CN105407934A - 经生物工程改造的同种异体瓣膜 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于带瓣静脉中瓣膜的再细胞化的方法。该方法对生产同种异体静脉瓣是有用的，其中供体带瓣静脉是经脱细胞化的然后使用全血或骨髓干细胞经再细胞化的。通过本文公开的方法生产的同种异体瓣膜对植入、移植或接枝至血管疾病患者是有利的。

Description

经生物工程改造的同种异体瓣膜

相关申请

本申请要求2014年5月27日提交的美国临时申请号62/003,129的优先权和权益，该申请的公开内容以其整体作为参考并入。

技术领域

本公开涉及用于带瓣静脉中瓣膜的再细胞化的方法。通过本文公开的方法生产的瓣膜对植入、移植或接枝至血管疾病患者是有利的。

背景技术

静脉瓣是在静脉中的膜状褶叠，其防止通过它的血液的反向流动。当人站立时，血液必须抵抗重力，从腿部静脉向上流动以到达心脏。身体具有位于皮下脂肪层的浅静脉，以及位于肌肉中且沿着骨的深静脉。短静脉称为连接静脉，连接浅和深静脉。深静脉在向心推动血液中发挥重要的作用。深静脉中的单向瓣膜防止血液反向流动，且深静脉周围肌肉压缩它们，帮助迫使血液向心，正如挤压牙膏管挤出牙膏。强大的小腿肌群是重要的，其强有力地一步步地压缩腿部深静脉。深静脉从腿部向心脏运载90％或更多的血液。

单向瓣膜由边缘汇合的两瓣(flaps)(尖(cusps)或叶(leaflets))组成。这些瓣膜帮助静脉将血液返回至心脏。随着血液向心运动，它推动尖像一对单向转门(在左边显示)开启，如果重力暂时地反向推动血液，或者血液开始在静脉中倒退，立即推动该尖闭合，防止反向流动(在右边显示)。

浅静脉具有与深静脉相同类型的瓣膜，但是他们没有被肌肉包围。因此，浅静脉中的血液不是通过肌肉的挤压作用迫使向心，并且与深静脉中的血液相比，它流动的更缓慢。在浅静脉中流动的大部分血液是通过深和浅静脉间很多的连接静脉转移至深静脉。连接静脉中的瓣膜允许血液从浅静脉进入深静脉但不可反向。

慢性静脉功能不全(CVI)是当腿部静脉中的静脉壁和/或瓣膜不能有效工作时发生的病症，致使血液从腿部返回至心脏困难。CVI引起血液在这些静脉中“淤积(pool)”或聚集，这一淤积被称为瘀证(stasis)。静脉使血液从全身的器官返回至心脏。为到达心脏，血液需要从腿部的静脉向上流动。小腿肌群和脚部的肌群需要一步步地的收缩以挤压静脉，并推动血液向上。静脉包含单向瓣膜以保持血液向上流动且不倒退。当这些瓣膜损坏，允许血液反向渗漏时慢性静脉功能不全发生。瓣膜损坏由于年龄、久坐或站立或者年龄和降低的流动性的组合而发生。当静脉和瓣膜脆弱至难以使血液向上流到心脏时，静脉中血压长时间持续升高，导致CVI。据估计美国中百分之四十的人口患有CVI。

采用压力袜结合体表手术的CVI传统的治疗方法似乎能提高静脉的血液动力；但是24周后，溃疡愈合率仅达65％，并且12％/年的复发率。CVI和腿部溃疡的重建深静脉手术治疗是有创的，且因此使用有限。

由于来源于心脏的泵送作用的动态压力，血液通过动脉和静脉流动。在封闭的循环***中，静脉回流必须等同于心输出量。大部分的动态压力在动脉血液循环中耗散。剩余的能量被释放到静脉***。在正常情况下，在毛细血管静脉端的压力是12至18mm汞柱，且稳定地对动脉压下降4至7mm汞柱。当仰卧时，重力压力被中和，血液随着该动态压力梯度流动。在仰卧位中呼吸运动也强烈影响静脉回流，但当依赖于肢体时影响不大。

静液压力源自右心房以下血液柱的重量。血密度和重力加速度决定了静液压力。静液和重力压力以在心房下以厘米计的垂直距离的常量乘运算(0.77mm汞柱/cm)表示。压力在直立时(坐或站立)但静止的个体中最高。然而，测量的压力还反应外部因素，如肌肉收缩。其他外部因素还通过可塌陷的(collapsible)静脉管道改变流动。在吸气时，横隔的收缩提高腹内和下肢的静脉压力。腹水和肥胖产生相似的压力提高，即使是仰卧时。

在依赖上肢(dependentupperextremity)中的压力反应心房和第一肋骨间的垂直距离。在直立的受试者中，上肢静脉在垂直方向上位于心房上部，其将塌陷(如头部或颈部的颅外静脉)。因此，在心房上静脉的结构中的压力，不会降低至零以下。在上肢中不常见水肿和返流，即使当静脉瓣先天缺失。单独的中心静脉血栓，一般仅产生暂时性的、近端的水肿。

在有能力的静脉瓣的帮助下，通过下肢肌肉泵的血液挤压，完成从依赖下肢的静脉至心脏的血液的静脉回流。瓣膜发挥功能以使血液的静液柱分割成段，且防止静脉倒流。尽管在膝下段更多数量的瓣膜暗示其更为重要的功能，但是可通过矫正股或腘静脉功能不全显著改变静液压力。穿透静脉瓣防止深至浅流动，与小腿泵的压力/流动的关系一致的概念。脚部的穿透静脉是一个例外，其双向流动被认为是正常的。

慢性静脉功能不全(CVI)和腿部溃疡的患者每年巨大的直接花费构成严重的医学和社会问题。下肢静脉性溃疡的患病率在0.1至1.0％。采用压力袜结合体表手术的CVI传统的治疗方法似乎能提高静脉血液动力；但是24周后，溃疡愈合率仅达65％，并且12％/年的复发率。

此外，手术技术要求高，且因此在重建深静脉的手术中使用有限。

因此，治疗患有慢性静脉功能不全和腿部溃疡的方法尚需改进。本公开提供了治疗这些疾病的替代策略。

发明内容

本公开的特征在于，其中，用于脱细胞化(decellularizing)和再细胞化(recellularizing)带瓣静脉中瓣膜的材料的方法。

本公开提供了在体内生理条件刺激下，经组织工程改造的人带瓣静脉段的瓣膜功能的成功保留。本公开进一步提供了以简单的血液样本，经脱细胞化的人静脉段和静脉瓣膜的成功再内皮化，其中生成单层内皮细胞。

本公开提供了一种静脉中瓣膜的再细胞化的方法，该方法包括引入血液至经脱细胞化的静脉的管腔，血液包括内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞，且在经脱细胞化的静脉的管腔中培养细胞，从而再细胞化静脉中的瓣膜。

本公开提供了一种带瓣静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其经再细胞化的瓣膜是功能性瓣膜。在实施方案中，该方包括从有经再细胞化静脉中瓣膜需要的受试者获取静脉段；脱细胞化带瓣静脉；从受试者收集血液，其中血液包括内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞；用收集的血液灌注经脱细胞化的带瓣静脉；以及在经脱细胞化的带瓣静脉中培养细胞，从而再细胞化该经脱细胞化的静脉中的瓣膜。

在实施方案中，本公开包括一种再细胞化静脉中瓣膜的方法，其中再细胞化恢复经再细胞化的瓣膜的能力(competence)和返流压力的耐受性。

本公开提供了在有需要的受试者(经再细胞化的带瓣膜静脉的受体)中，治疗慢性静脉功能不全(CVI)、深静脉血栓(DVT)、和/或腿部溃疡的方法，其通过引入经再细胞化的静脉的带瓣段至受试者，其中瓣膜是经再细胞化的，再细胞化方法包括：脱细胞化同种异体静脉的带瓣段；从受试者收集血液，其中血液包括内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞；用收集的血液灌注经脱细胞化的带瓣；在经脱细胞化的带瓣静脉的管腔中培养细胞；从而再细胞化该经脱细胞化的静脉瓣膜；以及接枝经再细胞化的带瓣静脉至受试者，其治疗受试者中的CVI和/或腿部溃疡。

在实施方案中，血液是外周静脉血或全血。在实施方案中，外周静脉血或全血是通过注射或灌注引入至经脱细胞化的静脉。该方法提供了通过内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注培养细胞。内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注可以是交替的。在实施方案中，经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的、vWF阳性的、平滑肌肌动蛋白阳性的、且具有细胞核。在实施方案中，经再细胞化的瓣膜具有在第一峰承受的力在或者高于0.8N的力学性能。在实施方案中，经再细胞化的瓣膜具有等于或小于0.5秒的闭合时间。

本公开提供了一种静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其通过引入内皮细胞、平滑肌细胞、内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞的群中的一种或多种至经脱细胞化的静脉的管腔中。细胞和/或祖细胞的群与经脱细胞化的静脉培养，从而再细胞化静脉中的瓣膜。在接枝到其受试者后，本公开的经再细胞化的瓣膜恢复与正常健康瓣膜相似的正常的闭合时间(即，能力)以及耐受返流压力。本公开的特征在于提供了仅引入内皮细胞、平滑肌细胞、内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞的群至经脱细胞化的静脉的管腔。

本公开进一步提供了静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其中经再细胞化的瓣膜是功能性的。该再细胞化的方法包括的步骤包括：获取人静脉的带瓣段；脱细胞化静脉；从经再细胞化的瓣膜的受体收集血液；用收集的血液灌注经脱细胞化的静脉数小时(例如，约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时，或者约10-20小时)；用内皮细胞培养基灌注静脉一天以上；以及用平滑肌培养基灌注静脉一天以上；从而再细胞化经脱细胞化的静脉瓣膜。在接枝到有需要的受试者后，本公开使用血液经再细胞化的瓣膜恢复与正常健康瓣膜相似的正常的闭合时间(即能力)以及耐受返流压力。

本公开提供了静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其中经再细胞化的瓣膜是功能性的。该再细胞化的方法包括步骤：脱细胞化从供体获取的静脉的带瓣段；用收集于有治疗需要(即，有静脉中瓣膜再细胞化需要)的受试者的血液灌注数小时(例如，约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时，或者约10-20小时)；任选地，用内皮细胞培养基灌注静脉一天以上；以及用平滑肌培养基灌注静脉一天以上；从而再细胞化经脱细胞化的静脉瓣膜，其中，接枝到有需要的受试者时，再细胞化恢复经再细胞化的瓣膜的能力以及返流压力的耐受性。

在瓣膜再细胞化的方法中，存在或衍生自外周静脉血或全血中的细胞群，用经脱细胞化的静脉培养。本公开提供细胞群是同种异体的。本公开还提供细胞群是自体的。同种异体和/或自体细胞群收集于或存在于外周静脉血或全血。本公开提供从同种异体供体收集的外周静脉血或全血。外周静脉血或全血是自体的。本公开提供用同种异体的外周静脉血或同种异体的全血培养经脱细胞化的静脉。本公开提供用同种异体的全血培养经脱细胞化的静脉。本公开还提供用自体的外周静脉血或自体的全血培养经脱细胞化的静脉。

本公开提供了经脱细胞化的静脉。用脱细胞化步骤重复不止一次(定义为“周期”)的方法脱细胞化静脉。静脉脱细胞化包括2至16个周期。例如，脱细胞化方法包括14个周期。

本公开的带瓣静脉在用包括2-16个脱细胞化周期的方法脱细胞化后，与未脱细胞化的静脉相比，细胞核的数量减少或无细胞核(在免疫组织化学检测中细胞核染色减少或阴性)。在2-16个脱细胞化周期后，静脉的特征在于具有减少的或无人类白细胞抗原(HLA)I类抗原(在免疫组织化学检测中HLAI类抗原染色减少或阴性)，和/或具有减少的或无HLAII类抗原(在免疫组织化学检测中HLAII类抗原染色减少或阴性)。与未脱细胞化的静脉相比，在2-16个脱细胞化周期后，静脉的特征在于含有的胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖(GAG)降低，并且弹性蛋白提高。与未脱细胞化的静脉相比，脱细胞化降低了经脱细胞化的静脉的DNA。

