制剂CHX、蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk)联用。

本发明的主要优点包括：

(a)从RIP1激活的上游寻找了RIP1的磷酸化的抑制剂。

(b)找到死亡分子通路更上游的药物干预靶点：特异的ASIC1a与RIP1的结合位点。

(c)介绍了ASIC1a的抑制剂PcTX1的新机制：不仅是阻断了ASIC1a的通道功能，还阻断了ASIC1a的非通道功能，即ASIC1a的C段氨基酸与RIP1的结合，从而抑制了RIP1的磷酸化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

酸化导致的神经元死亡依赖于ASIC1a和RIP1

检测已报道的9种不同死亡通路调节化合物对酸化诱导神经元死亡的影响，这9种化合物包括：ROS的清除剂BHA、ROS生成抑制剂RTO和DPI、钙离子下游通路抑制剂BEL、蛋白质合成抑制剂CHX、蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk、ASIC1a抑制剂PcTX1以及RIP1抑制剂Nec-1，Nec-1s。在30分钟药物预处理及与pH6.0的溶液并给药后通过CTB检测细胞活性。

结果如图1所示，ASIC1a的特异性抑制剂PcTX1和RIP1磷酸化抑制剂Nec-1可以明显削弱酸化诱导的神经元死亡。而其他六种死亡通路调节化合物不具有保护作用，不能抑制酸化诱导的神经元死亡。

此外，药物的预处理对于保护作用至关重要，没有预给药而只是单纯并给Nec-1和Nec-1s并不能够抑制酸毒介导的神经元死亡，表明了RIP1在酸毒初始阶段起着重要作用。

实施例2

激活ASIC1a会导致RIP1磷酸化

为了研究酸化是否可以导致神经元中RIP1激活，用两种不同的方法检测了RIP1的磷酸化水平(RIP1介导坏死的重要指标之一)，包括：32P放射性标记和针对RIP1特异性磷酸化位点的免疫印迹检测(抗磷酸化Ser/Thr)。

由于细胞外酸化可以引起细胞内酸化(图2D1&D2)，导致一系列生化反应(包括激酶活性变化)。为了排除酸化诱导RIP1磷酸化是由于细胞内酸化导致的，进行了体外磷酸化实验。

结果如下：

体外磷酸化实验中，pH6.0的酸化溶液处理无法导致RIP1磷酸化(图2E)。而原代培养的神经元pH6.0处理30分钟可以显著导致RIP1磷酸化水平上调，这种上调可以被Nec-1所抑制(图2A&B)，ASIC1a特异性抑制剂PcTX1以及ASIC1a基因的敲除也可以抑制这种RIP1磷酸化水平的上调(图2B和2C)，表明ASIC1a的存在对于RIP1磷酸化至关重要。

此外，RIP1的总量在酸化处理30分钟后有明显上调，而在处理一个小时则下降到初始量的80％(图2F1&F2)。表明30分钟酸化处理后，RIP1和ASIC1a会发生结合(图2G1&G2)，而且这种作用会被PcTX1所抑制(图2H)。

综上所述，神经元酸化死亡是一种RIP1介导的程序性坏死，并且这个过程依赖于ASIC1a和RIP1的结合。

实施例3

ASIC1a的C末端序列在神经元酸化死亡中发挥了关键作用

作为一种细胞外质子感受器，不管通透离子与否，ASIC1a在受到酸化刺激后都会发生构象变化。因此，下游死亡信号通路的激活可能仅仅需要ASIC1a作为质子感受器发生的构象变化而不一定需要离子通透功能。为了验证这种可能性，构造了两种ASIC1a突变体:HIF-ASIC1a和RC-ASIC1a，两者都可以在质膜上表达。HIF-ASIC1a(³²HIF³⁴突变为³²AAA³⁴)由于孔道突变而无法通透离子。RC-ASIC1a具有和野生型相似的离子通透性(图3A)，然而其C末端(R462-C526)被置换为一段无序的氨基酸序列KLRILQSTVPRARDDPDLDN(SEQIDNO.:4)。在ASIC1a敲除小鼠的培养皮层神经元和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中转染野生型ASIC1a，HIF-ASIC1a和RC-ASIC1a。

结果如下：

转染野生型ASIC1a和RC-ASIC1a的神经元具有对pH6.0溶液快速处理引发的钙反应，但是表达野生型ASIC1a和HIF-ASIC1a的ASIC1a敲除小鼠神经元出现了酸化介导的死亡，而转染RC-ASIC1a的神经元中并不会出现了酸化介导的死亡(图3B)。

在稳定转染野生型ASIC1a，HIF-ASIC1a和RC-ASIC1a的CHO细胞中，表达野生型ASIC1a和HIF-ASIC1a的CHO中，细胞酸化死亡的程度相同，而在表达RC-ASIC1a的CHO中，细胞酸化死亡程度则与仅仅表达载体GFP的CHO程度类似。结果说明，CHO细胞和神经元一样，具有ASIC1a-RIP1相结合介导死亡的类似机制。pH6.0的溶液处理同样能够引起外源表达ASIC1a的CHO细胞系中ASIC1a与RIP1的结合。

为进一步探索ASIC1a的C末端对于神经元酸化死亡的重要性，检验了酸敏感离子通道家族中的其他成员对细胞酸化死亡的影响。

结果如下：

ASIC1a的剪切异构体ASIC1b(与ASIC1a的区别仅在N末端，两者C末端完全相同)同样可以介导细胞酸化死亡。而与ASIC1a的C末端氨基酸序列区别很大的其他ASICs亚型，如ASIC2a和ASIC3都不能介导细胞酸化死亡。由于ASIC1b同聚体无法通透钙离子，这一结果进一步表明ASIC1a通透的钙离子对于神经元酸化死亡并不重要。上述的这些现象强烈支持了ASIC1a介导的神经元死亡并不依赖于ASIC1a通道的离子通透功能，很有可能通过细胞外酸刺激激活ASIC1a，通道蛋白的C端氨基酸序列传递了死亡信号，引起了酸化介导的细胞死亡。