本公开提供了在经脱细胞化的带瓣静脉中瓣膜再细胞化，其中经再细胞化的瓣膜和静脉有细胞核且为CD31阳性的。含经再细胞化的瓣膜的静脉也为平滑肌肌动蛋白阳性的，且在静脉外膜(tunicaadventitia)具有梭形的平滑肌细胞。经再细胞化的瓣膜和静脉以及还是内皮标志物vWF阳性的。

本公开提供了通过获得功能性的瓣膜的方法，在经脱细胞化的静脉中再细胞化瓣膜。该功能性瓣膜具有正常的闭合时间(即能力)和耐受正常水平的返流压力。具有正常功能的瓣膜的正常的闭合时间，在本文也被称为能力，是小于或等于0.5秒。具有正常功能的瓣膜耐受正常水平100mm汞柱的返流压力，且在行走7至12步时，减少至平均约18mm汞柱至约25mm汞柱。

本公开提供了经再细胞化的瓣膜，在接枝至有需要的受试者后，在毛细血管静脉端恢复12mm至18mm汞柱的压力。在其受试者中经再细胞化的瓣膜恢复正常的静液和重力压力，其以在心房下以厘米计的垂直距离的常量乘运算(0.77mm汞柱/cm)表示。接枝后，在直立(坐或站立)但静止时的受试者中，经再细胞化的瓣膜恢复正常的最高水平的100mm汞柱的压力。本公开还提供了，在模拟行走和呼吸过程中发生的压力下深静脉***中静脉流通的体外功能性实验中，具有约100mm汞柱的静脉返流压力的功能性经再细胞化的瓣膜。

本公开提供了瓣膜的再细胞化，在有能力的经再细胞化静脉瓣的帮助下，通过下肢肌肉泵挤压血液，完成从依赖下肢静脉至心脏的血液的静脉回流。本公开的经再细胞化的瓣膜发挥功能以使血液的静液柱分割成段，且防止静脉倒流。在膝下段，经再细胞化的静脉恢复更多数量的瓣膜。瓣膜的再细胞化用于通过矫正股或腘静脉功能不全，改善静液压力改变引起的症状。穿透静脉瓣膜防止深静脉至浅静脉流动，且恢复小腿泵的正常压力/流动关系。

在脚部穿透静脉中，经再细胞化的瓣膜恢复通过静脉的血液的双向流动。

本公开进一步提供了在有需要的受试者中，治疗或改善慢性静脉功能不全(CVI)和/或腿部溃疡的症状的方法，其包括接枝经再细胞化的静脉的带瓣段至受试者。该瓣膜再细胞化方法包括一个或多个步骤。该方法包括一个或多个步骤：获取人同种异体股静脉的带瓣段；脱细胞化股静脉中静脉2-16个周期；从受试者收集血液；用抗凝剂灌注经脱细胞化的静脉；用收集的血液灌注经脱细胞化的静脉数小时；排出血液并使用缓冲液冲洗静脉；以及首先用内皮细胞培养基灌注静脉一天以上；然后用平滑肌培养基灌注静脉一天以上；从而再细胞化经脱细胞化的瓣膜；其中经再细胞化的瓣膜接枝至受试者治疗或改善CVI和/或腿部溃疡。

本公开提供了一种再细胞化的血管的带瓣段，其用于在有需要的受试者中，治疗或改善慢性静脉功能不全和/或腿部溃疡的症状。再细胞化血管的段通过包括以下一个或多个步骤的方法获得：获取人同种异体股静脉的带瓣段；脱细胞化股静脉中静脉2-16个周期；从受试者收集血液；用抗凝剂灌注经脱细胞化的静脉；用收集的血液灌注经脱细胞化的静脉数小时；排出血液并使用缓冲液冲洗静脉；以及首先用内皮细胞培养基灌注静脉一天以上；然后用平滑肌培养基灌注静脉一天以上；从而再细胞化经脱细胞化的瓣膜；其中经再细胞化的瓣膜接枝至受试者治疗或改善CVI和/或腿部溃疡；优选地，其中，再细胞化血管的段通过包括上述全部步骤的方法获得。

本公开提供了一种实施于瓣膜的方法，瓣膜是从身体/供体获取或获得的静脉的一段，且血液从待治疗的受试者收集，其中供体和待治疗的受试者不是同一个体。

本公开的瓣膜脱细胞化的步骤包括，在合适的去垢剂/有机磷酸酯化合物中处理带瓣静脉，其包括但不限于和磷酸三丁酯(Tri-n-butylphosphate)以及任选地额外包含DNA酶。

经脱细胞化的瓣膜是通过以内皮细胞培养基灌注静脉2-6天，接着通过以平滑肌培养基灌注静脉2-6天再细胞化的。在一个方面，经脱细胞化的静脉的培养是在体外的。

经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。该经再细胞化的瓣膜还可是平滑肌肌动蛋白阳性的、vWF阳性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌细胞。经再细胞化的瓣膜具有在第一峰高于0.8N的力学性能。

本公开提供了使用经再细胞化的带瓣静脉治疗由深静脉返流和/或静脉高压引起的复发性下肢肿瘤的方法。本公开提供了经再细胞化的带瓣静脉在治疗由深静脉返流和/或静脉高压导致的复发性下肢肿瘤的用途。

本公开特征在于通过本文中所述的任一方法生产的瓣膜，其中经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。该经再细胞化的瓣膜还可以是平滑肌肌动蛋白阳性的、vWF阳性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌细胞。经再细胞化的瓣膜具有在第一峰高于0.8N的力学性能。

本公开的特征还在于本文中所述的任一方法生产的瓣膜用于植入或接枝的用途，其中，经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。该经再细胞化瓣膜还可以是平滑肌肌动蛋白阳性的、vWF阳性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌细胞。经再细胞化的瓣膜具有在第一峰高于0.8N的力学性能。

本公开提供了瓣膜的再细胞化，其接枝入有需要的受试者，治疗和/或改善在大腿部功能不全的瓣膜的症状。在一个方面，治疗和/或改善症状是通过恢复肌肉泵和静脉瓣间正常的工作关系实现的。下肢的肌肉泵包括脚部、小腿、和大腿的那些肌肉泵。这些中，小腿泵是最重要的，因其是最有效的、具有最大的容量、以及形成最高的压力(在肌肉收缩时200mm汞柱)。正常的肢体具有从1500至3000cc范围的小腿容量，100至150cc的静脉容量，且单次收缩挤压超过静脉容量的40％至60％。

在收缩期，腓肠肌和比目鱼肌推动血液至大容量的腘和股静脉。在随后的舒张期，本公开的经再细胞化的瓣膜防止倒流(返流)，形成负压力，且通过有能力的穿透静脉牵引血液从浅静脉至深静脉***。经再细胞化的瓣膜逐步降低静脉压，直到动脉流入等于静脉流出。当受试者停止运动，具有经再细胞化的瓣膜的静脉缓慢地填充毛细血管床，导致缓慢回到静息静脉压。

尽管大腿静脉被肌肉包围，大腿肌肉收缩对静脉回流的贡献与小腿肌肉泵相比很小。在行走中，足底静脉丛是被压缩的，其泵作用被认为是引发小腿泵。各种腿部泵与有能力的瓣膜功能共同作用将静脉血液从远端回流至近端肢体。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些相似或相当的方法和材料可用于实施或检验本公开，下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而不意在限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体结合。若不一致，则以本说明书为准，包括定义。

本公开的详细说明在所附附图和下文说明中阐述。本公开的其它特征、目标和优点将从附图和详细说明以及从权利要求书中显而易见。

附图说明

图1显示装置的照片，以及用于静脉功能测试的体外模型。该***循环有室温的含有用于提高多普勒信号的超声造影剂的生理盐水。蠕动泵(a)泵送生理盐水通过整个回路，机械阀(b)使在泵输出期间的流动通过静脉(c)。超声波探头(d)用于静脉(e)的可视化，以及流动通过静脉瓣膜的评估。通过在静脉上方的容器(f)的高度调节在瓣膜位置的返流压力。机械阀能控制流动的方向，以及允许测试瓣膜功能，带瓣静脉段装于回路中，并置于填充有生理盐水容器中，通过超声促进可视化；瓣膜闭合时间评估；在瓣膜位置的返流压力通过静脉上方的容器的高度调节。

图2(A-D)显示经脱细胞化的含瓣膜静脉段的总体形态和微观视图。(A)正常静脉和(B)在14个周期后经脱细胞化的静脉的总体形态。14个周期后经脱细胞化的(C)静脉的HE染色显示保留组织构造和蓝-黑色细胞核的缺失，以及(D)正常静脉显示细胞核的存在。

图3(A-D)显示经脱细胞化的静脉中细胞外基质。(A)正常静脉的马松三色(Masson’sTrichrome,MT)染色显示存在细胞核(黑)、细胞质(红/粉红)和胶原蛋白(蓝)。(B)在经脱细胞化的静脉(DV)中，未发现细胞核，表明缺少内皮和平滑肌细胞，但胶原蛋白的染色表明胶原蛋白仍然存在。(C)直方图显示在14个脱细胞化周期后，胶原蛋白和GAG的量分别显著降低(P值为0.03和0.005)。(D)直方图显示在脱细胞化后DNA的量显著降低(p值为0.0001)。在3A-3B中，基准尺＝50μm。

图4(A-F)显示含经再细胞化的瓣膜的静脉段的特征。(A)和(B)分别在低和高放大倍数下，经再细胞化的静脉和瓣膜的苏木精和伊红(HE)染色的显微图像。图片显示静脉和瓣膜(箭头)的内皮衬里(endotheliallining)上存在连续的细胞。(C)HE和马松三色(MT)染色正常和经再细胞化的瓣膜显示在静脉所有的视图中存在细胞核。(D)经再细胞化静脉的CD31染色显示连续的内皮衬里。(E)瓣膜的平滑肌肌动蛋白染色显示瓣膜中平滑肌细胞的存在。(F)α-平滑肌肌动蛋白的染色显示经再细胞化的静脉培养基中的平滑肌细胞。

图5(A-E)显示使用自体全外周血经生物工程改造的静脉接枝的图像。(A)经组织工程改造的静脉的免疫荧光染色。放大倍数为100X。(B)经生物工程改造的瓣膜的免疫荧光图像，其使用抗-CD31抗体染色以表明管腔中存在内皮细胞(绿色)。放大倍数为200X。(C)抗-CD31抗体染色的阴性对照。放大倍数为200X。用抗-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色的经组织工程改造的静脉，显示外膜层(tunicaadventitialayer)明显存在平滑肌细胞(箭头)。(D)显示瓣膜的经再细胞化的静脉总体照片。(E)具有功能性瓣膜的静脉的照片。瓣膜显示肿胀，表明在新鲜获取的经脱细胞化和再细胞化的静脉中，当通过注射器注射溶液时，液体保留。

图6(A-C)显示经再细胞化的瓣膜的力学分析。(A)正常的和经再细胞化的(RC)静脉瓣的变形行为的代表图。水平方向逐步撕碎瓣膜导致一系列的峰。(B)来自相同静脉的每对瓣膜在第一峰的力。正常静脉瓣膜是用方形标记，而RC瓣膜用圆形标记。绿色标记功能性瓣膜，而红的标记功能不全的。蓝线代表在第一峰迫使静脉需要发挥功能的力的大小的截断值(0.8N)。(C)工作瓣膜的平均力的箱图表明正常瓣膜和经再细胞化的瓣膜间无显著差异。

图7显示一系列超声图像，显示经组织工程改造的含瓣膜静脉的功能性测试的阶段。组(a)-(f)显示静脉段的2-D纵向超声投影。闭合瓣膜(a)，以及在顺行流动中瓣膜的逐步张开(b-d)，逆行流动时瓣膜的逐步闭合(e)和(f)。

图8显示经组织工程改造的含瓣膜静脉的功能性测试。在下面的图像(a)-(c)中黄色多普勒基准显示以秒记的瓣膜闭合时间。

图9(A-B)显示证明生物力学测试的一系列图片。(A)在纵向切割后的静脉图片，以实施撕拉测试和瓣膜的延伸，同时使用英斯特朗测试机(instrontester)测试。(B)在切割静脉上实施撕拉测试的英斯特朗测试机的图片。

图10(A-G)显示经脱细胞化的静脉的免疫组织化学分析。(A)正常静脉的DAPI染色显示数个细胞核，但是(B)经脱细胞化的静脉不显示DAPI-染色的细胞核。(C)经脱细胞化的静脉的免疫组织化学染色显示HLAI类抗原表达的缺失和(D)HLAII类抗原表达的缺失。(E)正常静脉染色HLAI类(褐色)阳性，但无(F)HLAII类。(G)阴性对照。以(A)50x、(B)100x的放大倍数。

图11(A-D)显示经再细胞化的静脉。(A)颜色为出现粉红色的正常(A)和经再细胞化的静脉(B)的总体形态，DAPI染色显示在正常静脉中(C)和经使用外周全血再细胞化的静脉中(D)大量细胞核。以100x放大倍数。

图12A是人腿部中深静脉的素描简图。图12B是当静脉中单向瓣膜开启和闭合时的简图。

具体实施方式

本公开的详细说明已在下文说明中阐述。尽管与本文所述那些相似或相当的方法和材料可用于实施或检验本公开，本文中描述了该方法和材料。本公开的其它特征、目标和优点将从说明以及从权利要求书中显而易见。在说明和所附的权利要求中，除非上下文另有明确规定，单数形式包含复数指代。

为了方便起见，在说明、实施例和权利要求中所使用的特定术语收集于此。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

定义

如本文所使用的“再细胞化”指这样的过程：将细胞引入或递送至经脱细胞化的静脉，并培养该细胞使得细胞增殖和/或分化以最终再生具有与正常带瓣静脉相似的构造、细胞组构和生物活性的瓣膜。

如本文所使用的“脱细胞化”是指从瓣膜除去细胞的过程。有效的脱细胞化取决于例如组织密度和组构、终产物期需的几何学和生物学性质以及靶向的临床应用等因素。保留ECM完整性和生物活性的瓣膜脱细胞化可由本领域技术人员例如，通过在处理期间选择特定试剂和技术优化。用于脱细胞化的试剂可能取决于许多因素，包括细胞结构、密度、脂质含量和静脉厚度。尽管大多数细胞去除试剂和方法可改变ECM组成并导致一些程度的超微结构破坏，但期需将这些不良效果最小化。

如本文所使用的“治疗”是为获得有益的或期需的效果的方法，其包括临床效果。对于本公开的目的，有益的或期需的临床效果包括，但不限于一种或多种症状的减轻或改善、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(即，未恶化)、防止疾病的扩散、疾病进程的延迟和减缓、疾病状态的改善或减轻、以及恢复(无论部分或全部)、无论可检测或检测不到。“治疗”还可意味着与未接受治疗的预期生存相比，延长了生存。

对于“减少”或该词的其他形式，如“减少的”或“下降，”意思是一个事件或特征(例如，CVI和/或腿部溃疡)的降低。其被理解这通常是涉及一些标准或预期值，换言之它是相对的，但是它并不是总是对所提及的标准或相对值所必要的。

如本公开的方法的范围内为针对预防疾病或疾病状态，其可被理解为术语“预防”不要求完全去除(thwarted)该疾病状态(例如，CVI和/或腿部溃疡)。术语“预防”可包含当本文公开的经再细胞化的瓣膜被施用/接枝/移植时部分有效，其作为一种措施降低了症状或疾病进程，例如，CVI和/或腿部溃疡。效果可从部分有效延伸到不同程度的有效，其包括个体被宣告治愈或没有任何CVI和/或腿部溃疡的症状。该术语不要求疾病状态总是被完全消除。

如本文所使用的“减轻”疾病或疾病状态意思是与未治疗疾病相比，疾病状态的程度和/或不良临床表现是减少的(或缓解的)和/或进展的时间进程是缓慢的或延长的。

如本文所使用的“抑制的”、“抑制”和本文中使用的它的名词变化和动词变换，用以描述经再细胞化的瓣膜的生物学效果。其不必要求100％的抑制。该定义包含部分抑制。该定义将包含与相关对照相比(例如，当没有使用化合物时所观察的程度)任何程度的抑制。

如本文所使用的瓣膜的能力是指瓣膜闭合时间，或从倒流至流动终止的时间。具备正常功能的瓣膜的瓣膜闭合时间等于或小于0.5秒。在实施方案中，本公开的经再细胞化的瓣膜可具有等于或小于0.5秒的瓣膜闭合时间(或能力)。

如本文所使用的静脉的返流，是指相对血液流向心脏的方向，血液的相反流动。具备正常功能的瓣膜可承受或耐受约100mm汞柱的返流压力，且在行走7至12步时，减少至平均约18mm汞柱至约25mm汞柱。具备正常功能的瓣膜保持闭合，从而对高达100mm汞柱的压力防止返流，且在行走7至12步时，减少至平均约18mm汞柱至约25mm汞柱。在实施方案中，经再细胞化的瓣膜可证明为具有承受正常瓣膜所耐受的返流压力(即，100mm汞柱)的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。

本文所使用的“受试者”意思是人或动物(在动物的情况下，更典型的是哺乳动物)。在一方面，受试者是人。在一方面，受试者是雄性。在一方面，受试者是雌性的。如本文所使用的，“有需要的受试者”是具有与瓣膜疾病或功能不全相关的血管疾病或失调，或者相对于普遍人群具有提高的发展为该血管疾病或失调风险而需要血管接枝或移植的受试者。

为提高对本文公开内容的理解的目的，所引用的特征和特定语言使用了相同描述。本文所使用的术语的目的仅在于描述特定特征，并不意在限制本公开的范围。除上下文另有明确规定，如本公开全文所使用的单数形式“一种”“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种瓣膜”，包括该组分的复数，和单数组分。除另有说明外，本文中所使用的所有百分数或比例是以重量计。

除相反地特别声明，组分的重量百分比是基于包含该组份的制剂或组合物的总重量。术语“约”是指在一种试剂的浓度或量中任何最小限度的改变，其不改变该试剂在制备制剂和疾病或失调的治疗中的有效性。有关本公开的试剂(例如治疗剂/活性试剂)的浓度范围的术语“约”也指不改变有效量或范围的现有量或范围的任意变化。

在本文中，范围可以从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值的形式表示。当以该形式表示一个范围，另一方面包含从一个特定值和/或至其他特定值。相似地，当通过使用前述“约”以近似值表示值时，其被理解为该特定值形成另一方面。进一步理解为，范围的每一端点相对于另一个端点均是有意义的，且独立于另一个端点。其还理解为本文公开存在数个值，且本文中每个值也是以“约”公开，是除该数值本身的特定数值。其还理解为在申请全文中，以数个不同形式提供的数据，该数据代表端点和起点和数据点的任意组合的范围。例如，如果一个特定数据点“10”和一个特定数据点“15”被公开，其理解为高于、高于或等于、少于、少于或等于、以及等于10和15，以及10和15间是被公开的。其也被理解为两个特定单位间的每一单位同样被公开。例如，如果10和15被公开，则11、12、13和14也被公开。

静脉血液是缺氧血液，其从外周血管，通过静脉***运输至心脏的右心房。缺氧血液随后由右心室通过肺动脉泵送至肺部，肺动脉划分为两分支，左和右分别对应左和右肺。在肺中血液是含氧的，并通过肺静脉回流至左心房。

出生后血管发生(vasculogenesis)为在成年人中由循环内皮祖细胞(EPC)形成新血管；以及血管形成(angiogenesis)为从预先存在的内皮细胞形成新血管(RibattiD等，2001)。这两个过程促成静脉分支的形成和致病状态如伤口愈合、缺血、骨折愈合、肿瘤生长等(Laschke等，2011)。

本公开包括用于再细胞化静脉的细胞群是同种异体的。如本文所使用的“同种异体的”是指从与器官或组织来源相同的物种个体(即，有关或无关个体)获取血液。

如本文所使用的自体意思是供体和受体是相同的人。例如，安排非紧急手术的患者可以是自体供体，其通过贡献他们自己的血液，存储血液至手术。自体接枝是一种由自身提供的接枝(如皮肤接枝)。在实施方案中，本公开的再细胞化的方法包括引入从受体(即，有治疗需要的受试者(即，自体)获得的血液或细胞。

为提高对本文公开内容的理解的目的，所引用的特征和特定语言使用了相同描述。本文所使用的术语的目的仅在于描述特定特征，并不意在限制本公开的范围。除上下文另有明确规定，如本公开全文所使用的单数形式“一种”“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种组合物”，包括该组合物的复数，和单数组合物，以及“一种治疗试剂”是涉及一种或多种治疗的和/或药物试剂，以及本领域技术人员熟知的等同物等。除另有说明外，本文中所使用的所有百分数或比例是以重量计。

由于来源于心脏的泵送作用的动态压力，血液通过动脉和静脉流动。在封闭的循环***中，静脉回流必须等同于心输出量。大部分的动态压力在动脉血液循环中耗散。剩余的能量被释放到静脉***。在正常情况下，在毛细血管静脉端的压力是12至18mm汞柱，且稳定地对动脉压下降4至7mm汞柱。当仰卧时，重力压力被中和，血液随着该动态压力梯度流动。在仰卧位中呼吸运动也强烈影响静脉回流，但当依赖于肢体时影响不大。

静液压力源自右心房下的血液柱的重量。血密度和重力加速度决定了静液压力。静液和重力压力以在心房下以厘米计的垂直距离的常量乘运算(0.77mm汞柱/cm)表示。压力在直立时(坐或站立)但静止个体中最高。然而测量的压力还反应如肌肉收缩的外部因素。其他外部因素还通过可塌陷的静脉管道改变流动。在吸气时，横隔的收缩提高腹内和下肢的静脉压。腹水和肥胖产生相似的压力提高，即使是仰卧时。

在依赖上肢中的压力反应心房和第一肋骨间的垂直距离。在直立的受试者中，上肢静脉在垂直方向上位于心房上部，其将塌陷(如头部或颈部的颅外静脉)。因此，在心房上静脉的结构中的压力，不会降低至零以下。在上肢中不常见水肿和返流，即使当静脉瓣先天缺失。单独的中心静脉血栓，一般仅产生暂时性的、近端的水肿。

在有能力的静脉瓣的帮助下，通过下肢肌肉泵的血液的挤压，完成从依赖下肢的静脉至心脏的血液的静脉回流。瓣膜发挥功能以使血液的静液柱分割成段，且防止静脉倒流。尽管在膝下段更多数量的瓣膜暗示其更为重要的功能，但是可通过矫正股或腘静脉功能不全显著改变静液压力。穿透静脉瓣防止深至浅流动，与小腿泵的压力/流动的关系一致的概念。脚部的穿透静脉是一个例外，其双向流动被认为是正常的。

重建深静脉手术，如瓣膜成形术、自体移植和新瓣膜构建，已证明是在传统治疗失败的患者中提高溃疡治愈率和提供无溃疡期的选择。然而，这些程序的持久性仍然是一个问题。见RosalesA等，Venousvalvereconstructioninpatientswithsecondarychronicvenousinsufficiency,EUR.J.OFVASCULARANDENDOVASCULARSURGERY,(2008),36:466–72；另见RosalesA等，Externalvenousvalveplasty(EVVP)inpatientswithprimarychronicvenousinsufficiency(PCVI),EUR.J.OFVASCULARANDENDOVASCULARSURGERY,(2006),32:570–576；和MaletiO.&PerrinM.,Reconstructivesurgeryfordeepveinrefluxinthelowerlimbs:techniques,resultsandindications.EUR.J.OFVASCULARANDENDOVASCULARSURGERY(2011),41:837–48。

本公开是基于惊奇的发现，即，适用于手术植入的静脉瓣可由来自死亡供体静脉成功地经生物工程改造，该静脉是经脱细胞化的且随后通过来自接枝受体的自体细胞再细胞化的。该方法可以考虑用于由血栓、慢性深静脉功能不全、静脉阻塞或静脉返流所引起的，有需要旁路手术或血管静脉分流术的患者。进一步地，该技术不再需要终身免疫抑制，且是一种有前途的和安全的临床方法，与以前的血管移植解决方案相比，具有极大的益处和较低的风险。