实施例4

依据ASIC1a的C末端设计的短肽可以诱导神经元程序性坏死

由于ASICs各个亚基的C末端之间的保守性非常低，因此很难直接通过比较来判断和酸化死亡相关的重要氨基酸序列。因此采取合成C末端序列类似人工多肽的策略来检验C末端不同区域在神经元酸化死亡中的贡献。根据小鼠ASIC1a的C末端序列设计合成了四条多肽，CP-1、CP-2、CP-3、CP-4(其中，CP-1对应于SEQIDNO.2的第468-第483位(LCRRGKCQKEAKRNSADKGVA)(SEQIDNO.:5)；CP-2对应于SEQIDNO.2的第477-第498位(SADKGVALSLDDVKRHNPCESL)；CP-3对应于SEQIDNO.2的第499-第513位(RGHPAGMTYAANILP)；CP-4对应于SEQIDNO.2的第514-第526位(HHPARGTFEDFTC)(图4A)。其中CP-1的种属间保守型最低。四条多肽都加上了TAT序列辅助进入细胞内部(图4A)。在pH7.4的条件下，将10uM多肽加入神经元培养基中37℃二氧化碳培养箱中培养1h后，换回正常培养基。

结果如图4所示，在pH7.4的情况下，CP-1处理1h(10μM)，恢复正常培养24小时后，检测发现培养小鼠皮层神经元出现了明显死亡(图4B)并且导致RIP1磷酸化(图4C)，而其他三条多肽并无类似效果。同样，Nec-1也可以抑制这种神经元死亡(图4D&E)。然而，这四条肽都不能够干预酸化介导的神经元死亡。在cp-1存在的情况下，pH6.0的酸化溶液仍然能够导致神经元活性的显著降低。而且，CP-1能够引起没有内源ASIC1a的CHO细胞的死亡，表明其毒性不依赖与全长的ASIC1a。这些数据表明，靠近ASIC1a跨膜区域的含有CP-1肽片段的C末端的氨基酸序列对于RIP1介导的神经元酸化死亡非常重要。

实施例5

缺血的小鼠脑中ASIC1a和RIP1结合且RIP1发生磷酸化

为了验证同样的死亡信号通路在在体病理情况下(如缺血性中风)是否同样发生，利用小鼠MCAO模型模拟缺血性中风(图5A)。缺血性中风伴随着非常严重的组织酸化，有文献报道中风时，pH值可降至6.5-6.0。

结果如下：

在发生缺血的小鼠半脑中，检测到ASIC1a-RIP1的结合，而在对照的半脑却看不到明显的结合(图5B)。重要的是，尽管30分钟MCAO并不足以导致可以通过TTC染色观测的明显的脑损伤(图5C)，但是已经足以引发ASIC1a-RIP1的结合。这种结合至少可以持续2小时(图5C&5D)。这种长时程的ASIC1a-RIP1的结合和原先报道的缺血状态下发生的持续长时程逐步酸化现象是一致的。这种延时性损伤对于临床治疗具有重要意义，因为这意味着缺血性中风发生后的神经保护治疗的关键时间窗口。

缺血侧半球RIP1的表达量明显低于正常半球(图5D)，与神经元酸化模型中观测到的现象一致(图2F1&F2)，表明离体神经元酸化死亡和在体神经元缺血性死亡之间有密切的相关性。

在野生型小鼠脑中，缺血侧半球RIP1磷酸化明显高于对照侧半球。用碱性磷酸酶处理则可以去除磷酸化修饰(图5E上)。而在ASIC1a基因敲除小鼠脑中，两侧半球的RIP1磷酸化水平并无明显差异(图5E下)，表明ASIC1a对于缺血性中风诱导RIP1磷酸化起到了关键的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种ASIC1a抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抑制RIP1的磷酸化。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ASIC1a抑制剂选自下组：

(i)PcTX1、amiloride(AMI)、或其组合；

(ii)特异性抑制ASIC1a的C端多肽表达和/或活性的拮抗剂；

(iii)上述(i)和(ii)的任意组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂抑制ASIC1a的C端对应于SEQIDNO.:2中第468-第483位的区域与RIP1的结合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ASIC1a的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RIP1的磷酸化由选自下组的因素所诱导：缺血性中风、酸化。

6.一种抑制ASIC1a与RIP1结合的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(i)抑制或减缓神经元死亡；或(ii)治疗缺血性中风。

7.一种用于(i)抑制或减缓神经元死亡或(ii)治疗缺血性中风的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含ASIC1a与RIP1结合抑制剂，和药学上可接受的载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：活性成分(a)ASIC1a抑制剂PcTX1、amiloride(AMI)；活性成分(b)RIP1抑制剂Nec1和Nec1s；(c)药学上可接受的载体。

9.一种筛选抑制或减缓神经元死亡的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对ASIC1a与RIP1结合的抑制情况，从而选出对ASIC1a与RIP1结合有抑制作用的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及

(b)测试所述经初筛的化合物对神经元死亡的效果，从而选出具有抑制或缓解神经元死亡的化合物，作为候选药物。

10.一种多肽，其特征在于，所述多肽(CP-1)的序列如SEQIDNO.:5所示。