本公开提供了用于静脉脱细胞化的方法。本文描述了用于静脉脱细胞化的方法包括内源性细胞的去除，同时保留细胞外基质(ECM)的完整性。本文所描述的脱细胞化的方法利用两种或多种不同的细胞破碎溶液连续处理数个周期。在本公开的特征中，通过现有技术中已知的多种方法检测为无细胞核剩余时脱细胞化完成。静脉可来自供体。在本公开中，从供体获得用于再细胞化的静脉；该供体是死亡的。该供体可来自HLA或组织匹配的供体。

本公开还提供了用于经脱细胞化的瓣膜的再细胞化方法，其包括引入细胞群至经脱细胞化的静脉，以及在经脱细胞化的静脉上或内部培养所述细胞群。本文所述的方法是对细胞群的扩增和细胞群分化至功能性的内皮细胞和平滑肌细胞以产生功能性瓣膜是有用的。

本公开提供了在下肢静脉***中再细胞化瓣膜。下肢静脉***包括深静脉，其位于肌肉筋膜下，且注入下肢肌肉；浅静脉，其在深层筋膜上方，注入皮肤微循环；以及穿透静脉，其贯穿肌肉筋膜且连接浅和深静脉。交通静脉在相同的隔室内连接静脉。浅、深和多数穿透静脉包含双尖瓣(bicuspid)瓣膜，其确保在正常静脉***中的单方向流动。本公开提供了双尖瓣瓣膜的再细胞化，以及经再细胞化的双尖瓣瓣膜在恢复静脉***的单方向流动的用途。

本公开提供了在浅静脉的大隐静脉和大隐静脉前和后附件中瓣膜的再细胞化。内侧浅静脉的主要静脉是大隐静脉及大隐静脉前和后附件。本公开提供了隐小室(saphenoussubcompartment)和隐筋膜(saphenousfascia)的瓣膜是经再细胞化的。隐筋膜覆盖隐小室，且在浅表隔室中将大隐静脉从其他静脉中分离。本公开提供了在小隐静脉(SSV)中的瓣膜是经再细胞化的。SSV是腿部最重要的后浅静脉。它起源于脚部外侧注入腘静脉，最常见膝盖弯曲处近端汇合。本公开提供了内隐静脉中的瓣膜是经再细胞化的。内隐静脉(以前命名为Giacomin静脉)连接小和大隐静脉。

本公开提供了在股浅静脉(一种深静脉)中瓣膜的再细胞化。股浅静脉(一种深静脉)(也被称为股静脉)，连接腘静脉至股总静脉。本公开提供了小腿深静脉(前、后胫和腓静脉)的瓣膜是经再细胞化的。

本公开提供了一种静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其通过引入内皮细胞和/或平滑肌细胞，和/或内皮和/或平滑肌细胞祖细胞的群至经脱细胞化的静脉的管腔中。细胞和/或祖细胞的群用经脱细胞化的静脉培养，从而在静脉中再细胞化瓣膜。本公开的经再细胞化的瓣膜恢复与正常健康的瓣膜相似的正常的闭合时间(即，能力)和耐受返流压力。

在瓣膜再细胞化的方法中，存在或衍生自外周静脉血或全血的细胞群用经脱细胞化的静脉培养。本公开提供的细胞群是同种异体的。本公开提供的细胞群是自体的。细胞群收集于或存在于外周静脉血或全血。本公开提供的外周静脉血或全血是来自同种异体供体。本公开提供的外周静脉血或全血是自体的。本公开提供的经脱细胞化的静脉是用同种异体外周静脉血或同种异体的全血培养。本公开提供的经脱细胞化的静脉是用同种异体的全血培养。本公开提供的经脱细胞化的静脉是用自体外周静脉血或自体全血培养。

本公开提供了经脱细胞化的静脉。用脱细胞化步骤重复不止一次(定义为“周期”)的方法脱细胞化静脉。本公开提供的静脉脱细胞化包括2至16个周期。本公开提供的静脉脱细胞化方法包括14个周期。

以包含2至16个脱细胞化周期的方法脱细胞化后的静脉，是无细胞核的(免疫组织化学检测中细胞核染色阴性)，具有减少的或无HLAI类抗原(免疫组织化学检测中减少或无HLAI抗原染色)，以及具有减少的或无HLAII类抗原(免疫组织化学检测中减少或无HLAII抗原染色)。与未脱细胞化的静脉相比，在2-16个脱细胞化周期后，静脉的特征在于含有的胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖(GAG)降低，以及弹性蛋白提高。与未脱细胞化的静脉相比，脱细胞化降低了经脱细胞化的静脉的DNA。

本公开提供了在脱细胞化静脉中瓣膜再细胞化，其中该经再细胞化的瓣膜具有细胞核且是CD31阳性的。具有经再细胞化的瓣膜的静脉的静脉外膜具有梭形平滑肌细胞，以及内皮标志物vWF为阳性的。

本公开提供了通过获得功能性的瓣膜的方法，在经脱细胞化的静脉中再细胞化瓣膜。该功能性瓣膜具有正常的闭合时间(即，能力)和耐受正常水平的返流压力。

本公开提供了经再细胞化的瓣膜，在接枝至有需要的受试者后，在行走中，在毛细血管静脉端恢复12mm至18mm汞柱的压力。在未活动受试者中(例如，坐)，本公开的经细胞化的瓣膜达到约100mm汞柱的下肢静脉压力(取决于高度)。本公开提供的经再细胞化的瓣膜在有需要的受试者中接枝后，恢复正常的静液和重力压力，其以在心房下以厘米计的垂直距离的常量乘运算(0.77mm汞柱/cm)表示。接枝后，在直立(坐或站立)但静止时的有需要的受试者中，经再细胞化的瓣膜恢复正常的最高水平压力。

本公开提供了经再细胞化的瓣膜，在体外流动回路中，达到大约100mm汞柱的正常返流压力水平。

本公开提供了瓣膜的再细胞化，用于在有能力的经再细胞化的静脉瓣的帮助下，通过下肢肌肉泵挤压血液，完成从依赖下肢静脉的至心脏的血液静脉回流。本公开的经再细胞化的瓣膜发挥功能以使血液静液柱分割成段，且防止静脉倒流。本公开提供经再细胞化的瓣膜，用于在膝下段恢复更多数量的瓣膜。本公开提供经再细胞化的瓣膜用于通过矫正股或腘静脉功能不全，改善静液压力改变引起的症状。本公开提供经再细胞化的穿透静脉瓣防止深静脉至浅静脉流动，且恢复小腿泵的正常压力/流动关系。本公开提供经再细胞化的脚部穿透静脉中的瓣膜恢复通过静脉的血液的双向流动。

本公开进一步提供了在有需要的受试者中，治疗或改善慢性静脉功能不全(CVI)和/或腿部溃疡的症状的方法，其包括接枝经再细胞化的静脉的带瓣段至受试者。该再细胞化方法包括一个或多个步骤。该方法包括一个或多个步骤：获取人同种异体股静脉的带瓣段；脱细胞化股静脉中静脉2-16个周期；从受试者收集血液；用抗凝剂灌注经脱细胞化的静脉；用收集的血液灌注经脱细胞化的静脉数小时；排出血液并使用缓冲液冲洗静脉；以及首先用内皮细胞培养基灌注静脉一天以上；然后用平滑肌培养基灌注静脉一天以上；从而再细胞化经脱细胞化的瓣膜；其中再细胞化瓣膜接枝至受试者治疗或改善CVI和/或腿部溃疡。

本公开的瓣膜脱细胞化的步骤包括，在去垢剂和有机磷酸酯化合物中处理带瓣静脉。瓣膜在Triton和磷酸三丁酯和DNA酶中脱细胞化。

经脱细胞化的瓣膜的再细胞化是通过以内皮细胞培养基灌注静脉2-6天，接着通过以平滑肌培养基灌注静脉2-6天。在一个方面，经脱细胞化的静脉的培养是在体外的。

经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。经再细胞化的瓣膜具有在第一峰高于0.8N的力学性能。

本公开提供了使用经再细胞化的带瓣静脉治疗由深静脉返流和/或静脉高压引起的复发性下肢肿瘤的方法。本公开提供了经再细胞化的带瓣静脉在治疗由深静脉返流和/或静脉高压引起的复发性下肢肿瘤的用途。

本公开特征在于通过本文中所述的任一方法生产的瓣膜，其中经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。该经再细胞化的瓣膜还可以是平滑肌肌动蛋白阳性的、vWF阳性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌细胞。经再细胞化的瓣膜具有在第一峰高于0.8N的力学性能。

本公开的特征还在于本文中所述的任一方法生产的瓣膜用于植入或接枝的用途，其中经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。该再细胞化瓣膜还可以是平滑肌肌动蛋白阳性的、vWF阳性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌细胞。经再细胞化的瓣膜具有在第一峰高于0.8N的力学性能。

本公开提供了瓣膜的再细胞化，其接枝入有需要的受试者，治疗和/或改善在大腿部功能不全的瓣膜的症状。在一个方面，治疗和/或改善症状是通过恢复肌肉泵和静脉瓣间正常的工作关系达到。下肢的肌肉泵包括脚部、小腿、和大腿的肌肉泵。这些中，小腿泵是最重要的，因其是最有效的、具有最大的容量、以及形成最高的压力(在肌肉收缩时200mm汞柱)。正常的肢体具有从1500至3000cc范围的小腿容量，100至150cc的静脉容量，且单次收缩挤压超过静脉容量的40％至60％。

在收缩时，腓肠肌和比目鱼肌推动血液至大容量的腘和股静脉。在随后的松弛时，本公开的经再细胞化的瓣膜防止倒流(返流)，形成负压力，且通过有能力的穿透静脉牵引血液从浅静脉至深静脉***。经再细胞化的瓣膜逐步降低静脉压，直到动脉流入等于静脉流出。本公开提供了当受试者停止运动时，具有经再细胞化的瓣膜的静脉缓慢地填充毛细血管床，导致缓慢回到静息静脉压。

尽管大腿静脉被肌肉包围，大腿肌肉收缩对静脉回流的贡献与小腿肌肉泵相比很小。由在行走中足底静脉丛的压缩引起的泵作用引发小腿泵。各种腿部泵与有能力的瓣膜功能共同作用将静脉血液从远端回流至近端肢体。本公开的经再细胞化的瓣膜用于恢复功能性的腿部泵以使静脉血液从远端回流至近端肢体。

脱细胞化的方法

获取一共12份来自尸体的样本，并且通过测量瓣膜闭合时间和对返流压力的耐受性测试其功能。死亡获取时间中位数为3天(2-6天)，以及死亡检测时间中位数为6天(5-7天)。在运输样本至瑞典前，在100mm汞柱的压力下，12例尸体样本中的8例登记为正常闭合时间(≤0.5秒)。两个静脉段没有显示正常闭合时间。此外，10个经运输的具有功能的样本中的两个在脱细胞化的开始前，瓣膜中已显示力学损伤，在再细胞化后仍然是功能不全的。静脉样本的直径中位数是9.8mm(7.5-14)以及在再细胞化后为9.8mm(8-14.2)。

本公开提供带瓣静脉中脱细胞化瓣膜的方法和材料。如本文所使用的“脱细胞化”是指从瓣膜除去细胞的过程。有效的脱细胞化取决于例如组织密度和组构、终产物期需的几何学和生物学性质以及靶向的临床应用等因素决定。保留ECM完整性和生物活性的瓣膜脱细胞化可由本领域技术人员例如，通过在处理期间选择特定试剂和技术优化。

用于脱细胞化的最有效试剂将取决于许多因素，包括细胞结构、密度、脂质含量和静脉厚度。应该理解尽管大多数细胞去除试剂和方法可改变ECM组成并导致一些程度的超微结构破坏，但优选将这些不良效果最小化。如本文中所描述，本领域技术人员可以容易地优化脱细胞方法，以使ECM骨架的破坏最小化。

一种或多种细胞破碎溶液可用于脱细胞化带瓣静脉。细胞破碎溶液通常包含至少一种去垢剂，例如SDS、PEG或TritonX。一种去垢剂为TritonX。细胞破碎溶液可包含水从而使该溶液与细胞渗透不相容。或者，细胞破碎溶液可包含缓冲液(例如，PBS)用于与细胞渗透相容。细胞破碎溶液还可包含酶例如，但不限于，一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶(纤连蛋白、胶原蛋白IV、和胶原蛋白I裂解蛋白酶)、一种或多种DNA酶或蛋白酶例如胰蛋白酶。在一些情况下，细胞破碎溶液另外地或者替代地可包含一种或多种酶的抑制剂(例如，蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶抑制剂)。

本公开提供的静脉可连续用两种或更多种不同的细胞破碎溶液处理。例如，第一种细胞破碎溶液包含1％TRITON(x100,Sigma,瑞典)，第二种细胞破碎溶液包含1％磷酸三丁酯(TNBP)28726.1,VWR,瑞典)，以及第三种细胞破碎溶液包含0.004mg/ml脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)(D7291,Sigma,瑞典)。连续处理可包括用处理程序中细胞破碎溶液的至少一种重复处理。在一些方面，静脉可通过包括一种或多种细胞破碎溶液以相同顺序连续处理的脱细胞化周期处理，直至达到期需的脱细胞化水平。本公开提供了脱细胞化周期数目为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少19或至少20个周期。期需的脱细胞化所需要的周期数目通过监测静脉中细胞核、HLAI类或II类抗原以及其它细胞存在指示的存在情况确定。静脉脱细胞化水平由经脱细胞化的静脉上存在的细胞核的缺失指示。

本公开提供的每种细胞破碎溶液可进一步包含额外的组分，例如抗生素(即，青霉素、链霉素和两性霉素)、乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐脱水物(EDTA)和/或苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)。例如，包含DNA酶I的细胞破碎溶液可还包含氯化钙和氯化镁(A12858,LifeTechnologies)以活化该酶。

灌注方法可用于使用细胞破碎溶液处理带瓣静脉用于静脉脱细胞化。交替灌注方向(例如，顺行的和倒退的)可有助于有效地脱细胞化带瓣静脉。如本文所述的脱细胞化基本上从内至外的去除内衬于带瓣静脉的细胞，导致对ECM造成极小的损伤。根据组织的大小和重量以及细胞破碎溶液中的特定去垢剂和去垢剂浓度，带瓣静脉通常用细胞破碎介质灌注每克组织约2至约12小时。包括洗涤在内，灌注器官每克组织长达约12至约72小时。灌注通常被调节至生理学条件，包括脉动流、速率和压力。本文所述的灌注脱细胞化可与如，美国专利号6,753,181和6,376,244中所述的浸渍脱细胞化相比。

本发明提供了，带瓣静脉填充细胞破碎溶液并同时摇动以使静脉脱细胞化。按顺序次序添加不同的细胞破碎溶液，并重复该次序多次直至达到期需的脱细胞化水平。例如，静脉的一个末端保持开放，而将其余开口(即，磨损处和分支)缝合以防止渗漏。可首先在包含抗生素(0.5％青霉素、0.5％链霉素和0.5％两性霉素B)的PBS中漂洗静脉。然后可在蒸馏水中漂洗静脉72小时。每个脱细胞化周期优选由以下组成：用1％TritonX孵育3小时，接着1％TnBP3小时和0.004mg/mlDNA酶I3小时。最后，可用蒸馏水洗涤静脉过夜以除去细胞碎片。在每次孵育中，静脉可充填细胞破碎溶液并且可被夹紧闭合。然后在孵育时间(3小时或过夜)可将静脉放置在37℃振荡器上缓慢摇动。每次孵育结束时，可除去带瓣静脉内容物并用PBS漂洗静脉。7-9个(TRITONTnBP、DNA酶I和水洗)周期加搅拌后，静脉可用PBS连续洗涤48小时，其中PBS每6小时更换。可利用不同浓度的去垢剂(TRITON或TnBP)，按照需要或本领域普通技术人员的判定。可利用不同浓度的酶，例如DNA酶，按照需要或本领域普通技术人员的判定。

本公开提供了，在再细胞化步骤之前可对经脱细胞化的带瓣静脉灭菌。例如，灭菌方法包括将经脱细胞化的静脉在0.1％过乙酸的无菌PBS中孵育1小时，然后用无菌水和PBS洗涤，每种溶液4小时。

本公开提供了用合适的去垢剂处理带瓣静脉，例如，和一种溶剂/去垢剂(例如，2％磷酸三丁酯(TNBP))以及任选地用DNA酶处理以脱细胞化静脉。脱细胞化带瓣静脉通过去垢剂，例如，和一种溶剂/去垢剂(例如，2％磷酸三丁酯(TNBP))以及任选地用DNA酶处理2-16周期以再细胞化。本公开提供了在去垢剂和溶剂/去垢剂中处理带瓣静脉14个周期。带瓣静脉的脱细胞化的方法在脱细胞化后，不导致渗漏或静脉的大小改变。带瓣静脉的脱细胞化导致在14个周期后，静脉中失去细胞核(见图2C)。在脱细胞化的初期周期，静脉具有大量胶原蛋白但无细胞核(见图3A和B)。

本公开提供了一种带瓣静脉的脱细胞化的方法，通过该方法经脱细胞化的静脉的特征在于HLAI类或II类抗原是阴性的。本公开提供了一种脱细胞化方法，其导致细胞外基质(ECM)的胶原蛋白和GAG显著缺失，然而ECM中的弹性蛋白水平提高。本公开的经脱细胞化的瓣膜静脉导致与正常(即，未脱细胞化的)静脉相比，其胶原蛋白和GAG显著缺失，且弹性蛋白显著升高。本公开的脱细胞化的方案导致在经脱细胞化的静脉中DNA量显著降低(例如从正常静脉中组织的241.95±39.44ng/mg至经脱细胞化的静脉中的22.44±6.29ng/mg)。

为了有效地再细胞化和生成同种异体瓣膜，在脱细胞化期间和之后维持ECM的形态和构造(即，保持大体上完整)是重要的。如本文所使用的“形态”是指器官或组织或ECM的总体形状，而如本文所使用的“构造”是指外表面、内表面和其间的ECM。ECM的形态和构造可目测和/或组织学地检查以证实脱细胞过程没有损害ECM骨架的三维结构和生物活性。通过染色的组织学分析(即，H&E、MT或VVG)可用于使脱细胞化静脉的构造以及ECM组分例如胶原I、胶原IV、层粘连蛋白和纤连蛋白的保持可视化。本领域已知的其它方法和测定可用于测定ECM组分例如糖胺聚糖和胶原的保持。重要地，脱细胞化后残留血管形成或生长因子保持与ECM骨架相关。这样的血管形成或生长因子的实例包括，但不限于血管内皮生长因子A(VEGF-A)、FRF-2、胎盘生长因子(PLGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、纤维母细胞生长因子-1(FGF-1)、卵泡抑素、肝细胞生长因子(HGF)、血管生成素-2、内皮因子(Endoglin)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、内皮素-1、瘦素和其它本领域已知的血管形成或生长因子。

再细胞化的方法

本发明提供用于形成再生静脉中瓣膜的材料和方法。再生瓣膜可通过在静脉的管腔中如本文所述来自供体的经脱细胞化的静脉与细胞群接触，并在经脱细胞化的静脉的管腔中培养所述细胞群而产生。本公开提供了用全血或外周血培养经脱细胞化的静脉，其中静脉中的瓣膜也是经脱细胞化的。本公开提供经脱细胞化的静脉是用全血或外周血灌注的。全血或外周血是来自需要治疗或改善由损伤的或功能失调的瓣膜引起的疾病和/或失调的受试者。

如本文所使用的“再细胞化”是指这样的过程：引入或递送细胞至经脱细胞化的静脉，以及培养该细胞使得细胞增殖和/或分化以最终再生具有与正常带瓣静脉相似的构造、细胞组构和生物活性的瓣膜。

本公开包括使用少量(例如，10mL-30mL)的全血或外周静脉血的静脉中瓣膜的再细胞化的方法。在实施方案中，瓣膜是未在培养皿中体外培养、扩增、和分化的内皮细胞祖细胞和平滑肌祖细胞进行再细胞化的。在实施方案中，经脱细胞化的瓣膜可被再细胞化，其在用全血灌注后，通过以内皮细胞培养基灌注静脉2-6天之间，接着以平滑肌培养基灌注静脉数日，例如，2-6天。在实施方案中，经脱细胞化的静脉的培养可以是体外的或离体的。在实施方案中，经脱细胞化的静脉的培养可以在生物反应器中。

本公开提供了一种再细胞化的方法，其中收集外周静脉血并放置于涂布有抗凝剂的容器中(即，涂布肝素的真空采血管)，且尽快转移至实验室(例如，在约2小时内)。所需要的血液的量可根据静脉和实施再细胞化的生物反应器中所使用的管道的长度而变化。

使用供给5％CO₂的约37℃的孵育箱中实施灌注以实施再细胞化方法。在再细胞化前，用抗凝剂(例如，肝素)灌注静脉。在洗去肝素后，该静脉以期需的速度灌注数小时(例如，以约2ml/min48小时)。用内皮细胞培养基灌注持续约2天或更多天(例如，约4天)，接着用平滑肌细胞培养基持续另外约2天或更多天(例如，约4天)。实施灌注的天数是一个可选的特征，其可以依据细胞或全血以及细胞化效果而调节。

完全内皮培养基使用添加约10％热灭活人AB血清(Lifetechnologies,瑞典)、约1％谷氨酰胺(Lonza,丹麦)、约1％青霉素-链霉素-两性霉素的MCDB131(Lifetechnologies,瑞典)基础培养基和包含抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、重组人VEGF、人成纤维细胞生长因子、人上皮生长因子、肝素和硫酸庆大霉素的EGM2singlequote试剂盒(Lonza,丹麦)制备。完全平滑肌培养基使用约500ml添加约10％热灭活人AB血清、约1％青霉素-链霉素-两性霉素的培养基231(Lifetechnologies,瑞典)以及约20ml平滑肌生长补充剂(SMGS)(LifeTechnologies，瑞典)制备。也可使用现有技术已知的其他用于内皮细胞和/或平滑肌细胞生长的培养基。再细胞化静脉支架共约10天。

本公开提供了用于再细胞化的细胞群源自干细胞或祖细胞，例如衍生自骨髓的干细胞或祖细胞，或表达CD133的细胞(CD133+细胞)。通过现有技术已知的方法，干细胞或祖细胞可体外扩增并分化为内皮细胞和/或平滑肌细胞。例如，干或祖细胞可以在特定生长因子和补充剂的存在中培养以启动分化为内皮细胞和/或平滑肌细胞。在一些方面，经分化的细胞可能不是最终分化的，但在引入经脱细胞化的静脉之前，至少表达一种内皮细胞标志(即，CD31或vWF)或者至少一种平滑肌细胞标志(即，平滑肌肌动蛋白)。如本文所述衍生自干细胞或祖细胞的内皮细胞和平滑肌细胞例如，通过灌注引入至经脱细胞化的静脉中。内皮细胞和平滑肌细胞的培养包括用内皮细胞培养基或平滑肌培养基以交替的周期孵育细胞和静脉，直至期需的再细胞化完成。

出生后血管发生为在成年人中由循环内皮祖细胞(EPC)形成新血管；血管形成为从预先存在的内皮细胞形成新血管(RibattiD等，2001)。这两个过程促成静脉分支的形成和致病状态如伤口愈合、缺血、骨折愈合、肿瘤生长等(Laschke等，2011)。在全血循环中存在内皮细胞和内皮祖细胞的共存，且内皮祖细胞有助于血管形成(AsaharaT等，1997)。此外，平滑肌细胞祖细胞也存在于全血循环中(SimperD等，2002)。

本公开提供了用于再细胞化的细胞群来自全血。使用全血用于经脱细胞化的静脉的再生，将导致静脉的有效再细胞化，而不需要从骨髓或全血分离和扩增生成血管的祖细胞的亚群。全血引入至经脱细胞化的静脉，例如，通过灌注。

本公开对比现行选择血管接枝具有很多优势。本公开提供的自体经工程改造的静脉具有以下优势：1)是无免疫原性的且因此具有最小化的接枝排斥或不良免疫反应；2)排除免疫抑制的需要，且因此降低患者术后和终身风险；3)无长度限制；4)与匹配供体静脉或自体静脉相比，更容易获得；5)由天然组分组成(即，ECM、内皮细胞和平滑肌细胞)，且因此与多数合成或人工静脉相比具有更好的品质，包括保留了剩余血管生成生长因子和生物学功能完整性；6)与获取自体静脉用于移植相比，静脉的生产更为微创；7)全血细胞的使用允许对受试者快速和微创手术。

如本文所使用的细胞群可为用于使经脱细胞化的带瓣静脉再细胞化的任何细胞。这些细胞可为全能细胞、多潜能细胞(pluripotentcells)或多能细胞(multipotentcells)，并且可为非定向的(uncommitted)或定向的(committed)。另外，用于本公开的细胞可为未分化细胞、部分分化细胞或完全分化细胞。用于本公开的细胞还包括祖细胞、前体细胞和“成体”-衍生的干细胞。可用于使静脉再细胞化的细胞的实例包括，但不限于，骨髓-衍生的干细胞或祖细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞(MSC)、多能成体祖细胞、全血衍生的干细胞或祖细胞例如内皮干细胞、内皮祖细胞、平滑肌祖细胞、全血、外周血以及可从全血分离的任何细胞群。祖细胞定义为定向分化为一种类型细胞的细胞。例如，内皮祖细胞意思是程序化的分化为内皮细胞的细胞；平滑肌祖细胞意思是程序化的分化为平滑肌细胞的细胞。本公开提供全血或外周血中的祖细胞，其包括无定向的和/或定向的细胞，如多潜能细胞或全能细胞，用于细胞化经脱细胞化的带瓣静脉。本公开的特征是用全血细胞化经脱细胞化的带瓣静脉。

本公开提供了用于使静脉再细胞化的细胞群为同种异体的。如本文所使用的“同种异体的”是指获自与器官或组织来源相同的物种的细胞(即，自身或有关或无关个体)。本公开提供了细胞或全血是来自受体或有治疗需要的受试者(即，自体)。

所述细胞群可为异质细胞群。例如，细胞可为全血细胞，或来自全血。这些细胞包括红血细胞、白血细胞、血小板、内皮细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞。本领域已知，循环内皮细胞、内皮祖细胞和平滑肌细胞祖细胞可有助于血管发生和血管形成。因此，应用全血细胞可容易地为经脱细胞化的静脉提供能够扩增和分化为用于再生静脉的内皮细胞和平滑肌细胞的细胞。

用于再细胞化的细胞群可从异质细胞群分离。本公开提供了细胞群可为从骨髓分离的干细胞或祖细胞。本公开提供了细胞群可为从全血分离的内皮细胞或内皮祖细胞(即，定向细胞)。用于从异质群分离特定细胞群的方法为本领域所已知。这样的方法包括淋巴陷阱(lymphotrap)、密度梯度、差速离心、亲和层析和FACS流式细胞术。可使用本领域已知的鉴定特定目的细胞群的标志物从异质群分离细胞。例如，已知CD133在衍生自骨髓的干细胞或干细胞样细胞的表面上表达。CD133+细胞的选择可通过利用MAC珠和识别CD133的特异性抗体而实现。也可利用内皮祖细胞或平滑肌细胞祖细胞的特异性标志物纯化目的细胞群。

在一些方面，可体外培养所述细胞群，然后引入经脱细胞化的静脉。体外培养的目的包括扩大细胞数目和使细胞分化为特定的目的细胞谱系。本公开提供了可首先从异质群分离细胞群，然后体外培养。本公开提供细胞群可为骨髓-衍生的干细胞或祖细胞(即，CD133+细胞)并且可体外分化，然后引入经脱细胞化的静脉。现有技术已知多种分化方案，包括，例如，在补充诱导向内皮细胞或平滑肌细胞分化的因子、试剂、分子或化合物的生长培养基中生长细胞。

引入经脱细胞化的静脉以产生静脉的细胞数目可取决于静脉的大小(即，长度、直径或厚度)和用于再细胞化的细胞类型(即，干细胞对比更分化的细胞，例如全血)。关于那些细胞将达到的群密度，不同类型的细胞可具有不同的趋势。举例来说，经脱细胞化的器官或组织可用至少约1,000(例如，至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000)个细胞“接种”；或可具有约1,000个细胞/mg组织(湿重，即，脱细胞化前)至约10,000,000个细胞/mg组织(湿重)附着于其上。

细胞群可通过注射到一个或多个位置而引入(“接种”)经脱细胞化的静脉。另外，可将超过一种类型的细胞(即，内皮细胞或平滑肌细胞)引入经脱细胞化的静脉。例如，本公开提供的内皮细胞和平滑肌细胞可被引入经脱细胞化的静脉的管腔。或者，或除注射外，细胞群还可通过灌注而引入插套管的经脱细胞化的静脉。例如，细胞群可通过灌注而引入经脱细胞化的静脉。细胞灌注后，可通过静脉灌注扩增和/或分化培养基以诱导所接种细胞的生长和/或分化。本公开提供了可在引入细胞群前和/或同时给予抗凝剂，例如肝素。

扩增和分化培养基，如本公开中所使用的，包括包含内皮细胞或平滑肌细胞增殖以及分化为内皮细胞或平滑肌细胞所需的补充剂和因子的细胞生长培养基。本公开提供了内皮细胞的分化培养基可与内皮细胞的生长/增殖培养基相同。例如，内皮生长或分化培养基中存在的额外因子或补充剂可包括，但不限于：抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、重组人VEGF、人成纤维细胞生长因子、人上皮生长因子、肝素和硫酸庆大霉素。本公开提供了平滑肌细胞的分化培养基可与平滑肌细胞的生长/增殖培养基相同。例如，平滑肌细胞的生长或分化培养基中存在的额外因子或补充剂可包括，但不限于：平滑肌生长补充剂、平滑肌分化补充剂、MesenPro和转化生长因子β1。至少，生长和分化培养基包含基础培养基(即，MCDB131、M231或DMEM)、热灭活血清(例如，10％)、谷氨酰胺和抗生素(即，青霉素、链霉素、两性霉素)。

本公开提供了用内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基交替孵育或灌注接种的静脉直至达到期需的再细胞化。本公开提供了重复多次的内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的交替灌注，例如，至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次或至少15次。本公开提供了灌注内皮细胞培养基的持续时间可与灌注平滑肌细胞培养基的持续时间相同。或者，灌注内皮细胞培养基的持续时间可与灌注平滑肌细胞培养基的持续时间不同。灌注分化或生长培养基的持续时间可取决于接种在经脱细胞化的静脉上的细胞群的特征。灌注分化和生长培养基的时间可由本领域技术人员确定。

再细胞化期间，可将经脱细胞化的静脉维持在其中至少一些所接种细胞可在经脱细胞化的静脉中或在经脱细胞化的静脉上繁殖和/或分化的条件下。那些条件包括，而不限于，适当的温度和/或压力、电和/或力学活动、力、适量O₂和/或CO₂、适量湿度、以及无菌或近似无菌条件。再细胞化期间，可将经脱细胞化的静脉和附着在其上的细胞维持在合适的环境中。例如，细胞可需要营养补充剂(例如，营养物和/或碳源例如葡萄糖)、外源性激素或生长因子和/或特定的pH。

本公开还提供用于在适当条件下使静脉再细胞化的生物反应器，如本文中所述。特别地，所述生物反应器包括足够大以安装待再细胞化的静脉的并且可灭菌的完全密闭的腔室、用于提供细胞和/或培养基与泵送机构(即，蠕动泵)相连的导管、与静脉的一个末端相连的结构以及2个入口和2个出口。导管相对于静脉和泵的设置允许细胞或培养基流过静脉管腔，并围绕静脉外部流动或浸渍静脉外部。

在一些情况下，通过本文所述方法产生的静脉将被移植入患者内。在那些情况下，用于使经脱细胞化的静脉再细胞化的细胞可从该患者获得以使得再生细胞为患者“自体的”。来自患者的细胞可在不同生命阶段(例如，出生前、新生或产期、***期间，或作为成人)使用本领域已知的方法从，例如，血液、骨髓、组织或器官获得。或者，用于使经脱细胞化的器官或组织再细胞化的细胞可为与患者同基因的(即，来自同卵双生)，细胞可为来自，例如，患者亲属或与患者无关的HLA-匹配个体的人淋巴细胞抗原(HLA)-匹配的细胞，或细胞可为与患者同种异体的，来自，例如，非-HLA-匹配供体。

再细胞化期间可监测所接种细胞的进程。例如，再细胞化期间经脱细胞化的静脉或组织上或经脱细胞化的静脉或组织中的细胞数目可通过在一个或多个时间点取活组织标本估计。另外，可通过测定各种标志物是否存在于细胞或细胞群中而监测细胞所经历的分化量。与不同细胞类型和那些细胞类型的不同分化阶段有关的标志物为本领域所已知，并且可使用抗体和标准免疫测定、免疫荧光、免疫组织化学或组织学技术容易地检测。例如，为了证实内皮细胞或分化为内皮谱系的细胞的存在，可测定本领域已知的任何内皮标志物。内皮标志物包括，但不限于CD31、vWR、上皮型钙粘附分子抗体(VE-cadherin)和乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)。例如，为了证实平滑肌细胞或分化为平滑肌细胞谱系的细胞的存在，可测定本领域已知的任何平滑肌细胞标志物。平滑肌细胞标志物包括，但不限于平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。

本公开提供可测试经工程改造的静脉的拉伸强度。拉伸强度测试为现有技术已知。例如，可将经工程改造的静脉横向切为环形段并通过径向变形测试。可计算用于完全断裂样品的总力和50％总力时的伸长以测定拉伸强度。本公开提供了经再细胞化的静脉显示了与经脱细胞化的静脉相比增加的拉伸强度。例如，本发明经工程改造的静脉可显示承受相对于经脱细胞化的静脉10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多的总力的能力。本公开的特征在于经再细胞化的静脉显示与正常静脉相似或大约相同的拉伸强度。

本公开提供了获取于尸体的人同种异体股静脉的带瓣段。该段为使用脱细胞化和再细胞化技术经组织工程改造的。该脱-和再细胞化静脉(DV/RV)段的特征是生物化学地、免疫组织化学地和生物力学地。在体外模型中测量了瓣膜闭合时间(在100mm汞柱)和返流压力抵抗。DV的DNA定量证实令人满意地去除了细胞组分。得到的DV保留一些细胞外基质蛋白和力学完整性。即使脱-和再细胞化，瓣膜力学参数与天然的组织相似。在生物反应器中包含瓣膜的管腔支架用内皮和平滑肌细胞成功地再接种。

经再细胞化的瓣膜的特征

本公开的脱细胞化方案成功地保留了瓣膜的功能性质。经组织工程改造的含瓣膜的静脉对于未来临床前研究和最终临床应用提供了有效的模板。本公开提供了经再细胞化的功能性瓣膜，在接枝该经再细胞化的瓣膜至受试者后其可如正常的或接近正常的瓣膜发挥功能。本文所公开的方法可以置换患病的功能不全的深静脉从而治疗静脉返流。如本文所述，经脱-和再细胞化的带瓣静脉(DV/RV)段的特征是生物化学地、免疫组织化学地、和生物力学地，以证实经再细胞化的带瓣静脉成功用于临床应用的功能能力。

经再细胞化的瓣膜的特征在于存在内皮和平滑肌细胞。使用普通技术人员熟知的免疫组织化学和免疫荧光技术检测内皮和平滑肌细胞的存在或不存在。为可视化内皮细胞的存在，选择针对CD31的抗体(1:200)(Abcam，德国)和vWF的抗体(1:100)(SantaCruz，德国)，并用于经再细胞化的瓣膜的染色。通过免疫组织化学和免疫荧光检测经再细胞化的静脉中CD31和/或vWF阳性细胞的存在(见图4D、4E、5A和5B)。为可视化平滑肌细胞，使用针对平滑肌肌动蛋白的抗体(1:50)(Abcam，德国)染色经再细胞化的瓣膜。通过免疫组织化学分析测定平滑肌肌动蛋白阳性细胞的存在(见图4F)。还可通过免疫组织化学和免疫荧光分析鉴定平滑肌细胞，衬于经再细胞化的带瓣静脉的细胞形态中存在梭形肌肉细胞。

经再细胞化的瓣膜和静脉的特征还在于细胞核的存在。经再细胞化的带瓣静脉通过DAPI染色，并且通过免疫荧光可视化染色以检测细胞核的存在(见图11D)。免疫组织化学染色，如苏木精和伊红(HE)染色或马松三色(MT)染色经再细胞化的瓣膜和静脉也适用于细胞核检测(见如4A、4B和4C)。

现有技术中已知用于测试瓣膜功能的多种方法。通过用溶液(即，生理缓冲溶液，如磷酸盐缓冲溶液(PBS))冲洗静脉测试经再细胞化的带瓣静脉和经再细胞化的静脉的渗漏。例如，填充有溶液的注射器***经再细胞化的静脉或瓣膜的一端。该溶液冲洗瓣膜或静脉，优选是以稳定的速率，并且观察瓣膜或静脉的表面任何由于经再细胞化的瓣膜或静脉中的渗漏或穿孔导致的溶液的积累。本公开的优选特征在于，测试时证明经再细胞化的带瓣静脉无渗漏。

本公开进一步提供了可通过体外测试评估经再细胞化的带瓣静脉的功能，即，通过模拟生理流动和泵送作用的液压流动***(生物反应器)。本研究所使用的用于评估经再细胞化的瓣膜功能(即能力和返流压力耐受)的体外测试装置是对GeselschapJH、vanZuidenJM、ToonderIM、和Wittens、CHA.Invitroevaluationofanewautologousvalve-stentfordeepvenousincompetence,JOURNALOFENDOVASCULARTHERAPY:ANOFFICIALJOURNALFOTHEINTERNATIONALSOCIETYOFENDOVASCULARSPECIALISTS.(2006),13:762-769所使用的装置的修改。该模型允许在确定的压力下评估静脉瓣功能。为模仿在压力下深静脉***中通过静脉的流动，使用商业化蠕动泵保持恒定顺行流动，或者在期需的压力水平下，对回路提供间歇性流动。超声造影剂SonovueTM的添加允许流动、瓣膜叶和瓣膜闭合的双成像，用于能力(即，正常瓣膜闭合时间)的确定。一个示例性的生物反应器装置在图1中阐释。

在脱细胞化和/或再细胞化前或后测试带瓣静脉。该静脉垂直安装在流动回路，并且用室温生理盐水灌注。静脉通过圆锥连接(conicconnects)连接至液体回路，两端使用缝合线保护。从蠕动泵流出时，使用机械阀调节通过回路的流动方向。使用超声多普勒(UltrasoundDoppler)技术检测在静脉瓣膜位置的潜在返流。

如本文所使用的瓣膜的能力是指瓣膜闭合时间，或从倒流至流动终止的时间。具备正常功能的瓣膜的瓣膜闭合时间等于或小于0.5秒。因此，本公开的优选的特征在于，本公开经再细胞化的瓣膜具有等于或小于0.5秒的瓣膜闭合时间(或能力)。

如本文所使用的静脉返流，是指相对血液流向心脏的方向，血液的相反流动。具有正常功能的瓣膜可承受或耐受约100mm汞柱的返流压力，且在行走7至12步时，减少至平均约18mm汞柱至约25mm汞柱。换言之，具有正常功能的瓣膜保持闭合，从而对高达100mm汞柱的压力防止返流，且在行走7至12步时，减少至平均约18mm汞柱至约25mm汞柱。经再细胞化的瓣膜可证明为具有承受正常瓣膜所耐受的返流压力(即，100mm汞柱)的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。

可进一步使用多种检测以测试瓣膜的生物力学性能来测试经再细胞化的瓣膜如正常瓣膜发挥功能的能力。英斯特朗(instron)机器或其他用于测试拉伸强度或剪切应力的机器适用于测量经再细胞化的瓣膜的力学性能。

本公开提供了通过在水平方向上撕裂瓣膜评估静脉瓣的力学性能。任选地，使用缝合线帮助促进通过机器的评估。特别地，由聚丙烯制备的4-0不可吸收的单丝缝合线系于测试瓣膜，以帮助加载于英斯特朗机器(见图9)。使用预先设定的预负载作为测试起始点，如0.1N。使用20mm/分钟的测试速度以水平地撕裂测试瓣膜。测试瓣膜随着时间被延伸(力学地)，且以延伸长度(即，mm)的函数测量力。测试静脉至第一撕裂所承受的力被指定为第一峰。具有正常功能的正常瓣膜在第一峰可承受约0.8N力。

使用本文所述的方法脱细胞化和再细胞化含瓣膜的静脉，并测试它与正常静脉相比较的生物力学性能。瓣膜的力学分析显示4/6经再细胞化的带瓣静脉和测试的正常带瓣静脉的1/4是具有功能的(见图6)。每一静脉中存在一对瓣膜，且测量每一对瓣膜的在第一峰的力。分析在第一峰的力发现功能性的静脉和那些功能不全的差异。基于所得结果，即使一对瓣膜中的一个有障碍，也足以影响静脉的功能。优选地，通过本文公开的方法获得的经再细胞化的瓣膜可以承受正常瓣膜在第一峰所耐受的受力(即，0.8N.)的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。或者，经再细胞化的瓣膜承受在第一峰高于0.8N的受力。

如本文所述，外周全血的灌注导致在经再细胞化的带瓣静脉的培养基中明显的单层内皮细胞的形成和平滑肌细胞的出现。如使用体外能力和返流压力测试模型和生物力学撕裂测试所确定，在经再细胞化的静脉瓣膜中保留功能和强度。使用简单外周血样本以再细胞化静脉段，相对于如从骨髓或外周血分离和扩增成熟细胞/干细胞的更繁琐的方法具有明显的优势。这些结果通过成功的使用自体外周全血经组织工程改造的静脉移植至两名小儿患者而进一步证明。

治疗或使用的方法

含经组织工程改造的瓣膜的静脉段可以作为指定患者的治疗选择，这些患者以导致复发性腿部溃疡的深静脉返流和静脉高压为主要病理生理特征。本公开包括治疗和/或减轻静脉失调的方法，例如，深静脉血栓(DVT)，慢性静脉功能不全(CVI)(也被称为静脉炎后综合症)，和/或静脉曲张，其通过引入或接枝本公开的经再细胞化的瓣膜和再细胞化的带瓣静脉至有需要的受试者。

本公开提供了用于脱细胞化和再细胞化供体带瓣静脉的方法，用于慢性静脉功能不全和腿部溃疡的治疗。通过本文所述的方法生产的经再细胞化的瓣膜可被植入、移植或接枝至患有或具有患CVI和/或静脉腿部溃疡风险的患者。

本公开进一步提供了在有需要的受试者中治疗或改善慢性静脉功能不全(CVI)和/或腿部溃疡的症状的方法，其包括接枝经再细胞化的静脉带瓣段至受试者。该再细胞化的方法包括一个或多个步骤。被治疗、改善或减轻的症状可包括：腿部钝痛、沉重、或抽筋，瘙痒和刺痛，站时疼痛增加，腿抬起时疼痛缓解，腿部肿胀，腿部和脚踝发红，脚踝周围肤色变化，表面(浅表的)静脉曲张，腿部和脚踝的皮肤增厚和硬化(脂性硬皮病)，腿部和脚踝的溃疡，以及腿部或脚踝伤口愈合缓慢。

该方法包括获取人股静脉的带瓣段；脱细胞化股静脉中静脉2-16个周期；从受试者收集血液；用抗凝剂灌注经脱细胞化的静脉；用收集的血液灌注经脱细胞化的静脉数小时；排出血液并使用缓冲液冲洗静脉；以及首先用内皮细胞培养基灌注静脉一天以上；然后用平滑肌培养基灌注静脉一天以上；从而再细胞化经脱细胞化的瓣膜；其中经再细胞化的瓣膜接枝至受试者时治疗或改善CVI和/或腿部溃疡。

本公开包括用经再细胞化的带瓣静脉治疗由深静脉返流和/或静脉高压引起的复发性下肢肿瘤的方法。本公开包括经再细胞化的带瓣静脉在治疗由深静脉返流和/或静脉高压引起的复发性下肢肿瘤的用途。

本公开包括瓣膜的再细胞化，其接枝入有需要的受试者，治疗和/或改善受试者大腿部功能不全的瓣膜的症状。在实施方案中，症状的治疗和/或改善可通过恢复肌肉泵和静脉瓣膜间正常的工作关系达到。下肢的肌肉泵包括脚部、小腿、和大腿的那些肌肉泵。正常的小腿泵具有最大的容量，以及形成最高的压力(在肌肉收缩时200mm汞柱)。正常的肢体具有从1500至3000cc范围的小腿容量，100至150cc的静脉容量，且单次收缩挤压超过静脉容量的40％至60％。

在收缩时，腓肠肌和比目鱼肌推动血液至大容量的腘和股静脉。在随后的松弛时，本公开的经再细胞化的瓣膜防止倒流(返流)，形成负压力，且通过有能力的穿透静脉牵引血液从浅静脉至深静脉***。经再细胞化的瓣膜逐步降低静脉压，直到动脉流入等于静脉流出。本公开包括当受试者停止运动时，具有经再细胞化的瓣膜的静脉缓慢地填充毛细血管床，导致缓慢回到静息静脉压。

尽管大腿静脉被肌肉包围，大腿肌肉收缩对静脉回流的贡献与小腿肌肉泵相比很小。由在行走中足底静脉丛的压缩引起的泵作用引发小腿泵。各种腿部泵与有能力的瓣膜功能共同作用将静脉血液从远端回流至近端肢体。本公开的经再细胞化的瓣膜用于恢复功能性的腿部泵以使静脉血液从远端回流至近端肢体。

本公开包括用于脱细胞化和再细胞化供体带瓣静脉的方法，用于慢性静脉功能不全和/或腿部溃疡的治疗。通过本文所述的方法生产的经再细胞化的瓣膜可被植入、移植或接枝至患有或具有患CVI和/或静脉腿部溃疡风险的患者。

慢性静脉功能不全定义了由动态静脉高压导致的静脉疾病的那些临床表现，定义为通过运动降低静脉压力的功能障碍。在正常情况下，下肢的静脉瓣膜和肌肉泵限制了下肢静脉中血液的积累。外流阻塞、肌肉筋膜无力、关节运动损失或瓣膜功能障碍导致的下肢肌肉泵功能障碍与外周静脉功能不全相关。

静脉溃疡是由静脉瓣膜的不适当功能引起的损伤，通常为腿部(即，静脉腿部溃疡)。当瓣膜功能降低和血液回流导致静脉中血液聚集以及静脉和毛细血管中提高压力时，静脉溃疡出现。其导致其他相关并发症，如水肿、炎症、组织硬化、皮肤营养不良、以及静脉湿疹。静脉溃疡是大的、浅表的、由于血细胞中含铁色素进入组织而导致变色的，以及可具有分泌物(discharge)。溃疡最常见于脚踝的中或后部周围。

本公开提供了静脉中经再细胞化的瓣膜的用途，其用于静脉疾病或失调的治疗或改善症状。例如，本公开提供了经再细胞化的带瓣膜静脉在治疗或改善慢性静脉功能不全或腿部溃疡的方法中的用途。本公开的静脉中经再细胞化的瓣膜恢复正常的下肢静脉压。例如，行走中7至12步，下肢静脉压从接近100mm汞柱(取决于高度)至平均18mm汞柱至约25mm汞柱。在踝关节跖屈站立或脚跟提起，转移重量至前脚(踮脚尖动作)观察到相似的压力变化。可使用21-号针(21-gaugeneedle)测量10趾尖运动的反应确定动态静脉压(AVP)，在脚背静脉中，通常以每秒1的速率。当恢复持续(stating)站立姿势，在平均31秒后静液压力恢复。溃疡的发病率与AVP提高到30mm汞柱以上具有线性关系。提高的AVP还与90％静脉再充盈的时间少于20秒相关。与AVP相反，使用体积描记法(plethysmography)可无创的测量容积变化。快速返流(即，大于7ml/秒的静脉充盈)和小腿泵功能障碍与溃疡的高发病率相关。静脉中接枝经再细胞化的瓣膜恢复正常AVP、正常快速返流和/或正常小腿泵功能障碍。优选地，静脉中接枝经再细胞化的瓣膜恢复约100mm汞柱的返流压力的正常耐受，以及在行走7至12步时，降低至平均约18mm汞柱至25mm汞柱。

以下实施例是说明性的，但不限制本公开的方法和组合物。本公开的其他特征和优势从不同的实施例中是显而易见的。提供的实施例证明不同组分和方法在实施本公开中是有效的。这些实施例不限制权利要求主题。基于本公开，本领域技术人员可确定和采用其他有用的组分和方法实施本发明。

实施例

带瓣静脉的获取

静脉段包括股总静脉、股深静脉和股静脉，通过使用血管外科手术技术获取于成人尸体，且小心的切断所有侧枝。鉴定瓣膜，且在瓣膜的每一端带有3-4cm边缘切下12段。静脉段在含0.5％青霉素、0.5％链霉素、0.5％两性霉素B的磷酸盐缓冲液(PBS)中彻底冲洗，并储藏在4℃。样本在一周内于冰上运输至实验室。

脱细胞化和特征

使用1％Triton、1％磷酸三丁酯(TNBP)和4mg/L脱氧核糖核酸酶(DNAse)实施脱细胞化。评估经脱细胞化的静脉段的剩余DNA含量，使用用于细胞结构和定量多种ECM蛋白的标准化程序用苏木精和伊红(HE)和马松三色(MT)染色。通过标准化程序实施用于HLAI类和II类抗原的检测的免疫组织化学。

DNA定量

通过使用商业化提供试剂盒从正常的和DC静脉提取DNA。在脱细胞化前和后，从不同静脉收集20毫克的7个正常的和9个经脱细胞化的静脉样本，且根据试剂盒(69506,Qiagen,瑞典)中包含的Blood&TissueHandbook实施DNA提取。提取的DNA在260nm波长，使用nanodrop.(ND-1000,SaveenWerner,美国)定量。

ECM染色和定量

简略地，为证明胶原蛋白和***，***固定的静脉组织切片在室温下于布安氏(Bouin’s)固定液再固定过夜，随后使用马松三色染色试剂盒(产品编号25088-1,PolysciencesInc.,美国)。在染色程序中所使用的染料染色胶原纤维蓝色，细胞核黑色，细胞质和肌肉纤维红色。

酸-/胃蛋白酶-可溶胶原蛋白定量

使用Sircol可溶胶原蛋白检测试剂盒(Biocolor)测量在经脱细胞化的ECM中酸-/胃蛋白酶-可溶胶原蛋白的含量。为提取酸-/胃蛋白酶-可溶胶原蛋白，用含1％(w/v)胃蛋白酶(P7012；Sigma)的0.5M乙酸在4℃消化ECM样本48小时。用1mlSircol染料试剂室温孵育可溶胶原蛋白30分钟。胶原蛋白-染料混合物在10,000g离心10分钟沉淀，且去除上清液。沉淀物(pellet)溶解于1mL碱性试剂，且使用酶标仪(PowerWaveXS,Bio-TekInstruments)在96孔板中在555nm检测相对吸光度。

硫酸化GAG定量

使用Blyscan硫酸化GAG检测试剂盒(Biocolor)测量在经脱细胞化的ECM中硫酸化GAG含量。为提取硫酸化GAG，用含有125μg/mL木瓜蛋白酶(Sigma)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8)、10mM半胱氨酸盐酸盐(Sigma)和2mMEDTA(Sigma)在65℃消化ECM4-6小时(直到组织完全溶解)。悬液以10,000g离心10分钟。提取的硫酸化GAG(100ul)与1mlBislycan染料试剂混合，并震荡30min。通过离心10分钟收集沉淀，然后用0.5ml分解试剂溶解。使用酶标仪在96-孔板中，在656nm测量吸光度。

可溶弹性蛋白定量

使用Fastin弹性蛋白检测试剂盒(Biocolor)测量在经脱细胞化的ECM中可溶弹性蛋白的含量。为提取可溶弹性蛋白，用0.25M乙二酸(Sigma)在100℃水解ECM4-5h(直到组织完全溶解)。不溶的残余物通过离心分离。收集上清液，并且以相同的条件额外提取沉淀物。提取的可溶弹性蛋白与1mLFastin染料混合并震荡90分钟。通过离心10分钟收集沉淀，然后溶解于250μL分解试剂。使用酶标仪在96-孔板中，在513nm测量吸光度。

无菌对照实验

通过收集1ml的经灌注的内皮和平滑肌培养基评估在再细胞化中无菌，在培养中每两天后收集并检测微生物污染物。约500μl收集的培养基添加到液体硫乙醇酸盐肉汤(Thioglycollatebroth)，并铺至大豆胰蛋白胨琼脂平板，并于37℃孵育14天。使用暴露于外界空气的培养基作为阳性对照，以及仅使用单独的培养基作为阴性对照。可视真菌、好氧和厌氧菌的生长，以及使用分光光度计测量在600nm的吸光度。记录吸光度的差异。

静脉的再细胞化

再细胞化当天，从健康供体(年龄范围25-35岁)收集20-25ml外周静脉血于无菌的涂布肝素的真空采血管，并尽快转移至实验室(2小时内)。所需要的血量取决于静脉的长度和在生物反应器中的管道的长度。

完整的再细胞化过程在无菌的条件下进行，且所有灌注在提供5％CO₂的37℃培养箱中实施。再细胞化前，静脉用PBS中浓度50IU/ml的肝素(Leopharma,瑞典)灌注2h。排出肝素，立即以2ml/min的速度灌注全血48h。然后排出血液，用包含1％青霉素-链霉素-两性霉素的PBS洗涤静脉直至完全除去血液。随后用内皮培养基灌注静脉4天和用平滑肌培养基灌注4天。完全内皮培养基使用添加10％热灭活人AB血清(Lifetechnologies,瑞典)1％谷氨酰胺(Lonza,丹麦)、1％青霉素-链霉素-两性霉素的MCDB131(Lifetechnologies,瑞典)基础培养基和包含抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、重组人VEGF、人成纤维细胞生长因子、人上皮生长因子、肝素和硫酸庆大霉素的EGM2singlequote试剂盒(Lonza,丹麦)制备。完全平滑肌培养基使用500ml添加10％热灭活人AB血清、1％青霉素-链霉素-两性霉素的培养基231(Lifetechnologies,瑞典)以及20ml平滑肌生长补充剂(SMGS)(LifeTechnologies，瑞典)制备。再细胞化静脉支架共约10天(提交文稿)。

经再细胞化的静脉的特征

为可视化内皮细胞的存在，选择针对CD31抗体(1:200)(Abcam,德国)和vWF抗体(1:100)(SantaCruz,德国)并通过免疫组织化学和免疫荧光染色，同时通过免疫组织化学染色平滑肌肌动蛋白(1:50)(Abcam,德国)以可视化平滑肌细胞。

生物力学分析

在缝合线的帮助下，通过在水平方向上撕裂瓣膜，评估静脉瓣膜的力学性能，缝合线是使用聚丙烯制备的4-0不可吸收的单丝缝合线。用手术剪切开静脉，并且设置缝合线并系于英斯特朗5566(Instron,NorwoodUSA)的握柄(grip)(图S1)。预负载为0.1N，且使用的测试速度为20mm/分钟，其使得瓣膜水平地撕裂。拉伸测试器的准确度为力0.5％和伸长0.5％，其基于根据ISO7500-1:2004和ISO9513:1999实施定期校准。测量在第一峰的力并计算每一样本的平均力。总共测试6个经再细胞化的静脉(n＝12瓣膜)和4正常静脉(n＝8瓣膜)。

体外测试带瓣静脉功能

使用客户定制测试装置以评估再细胞化前和后静脉的功能性(图1)。该静脉垂直安装于体外流动回路中，并且用室温生理盐水灌注。静脉通过圆锥连接件(conicconnectors)连接至液体回路，两端使用缝合线保护。商业化蠕动泵(Baxter,Modelno.700044,HealthcareCorp.,美国)为回路提供间歇性流动，以模拟在行走和呼吸过程中发生的压力下于深静脉***中静脉流动。

在从泵流出时，使用机械阀调节通过回路的流动方向，且当相同的阀切换至开启位置，其将在静脉中向后流动直到瓣膜关闭。静脉中的返流压力通过瓣膜上液体柱的高度调节。使用超声多普勒技术检测在静脉瓣膜位置的潜在返流(9MHz线性探针，VividE9,GE)。为优化使用超声可视化，静脉段浸没在填有生理盐水的塑料容器中。在生理盐水溶液中使用造影剂(SonoVue,BraccoTM)以提高回声反射性，并且能够记录通过静脉瓣膜的流动和回路中流动的方向。使用从倒流至流动终止的时间作为瓣膜闭合时间的测量。另外，在返流压力100mm汞柱，测量在叶位置的静脉直径。

统计学

结果以中位数和范围展示。采用曼-惠特尼U(Mann-WhitneyU)检验比较脱细胞化和再细胞化对瓣膜的影响。配对双尾T(Pairedtwo-tailedstudentT)检验用于ECM和DNA的定量。P<0.05被认为是显著性差异。

Claims (26)

1.一种静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其包括引入包含内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞的血液至经脱细胞化的静脉的管腔，以及在经脱细胞化的静脉的管腔中培养细胞，从而再细胞化静脉中的瓣膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其中血液是外周静脉血或全血。

3.根据权利要求2所述的方法，其中外周静脉血或全血是通过注射或灌注引入至经脱细胞化的静脉。

4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括通过内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注培养细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注是交替的。

6.根据以上权利要求中的一项所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的，vWF阳性的，平滑肌肌动蛋白阳性的，且具有细胞核。

7.根据以上权利要求中的一项所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜具有在第一峰承受的力是或者高于0.8N的力学性能。

8.根据以上权利要求中的一项所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜具有等于或小于0.5秒的闭合时间。

9.一种在有需要的受试者中治疗慢性静脉功能不全(CVI)、深静脉血栓(DVT)、和/或腿部溃疡的方法，其包括引入经再细胞化的静脉的带瓣段至受试者，其中瓣膜是通过一种方法再细胞化的，该方法包括：

a)脱细胞化静脉的带瓣段，其中该静脉对受试者为同种异体的；

b)从受试者收集血液，其中该血液包含内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞；

c)用收集的血液灌注经脱细胞化的带瓣；

d)在经脱细胞化的带瓣静脉的管腔中培养细胞；从而再细胞化该经脱细胞化的静脉的瓣膜；以及

e)接枝经再细胞化的带瓣静脉至受试者；其中该接枝治疗受试者的CVI和/或腿部溃疡。

10.根据权利要求9所述的方法，其中腿部溃疡是复发性的且由于深静脉返流和/或静脉高压引起。

11.根据权利要求10所述的方法，其中血液是外周静脉血或全血。

12.根据权利要求11所述的方法，其中外周静脉血或全血是通过注射或灌注引入至经脱细胞化的静脉。

13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括通过内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注培养细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注是交替的。

15.根据权利要求9-14所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的，vWF阳性的，平滑肌肌动蛋白阳性的，且具有细胞核。

16.根据权利要求9-14所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜具有在第一峰承受的力是或者高于0.8N的力学性能。

17.根据权利要求9-14所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜具有等于或小于0.5秒的闭合时间。

18.一种带瓣静脉中瓣膜的再细胞化的方法，其中经再细胞化的瓣膜是功能性瓣膜，该方法包括：

a)从有再细胞化静脉中瓣膜需要的受试者获取静脉段；

b)脱细胞化带瓣静脉；

c)从受试者收集血液，其中该血液包含内皮细胞祖细胞和平滑肌细胞祖细胞；

d)用收集的血液灌注经脱细胞化的带瓣静脉；以及

e)在经脱细胞化的带瓣静脉中培养细胞；从而再细胞化该经脱细胞化的静脉中的瓣膜。

19.根据权利要求18所述的方法，其中再细胞化恢复经再细胞化的瓣膜的能力以及返流压力的耐受性。

20.根据权利要求18所述的方法，其中血液是外周静脉血或全血。

21.根据权利要求20所述的方法，其中外周静脉血或全血是通过注射或灌注引入至经脱细胞化的静脉。

22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括通过内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注培养细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注是交替的。

24.根据权利要求18-23所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的，vWF阳性的，平滑肌肌动蛋白阳性的，且具有细胞核。

25.根据权利要求18-24所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜具有在第一峰承受的力是或者高于0.8N的力学性能。

26.根据权利要求18-24所述的方法，其中经再细胞化的瓣膜具有等于或小于0.5秒的闭合时间。